吳大輝, 周仕林, 張麗娜, 張 帥, 余治昊, 黃明賢

(1. 上海理工大學 環(huán)境與建筑學院, 上海 200093; 2. 上海理工大學 理學院, 上海 200093)

Eu(dbm)3phen/SiO2@KH570-NH2核殼結構微球的制備及其性能表征

吳大輝1, 周仕林2, 張麗娜1, 張 帥2, 余治昊2, 黃明賢2

(1. 上海理工大學 環(huán)境與建筑學院, 上海 200093; 2. 上海理工大學 理學院, 上海 200093)

將由二苯甲酰甲烷、1,10-菲羅啉及氯化銪三者合成的熒光配合物Eu(dbm)3phen嵌入于用水刻蝕法制得的二氧化硅微球,得到Eu(dbm)3phen/SiO2復合微球。為解決上述復合微球易泄漏的問題,在微球表面包覆了一層約10 nm厚的γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷,形成核-殼結構,并通過與甲基丙烯酸縮水甘油酯的聚合反應,使微球表面帶上環(huán)氧基團。通過環(huán)氧基團與乙二胺的開環(huán)反應,使微球表面帶有氨基,其熒光強度可保持為原強度的72%,并便于與抗體連接。通過激發(fā)粒徑儀、掃描電鏡等多種方法對此材料的結構及性能作了表征。結果表明該材料有條件用作熒光免疫檢測中生物分子的標記。

Eu(dbm)3phen配合物; 介孔二氧化硅; 核殼結構

自1942年第一次報道了β-二酮配合物的發(fā)光性質以來,稀土離子β-二酮配合物憑借著自身優(yōu)良的發(fā)光性能引起了人們的廣泛關注[1]。但稀土離子β-二酮配合物具有熱穩(wěn)定性差、機械張力低等缺點,這限制了它的廣泛應用[2]。為了改善上述缺點,一些課題組將稀土離子β-二酮配合物填入到無機材料中[3]。二氧化硅具有價格低廉、易合成、可透光、粒徑易控制等優(yōu)點,所以稀土離子β-二酮配合物/二氧化硅復合微球得到了廣泛的研究[4-6]。文獻[4]報道將Eu(dbm)3phen填入到介孔二氧化硅微球中,并研究了Eu(dbm)3phen在介孔二氧化硅中的猝滅濃度和光穩(wěn)定性。研究結果表明:在平均粒徑為60 nm、平均孔徑為2.9 nm的介孔二氧化硅中,最多能夠摻雜質量分數為23%的Eu(dbm)3phen,且在140 ℃下熒光強度保持不變。文獻[5]中研究了介孔二氧化硅表面修飾不同硅烷偶聯劑對熒光性能的影響,結果表明:介孔二氧化硅表面修飾上3-氨基丙基三乙氧基硅烷(KH550)后,能夠使Eu(dbm)3phen/SiO2復合微球的熒光強度提高1倍,光衰時間延長至0.73 ms。Eu(dbm)3phen/SiO2復合微球具有熒光強度較強、激發(fā)峰較寬、發(fā)射峰較窄以及光衰時間長等優(yōu)點,適用于熒光免疫分析[7-10]。但由于Eu(dbm)3phen與二氧化硅之間為物理吸附作用,Eu(dbm)3phen易泄漏,其應用范圍受到了限制。

為解決Eu(dbm)3phen/SiO2復合微球易泄漏的問題,本工作在Eu(dbm)3phen/SiO2復合微球表面涂覆了一層γ-甲基丙烯酰氧基丙基三甲氧基硅烷(KH570)殼,形成核-殼結構。同時為了能夠與抗體相連,在微球表面進行接枝共聚反應,涂覆聚甲基丙烯酸縮水甘油酯(PGMA)后,再進行環(huán)氧開環(huán)反應,使得復合微球表面富含-NH2。

1 試驗部分

1．1 儀器與試劑

JEM 2011型透射電子顯微鏡,Nicolet is5型傅里葉變換紅外光譜儀,Nano Brook 90plus Zeta型激光粒徑儀,F-7000型熒光分光光度計,U-3900型紫外-可見分光光度計,Tescan Vega 3型掃描電子顯微鏡,PALL cascada-bio型超純水機。

氨水、無水乙醇、正硅酸四乙酯(TEOS)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷、甲苯、二苯甲酰甲烷、KH570均為分析級,堿性氧化鋁(0.074～0.05 mm,即200～300目)、無水乙酸鈉純度為99%,氯化銪六水合物純度為99.0%,1,10-菲羅啉-水合物純度為98%,甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)純度為97%,偶氮二異丁腈(AIBN)、KH550純度為99%。

