孫 鵬, 高玉玲, 王金梅, 劉秀娟

(1. 黑龍江八一農(nóng)墾大學 測試中心, 大慶 163319; 2. 農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)加工品質量監(jiān)督檢驗測試中心, 大慶 163319; 3. 大慶石化公司質量檢驗中心, 大慶 163711)

手性流動相添加劑-超高效液相色譜法拆分頭孢噻吩對映體

孫 鵬1,2, 高玉玲1,2, 王金梅3, 劉秀娟3

(1. 黑龍江八一農(nóng)墾大學 測試中心, 大慶 163319; 2. 農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)加工品質量監(jiān)督檢驗測試中心, 大慶 163319; 3. 大慶石化公司質量檢驗中心, 大慶 163711)

在流動相中加入手性選擇劑羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD)實現(xiàn)了用超高效液相色譜法拆分頭孢噻吩對映體。所用色譜柱為Agilent Poroshell 120 SB-C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,2.7 μm);流動相為乙腈與pH 7.2的12.0 mmol·L-1羥丙基-β-環(huán)糊精溶液以體積比80∶20組成的混合液;流量為0.25 mL·min-1。在所選條件下頭孢噻吩的對映體獲得基線分離,連續(xù)測定6次的相對標準偏差不大于2.3%。

超高效液相色譜法; 頭孢噻吩; 對映體; 手性流動相添加劑

頭孢類抗生素被稱為先鋒菌素類,其化學結構為在頭孢菌素的母核上通過化學方法連接不同的側鏈基團而制得的半合成β-內酰胺類抗生素[1]。頭孢類抗菌藥物以其抗菌譜廣、殺菌活力強、耐酸、耐酶、療效高、毒副作用相對較小等優(yōu)點而廣泛應用于臨床[2-4],為人類戰(zhàn)勝各種細菌感染作出了極大貢獻。

頭孢噻吩為第二代頭孢菌素,可用于治療敏感菌所致的尿路感染、呼吸道感染、腹膜炎、敗血癥、心內膜炎、皮膚和軟組織感染等[5]。有關頭孢菌素類手性藥物對映體的分離方法有高效液相色譜法[6-7]、高效毛細管電泳法[8],但已報道的分離方法分離時間長,對分離條件要求苛刻。因此,研究一種快速分離頭孢類對映體的方法,為此類手性藥物臨床安全提供參考非常必要。本工作采用手性流動相添加劑-超高效液相色譜法拆分頭孢噻吩對映體,方法簡便、快速,而且對了解它們的藥理作用、藥效以及在臨床研究上都具有重要的理論和實際意義。

1 試驗部分

1．1 儀器與試劑

Agilent 1290型超高效液相色譜儀,配G4226A型自動進樣器、G4212A型二極管陣列檢測器(DAD)、G4220A型二元泵、1290保護柱、C.01.05版本Open LAB CDS軟件;SK 8200H型超聲波清洗機;VORTEX-2型渦旋儀;ML 204型電子分析天平;PE-20型pH計;0.22 μm微孔濾膜。

頭孢噻吩溶液:2 g·L-1,稱取頭孢噻吩(純度為95%以上) 0.2 g,用流動相定容至100 mL。

羥丙基-β-環(huán)糊精溶液(水相):12.0 mmol·L-1,稱取羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD) 2.83 g,用水定容至100 mL,用0.01 mol·L-1氫氧化鈉溶液調節(jié)pH為7.2,過0.22 μm水相微孔濾膜。

有機相:乙腈過0.22 μm有機相微孔濾膜,備用。

甲醇、乙腈均為色譜純,氫氧化鈉為優(yōu)級純,試驗用水為蒸餾水。

1．2 色譜條件

Agilent Poroshell 120 SB-C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,2.7 μm),柱溫為室溫;流動相為乙腈與pH 7.2的12.0 mmol·L-1HP-β-CD溶液以體積比80∶20組成的混合液,流量0.25 mL·min-1;進量樣10 μL;紫外檢測波長230 nm。