試驗用水為超純水(電阻率為18.2 MΩ·cm)。

1．2 儀器工作條件

激光粒徑儀(DLS):二氧化硅、SiO2-NH2的遷移率依次為-2.89,-0.77 V·cm-1,二氧化硅、SiO2-NH2的頻率依次為235.24,244.44 Hz。

掃描電鏡:高壓30 kV,工作距離4.4 mm。

透射電鏡:高壓80 kV。

紫外分光光度計:測量范圍200～900 nm。

熒光分光光度計:激發(fā)波長354 nm,檢測波長613 nm,縫寬2.5 mm。

紅外光譜儀:測量范圍4 000 cm-1以內。

1．3 試驗方法

1．3．1 單分散介孔二氧化硅微球的制備

將無水乙醇100 mL、水20 mL和氨水5 mL混合于500 mL錐形瓶中,用封口膜將錐形瓶密封,并于40 ℃下加熱攪拌0.5 h,然后加入TEOS 8 mL,攪拌2.5 h,離心分離,并用水洗3次,得到平均粒徑為247 nm的二氧化硅微球[11]。將所得的二氧化硅微球溶于水中,并于100 ℃下加熱回流8 h。反應過程中,每隔一段時間,取出5 mL反應液,離心分離后溶于乙醇10 mL中[12]。8 h后,將剩余反應液離心分離,并用水洗2次,于真空干燥箱中干燥過夜。

1．3．2 介孔二氧化硅的氨基化

將干燥的二氧化硅加入甲苯50 mL中,超聲分散20 min。然后將混合液移至三口燒瓶中,加入過量的KH550,于氮氣氛圍下加熱回流24 h。反應結束后離心分離,用甲苯和乙醇各洗2次,于真空干燥箱中干燥過夜。

1．3．3 Eu(dbm)3phen的合成及填充

將3 mmol的二苯甲酰甲烷,1 mmol的1,10-菲羅啉-水合物溶于50 mL無水乙醇中。將1 mmol的氯化銪六水合物溶于10 mL水中。將上述兩種溶液混合,用1 mol·L-1乙酸鈉溶液將混合液pH調至6～7,磁力攪拌4 h后,離心分離,用水和無水乙醇各洗1次,于真空干燥箱中干燥過夜。取干燥過后的上述Eu(dbm)3phen少許,溶于二氯甲烷中,再加入二氧化硅微球,于常溫下攪拌6 h,離心分離,于真空干燥箱中干燥過夜。加入Eu(dbm)3phen的質量分數為二氧化硅微球的10%。

1．3．4 Eu(dbm)3phen/SiO2復合微球的包覆

取水50 mL于100 mL燒杯中,加入少許KH570,然后再加入少許鹽酸溶液,于常溫下攪拌,攪拌至水中油滴消失。再加入Eu(dbm)3phen/SiO2復合微球,待混合均勻后,加入少許氨水。以后每隔0.5 h,加入少許氨水,待第4次加入氨水后,再反應2 h,離心分離,用無水乙醇洗2次,于真空干燥箱中干燥過夜。

1．3．5 Eu(dbm)3phen/SiO2@KH570與GMA的接枝聚合

取Eu(dbm)3phen/SiO2@KH570微球0.5 g,分散于DMF 50 mL中,取GMA 1 mL,用堿性氧化鋁過濾后加入。于氮氣氛圍下加入AIBN 0.02 g,于75 ℃下攪拌6 h。待反應完成后,離心分離,用DMF和無水乙醇各洗2次,于真空干燥箱中干燥過夜。

1．3．6 Eu(dbm)3phen/SiO2@KH570-GMA微球表面氨基化

將上述所得微球分散于DMF 50 mL中,加入乙二胺2 mL,于80 ℃下攪拌3 h,反應結束后,離心分離,用DMF和無水乙醇各洗1次,于真空干燥箱中干燥過夜,得到Eu(dbm)3phen/SiO2@KH570-NH2微球。具體合成路線見圖1。

(a) 制備示意圖

(b) 環(huán)氧開環(huán)反應

(c) 抗體連接反應圖1 Eu(dbm)3phen/SiO2@KH570-GMA微球的制備及環(huán)氧開環(huán)反應和與抗體連接反應的示意圖Fig. 1 Schematics of preparation of microspheres of Eu(dbm)3phen/SiO2@KH570-GMA, ring-opening reaction of epoxy groups, and linking of the microspheres with antibody

2 結果與討論

2．1 Eu(dbm)3phen/SiO2@KH570-NH2的組成與結構

將介孔二氧化硅微球分散于水中,用激光粒徑儀進行測試,介孔二氧化硅微球DLS圖見圖2。

由圖2可知:粒徑分布符合正態(tài)分布,其平均粒徑為247 nm,分散性指數(PDI)為0.039。

介孔二氧化硅微球的掃描電鏡(SEM)圖見圖3。

圖2 介孔二氧化硅微球DLS圖Fig. 2 DLS curve of mesoporous silica microsphere

由圖3可知:平均粒徑為(223±16) nm。

由上述結果可知,成功合成了單分散、窄分布的介孔二氧化硅微球。

圖3 介孔二氧化硅微球SEM圖Fig. 3 SEM image of mesoporous silica microsphere

二氧化硅與SiO2-NH2的電動電勢見表1。

表1 二氧化硅與SiO2-NH2的電動電勢Tab. 1 Zeta potential of SiO2 and SiO2-NH2

由表1可知:未修飾KH550前,二氧化硅的Zeta電位為-37.05 mV;修飾KH550后,Zeta電位升高至-9.87 mV。這是因為-NH2在水溶液中能夠結合水電離出來的H+,形成帶正電荷狀態(tài)的-NH3+,因此氨基化的二氧化硅的Zeta電位升高。由于修飾上的-NH2的量較少,不能將Zeta電位升高到正值,但修飾上大量的-NH2容易堵塞二氧化硅上的介孔,不利于后續(xù)Eu(dbm)3phen的填充[5],所以修飾少量的-NH2是合理的。

合成介孔二氧化硅的方法主要有兩大類,一種是利用模板法合成介孔二氧化硅[13],另一種是在二氧化硅微球上進行刻蝕[14]。模板法中去除模板的方法主要有溶液提取法和高溫灼燒法[15]。以溴化十六烷三甲基銨(CTAB)作模板劑為例,完全去除CTAB需要用丙酮回流48 h,且重復6次,耗時長[16]。高溫灼燒法是將二氧化硅微球置于馬弗爐中,于550 ℃下加熱10 h[17]。在550 ℃下,二氧化硅表面的硅羥基容易失水,形成硅氧硅鍵,不利于后續(xù)的氨基化,因此需要活化處理,這使反應變冗長[11]?？涛g法包括氫氧化鈉刻蝕和水刻蝕。氫氧化鈉刻蝕產量太低,且二氧化硅的粒徑會變小,不易控制[18]。水刻蝕是一種適用于幾十納米到幾百納米二氧化硅微球的擴孔方法。只需將二氧化硅微球分散于水中,在100 ℃下加熱幾小時。水刻蝕過后,二氧化硅分散在無水乙醇中的透射率見圖4。

圖4 介孔二氧化硅的透光率圖Fig. 4 Transmittance spectra of mesoporous silica

由圖4可知:主要的刻蝕階段發(fā)生于1～2 h之間,反應8 h后,在900 nm處的透射率由48%升高至84%,這是因為擴孔后,二氧化硅變得不再密實,能夠透過更多的光。

刻蝕前后的微球、包覆KH570的微球及聚合GMA的微球的透射電鏡圖見圖5。

比較圖5中a、b(50 nm)可知:a(50 nm)表面較為光滑,b(50 nm)表面較為粗糙。這說明經過水刻蝕,微球表面已擴孔成功。比較圖5中b、c(50 nm)可知:在微球外層包覆了一層顏色較淺的殼層,殼層的厚度為10 nm左右。比較圖5c(50 nm)、d(20 nm)可知:與GMA聚合后,殼層表面變得凹凸不平,說明GMA已經成功在殼層表面發(fā)生了聚合反應,GMA層的厚度約為5 nm。

(a) 未刻蝕的微球 (b) 刻蝕過后的微球

(c) 包覆KH570的微球 (d) 聚合GMA的微球圖5 透射電鏡圖Fig. 5 TEM images

5種微球的紅外光譜圖見圖6。

1-SiO2;2-SiO2-NH2;3-Eu(dbm)3phen/SiO2@KH570; 4-Eu(dbm)3phen/SiO2@KH570-GMA; 5-Eu(dbm)3phen/SiO2@KH570-NH2圖6 5種微球的紅外光譜圖Fig. 6 IR spectra of the 5 micropheres

由圖6中曲線1可以發(fā)現:1 105 cm-1處存在強而寬的吸收峰,屬于Si-O-Si的反對稱伸縮振動;800,471 cm-1是Si-O對稱伸縮振動和彎曲振動;3 434 cm-1處強而寬的吸收峰是Si-O-H的伸縮振動和O-H的伸縮振動;1 640 cm-1處是H-O-H彎曲振動峰,而943 cm-1處的峰屬于Si-OH的彎曲振動吸收峰。由此可以判斷所合成的物質為二氧化硅。圖6中曲線2為氨基化的二氧化硅,但并未發(fā)現氨基的特征峰,這可能是由于鍵合上的KH550的量比較少,為二氧化硅的強吸收峰所掩蓋,文獻[19]也有類似的情況。Zeta電位的升高也說明了二氧化硅已成功接上氨基。圖6中曲線3出現了1 720,2 958,2 928 cm-1等新峰,分別為羰基的伸縮振動峰和甲基、亞甲基的振動峰,說明二氧化硅微球表面已成功接上了KH570。由圖6中曲線4可知,在910 cm-1出現了環(huán)氧基團的特征峰,表明GMA成功接枝到微球上。圖6中曲線5出現了新的1 568 cm-1峰,是-NH2的彎曲振動峰,說明表面微球上含有氨基基團。