1．3 試驗方法

按色譜條件對頭孢噻吩溶液進行分離。

2 結果與討論

2．1 色譜行為

頭孢噻吩對映體分離色譜圖見圖1。

圖1 頭孢噻吩對映體分離色譜圖Fig. 1 Separation chromatogram of cephalothin enantiomers

2．2 色譜柱的選擇

試驗考察了Agilent Poroshell 120 SB-C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,2.7 μm)和Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱(2.1 mm×150 mm,1.8 μm)對分離的影響。結果發(fā)現(xiàn):XDB-C18色譜柱對頭孢噻吩對映體無法達到基線分離,SB-C18色譜柱為未封端柱,XDB-C18色譜柱為封端柱,這是因為SB-C18色譜柱中裸露的硅羥基增加了對頭孢噻吩對映體的手性識別作用,實現(xiàn)了更好的分離。試驗選用Agilent Poroshell 120 SB-C18色譜柱(2.1 mm×100 mm,2.7 μm)。

2．3 手性選擇劑種類及濃度的選擇

試驗分別考察了β-環(huán)糊精(β-CD)及HP-β-CD對分離效果的影響。結果發(fā)現(xiàn):β-CD對頭孢噻吩對映體有手性識別,但不能達到基線分離,HP-β-CD能使頭孢噻吩對映體得到很好的分離。這是因為HP-β-CD與頭孢噻吩對映體形成新的氫鍵,增強了HP-β-CD與頭孢噻吩對映體之間的作用,進而增加了HP-β-CD與頭孢噻吩對映體的手形識別能力。試驗選擇HP-β-CD為手性選擇劑。

試驗考察了HP-β-CD的濃度為6～18 mmol·L-1時對分離的影響,結果見圖2。

圖2 HP-β-CD濃度對分離度的影響Fig. 2 Effect of HP-β-CD concentration on resolution

由圖2可知:隨HP-β-CD濃度的增大,頭孢噻吩對映體的分離度逐漸增加,當HP-β-CD的濃度為12.0 mmol·L-1時,頭孢噻吩對映體的分離度最大。試驗選擇HP-β-CD的濃度為12.0 mmol·L-1。

2．4 流動相組成的選擇

流動相比例是影響對映體分離的又一重要因素。試驗考察了頭孢噻吩對映體分別在甲醇-HP-β-CD溶液體系和乙腈-HP-β-CD溶液體系對分離的影響。結果表明:在甲醇-HP-β-CD溶液體系中,改變流動相的比例,均不能得到很好的分離,故試驗選擇乙腈-HP-β-CD溶液體系為流動相。試驗還考察了乙腈和12.0 mmol·L-1HP-β-CD溶液的體積比不同時對分離的影響。結果表明:當乙腈和12.0 mmol·L-1HP-β-CD溶液的體積比為80∶20時,頭孢噻吩對映體獲得基線分離。試驗選擇乙腈和12.0 mmol·L-1HP-β-CD溶液的體積比為80∶20。

2．5 流量的選擇

試驗考察了流量對頭孢噻吩對映體分離的影響。結果表明:流量減慢延長了頭孢噻吩對映體與固定相相互作用的時間,可提高分子選擇能力,會適當?shù)卦龃蠓蛛x度,但流量減慢也會使峰展寬、保留時間延長。兼顧色譜峰形及分離度,試驗選擇流動相流量為0.25 mL·min-1。

2．6 水相酸度的選擇

水相酸度是影響對映體分離的又一重要因素。試驗分別考察了水相pH為3.0,7.0,10.0時色譜峰形及保留時間,兼顧色譜峰形及保留時間,試驗初步確定pH在7.0附近。試驗考察了水相pH在6.4～8.0內對分離的影響。結果表明:頭孢噻吩對映體在pH 7.2時,色譜峰形及保留時間均滿意。試驗選擇水相pH為7.2。

2．7 方法的重現(xiàn)性

按色譜條件分離頭孢噻吩對映體,連續(xù)進樣6次,頭孢噻吩對映體的保留時間和峰面積的相對標準偏差(RSD)依次為2.0%,2.3%,說明該方法的重現(xiàn)性良好。

本工作采用HP-β-CD為手性流動相添加劑結合超高效液相色譜法拆分頭孢噻吩對映體,操作簡單、靈敏度高,1 min內完成對映體的分離,且比手性固定相分離經(jīng)濟、快捷、安全,為頭孢類對映體的分離提供了有效的參考。

[1] 姚曄,鄧寧,余沐洋.膠束電動毛細管電泳法分離檢測5種β-內酰胺類抗生素[J].食品科學, 2011,32(16):253-256．

[2] 侯力慧.痰熱清注射液聯(lián)合頭孢菌素治療慢性支氣管炎的臨床療效觀察[J].中國醫(yī)藥科學, 2015,5(7):93-95．

[3] 項婕,朱長遠.硫酸依替米星與頭孢菌素聯(lián)合治療老年社區(qū)獲得性肺炎的療效評價[J].藥物與臨床, 2015,53(2):73-75．

[4] 鄭國良,周雁玲,藍海龍,等.頭孢菌素相關性尿路可逆性結石的CT表現(xiàn)[J].影響診斷與介入放射學, 2015,24(3):179-183．

[5] 韓鳳,楊明娜,丁寅子,等.2011-2013年北京市中關村醫(yī)院呼吸科頭孢菌素類抗菌藥物應用分析[J].中國醫(yī)院用藥評價與分析, 2015,15(1):77-80．

[6] 沈靜茹,王偉,余學紅.新型高效液相色譜流動相手性添加劑法拆分頭孢氨芐對映體[J].中南民族大學學報(自然科學版), 2013,32(2):5-8．

[7] 蘇立強,李沖,張曉紅,等.高效液相色譜流動相添加劑法拆分頭孢氨芐對映體[J].藥物分析雜志, 2008,28(6):921-923．

[8] 王榮,賈正平,徐麗婷,等.頭孢噻吩手性對映體高效毛細管電泳分離[J].分析化學, 2003,31(6):766-766．

UHPLC Separation of Cephalothin Enantiomers with Chiral Mobile Phase Additives

SUN Peng1,2, GAO Yu-ling1,2, WANG Jin-mei3, LIU Xiu-juan3

(1.TestingCentre,HeilongjiangBayiAgriculturalUniversity,Daqing163319,China;2.TestCenterofQualitySupervisionandInspectionofProcessedAgriculmralProductsinDepartmentofAgriculture,Daqing163319,China;
3.InspectionCenterofDaqingPetrochemicalCompany,Daqing163711,China)

Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HP-β-CD) was chosen as a chiral selector to be added to the mobile phase to achieve separation of enantiomers of cephalothin by UHPLC. Agilent Poroshell 120 SB-C18(2.1 mm×100 mm, 2.7 μm) chromatographic column was used as stationary phase. A mixture of acetonitrile and 12.0 mmol·L-1HP-β-CD solution (pH 7.2), mixed in the ratio of 80 to 20, was used as mobile phase with a flow rate of 0.25 mL·min-1. Under the chosen conditions, good baseline separation of the enantiomers of cephalothin was attained, and giving values of RSD′s obtained from 6 successive determinations no more than 2.3%.

UHPLC; Cephalothin; Enantiomer; Chiral mobile phase additives

10.11973/lhjy-hx201702010

2016-02-01

大慶市科技計劃指導項目(szdfy-2015-50);黑龍江 八一農(nóng)墾大學校內培育課題(XZR2014-17)

孫 鵬(1982-),男,黑龍江海林人,助理研究員,碩 士,主要從事手性藥物分析、農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留、獸藥殘留檢測技術 研究工作。E-mail:byndsunpeng@163.com

O652.63

A

1001-4020(2017)02-0169-03