2．2 微球的性能表征

Eu(dbm)3phen/SiO2@KH570-GMA的激發(fā)光譜圖(發(fā)射波長613 nm)見圖7。

圖7 Eu(dbm)3phen/SiO2@KH570-GMA的激發(fā)光譜Fig. 7 Excitation spectrum of Eu(dbm)3phen/ SiO2@KH570-GMA

由圖7可知:Eu(dbm)3phen/SiO2@KH570-GMA在278,355 nm處存在寬的激發(fā)峰,適用于近紫外激發(fā)。在發(fā)射光譜中,共有580,591,613,653,704 nm等5個峰,分別對應于5D0→7FJ(J=0,1,2,3,4)的躍遷發(fā)射。其中613 nm處峰最強,說明了Eu3+偏離反演對稱中心,屬于電偶極躍遷,易受周圍環(huán)境影響。4種微球的發(fā)射光譜圖(355 nm處激發(fā))見圖8。

1-Eu(dbm)3phen/SiO2-NH2; 2-Eu(dbm)3phen/SiO2@KH570-NH2; 3-Eu(dbm)3phen/SiO2; 4-未包覆KH570,但進行聚合反應與環(huán)氧開環(huán)反應的 Eu(dbm)3phen/SiO2-NH2圖8 4種微球的發(fā)射光譜Fig. 8 Emission spectra of the 4 micropheres

由圖8中曲線1,3可知:當二氧化硅氨基化后,Eu(dbm)3phen和氨基的氫鍵作用[5,20]使得熒光強度增強。為了比較包覆KH570前后對Eu(dbm)3phen泄漏情況的影響,試驗將包覆KH570前后的Eu(dbm)3phen/SiO2-NH2進行了聚合反應與環(huán)氧開環(huán)反應。包覆KH570的Eu(dbm)3phen/SiO2-NH2的熒光強度減少了28%,未包覆KH570的Eu(dbm)3phen/SiO2-NH2的熒光強度減少了88%(圖8中曲線2,4)。因此包覆KH570能夠有效地減少熒光分子Eu(dbm)3phen的泄漏。

本工作采用Stober法、水刻蝕擴孔以及浸漬法成功合成了Eu(dbm)3phen/SiO2復合材料。在水相中,微球表面成功包覆了一層約10 nm厚的KH570,并與GMA進行聚合反應,這使得微球表面帶上環(huán)氧基團。環(huán)氧基團與乙二胺的開環(huán)反應,使得微球表面帶有氨基,且熒光強度保持為原來的72%。該材料有望用于熒光免疫檢測中生物分子的標記,特別是用于時間分辨熒光免疫檢測等。

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DOI:10.11973/lhjy-hx201702005

Study on Preparation and Properties of Microspheres of Eu(dbm)3phen/SiO2@KH570-NH2with Core-Shell Structure

WU Da-hui1, ZHOU Shi-lin2, ZHANG Li-na1, ZHANG Shuai2, YU Zhi-hao2, HUANG Ming-xian2

(1.SchoolofEnvironmentandArchitecture,UniversityofShanghaiforScienceandTechnology,Shanghai200093,China;2.SchoolofScience,UniversityofShanghaiforScienceandTechnology,Shanghai200093,China)

A fluorescent coordination complex of Eu(dbm)3phen was synthesized by the reaction among dibenzoyl methane, 1,10-phenanthroline and europium chloride, and was embedded into the SiO2microsphere prepared by the surface protected water-etching, to obtain the compound microspheres of Eu(dbm)3phen/SiO2. To overcome the leakage of the microsphere, a layer of KH570 (ca. 10 nm) was covered onto the surface of microspheres, to form core-shell structure. And in addition, to have epoxy groups attached to the microspheres, polymerization with GMA was carried out. The epoxy rings were opened by reaction with ethylene diamine, thus to have aminogroups attached on the surface of microspheres, to keep 72% of its original fluorescence intensity, and to have convenience in linking with antibody. The structure and properties of the above mentioned microsphere material were studied thoroughly by DLS, SEM and so on. It was shown that this material is suitable to be used for biolabelling in fluoro-immuno-assay.

Coordination complex of Eu(dbm)3phen; Mesoporous SiO2; Core-shell structure

10.11973/lhjy-hx201702004

2016-02-18

滬江基金(D15011)

吳大輝(1992-),男,福建福州人,碩士研究生,研究 方向為發(fā)光材料。E-mail:wdh19920410@163.com

O657.3

A

1001-4020(2017)02-0139-07