孫玉營，吳進怡，柴 柯，閆小宇

(海南大學材料與化工學院 熱帶島嶼資源先進材料教育部重點實驗室，海南 海口 570228)

?

高壓脈沖電場結(jié)合炭黑復合涂層對硅藻活性的影響研究

孫玉營，吳進怡，柴 柯，閆小宇

(海南大學材料與化工學院 熱帶島嶼資源先進材料教育部重點實驗室，海南 ?？?570228)

柴 柯

隨著環(huán)境管制條例增多以及社會對傳統(tǒng)有毒防污涂料安全問題的關(guān)注，研究環(huán)保海洋生物防污方法迫在眉睫。采用TTC-脫氫酶活性測試來表征高壓脈沖電場(HPEF)結(jié)合炭黑環(huán)氧防腐復合涂層的防污性能。采用SEM觀察分析炭黑復合涂層上的硅藻經(jīng)脈沖電場處理前后的微觀結(jié)構(gòu)和形貌特征。經(jīng)HPEF處理后舟形藻和海鏈藻細胞出現(xiàn)凹陷、破裂及有機質(zhì)溢出，說明HPEF殺藻可采用 “電穿孔”理論解釋。在通電時間10 min、頻率為23.15 kHz、占空比為0.5、電壓為19 kV條件下，硅藻的失活率達到最大。在炭黑復合涂層上的海鏈藻最大失活率為89.2%，舟形藻最大失活率為92.1%。適量的炭黑可以增強環(huán)氧樹脂的力學性能。炭黑復合涂層的力學性能取決于炭黑的添加量，當炭黑添加量為0.3%時可以得到綜合力學性能較好的復合涂層。

炭黑；高壓脈沖電場；殺藻性能；力學性能；環(huán)氧防腐涂料

1 前 言

隨著海洋作業(yè)的日益深入，各種船舶和海洋設(shè)施的防護變得尤為重要[1,2]。海洋生物污損是一個全球性的經(jīng)濟問題，會導致重大的物質(zhì)損失和經(jīng)濟損失。在海洋環(huán)境下，微觀藻類暫時或永久地附著在基體上是海洋生物污損的重要組成部分[3]。微觀藻類的附著為宏觀海洋生物如藤壺、牡蠣等提供了食物。因此，殺死附著的微觀藻類對防止生物污損來說極為重要。大多數(shù)微觀藻類并不容易附著，只有硅藻極易附著。所以如何抑制附著的硅藻是一個急需解決的難題。在過去的十幾年里，防污涂料的應用已成為全世界公認的防止海洋設(shè)施免受生物污損的有效方法并被大力發(fā)展[4]。然而這些海洋防污涂料由于使用有毒的化學物質(zhì)或重金屬離子會產(chǎn)生二次污染物，造成海洋生態(tài)環(huán)境的破壞。隨著環(huán)境法規(guī)的增多和對海洋環(huán)境安全越來越多的關(guān)注，無污染的電脈沖(PEF)結(jié)合導電涂層作為一種很有發(fā)展前景的防污技術(shù)受到了廣泛關(guān)注。高壓脈沖電場(HPEF)技術(shù)在食品非熱加工領(lǐng)域的應用已經(jīng)十分廣泛[5-8]。人們普遍認為其使微生物失活的主要原理是細胞膜電穿孔[9,10]。在電脈沖的作用下，細胞膜出現(xiàn)一些微孔，導致細胞可逆或不可逆地損傷及死亡[11]。高壓脈沖電場短脈沖處理可以摧毀細胞膜[12]。脈沖電場被廣泛應用于食品滅菌[13-16]。例如高壓脈沖電場和紫外線照射等非熱技術(shù)結(jié)合成功地為果汁滅菌[17,18]。雖然 HPEF 用于食品滅菌的研究已經(jīng)取得很大進展，然而這一技術(shù)在海洋防污和防腐領(lǐng)域未見報道。炭黑由于其熱電性好且來源廣泛、價格低廉，是最常用的導電填料，其體積電阻率約為 0.1 Ω·cm。炭黑填充環(huán)氧樹脂導電復合材料因其力學性能、 耐熱性能和粘接性能優(yōu)異，已運用于導電膠粘劑、彎曲傳感材料、光電設(shè)備等多個領(lǐng)域。本文結(jié)合高壓脈沖技術(shù)與炭黑復合涂層探討HPEF在海洋領(lǐng)域應用的可行性，考察電壓、頻率及占空比對殺藻效果的影響，通過摻雜不同含量的炭黑得到具有不同力學性能的復合涂層，從而選擇綜合力學性能最佳的復合涂層。

2 實 驗

實驗選擇的襯底為有機玻璃板(100 mm×50 mm×4 mm)，參照 GB/T 9271-2008 采用超聲波清洗機對襯底進行清洗。取炭黑研磨后按 0.1 wt%、0.3 wt%、0.5 wt%、0.7 wt%、0.9 wt%與環(huán)氧防腐涂料充分混合，用恒溫磁力攪拌器在室溫下攪拌 20 min， 靜置30 min，涂布于有機玻璃板和馬口鐵(120 mm×50 mm×0.3 mm)后室溫靜置晾干7 d。用于力學性能實驗的馬口鐵樣品的涂層厚度遵循GB/T 12452.2-2008，有機玻璃板涂層厚度需達到300～350 μm。采用數(shù)字測厚儀測試復合涂層厚度。

實驗所用的單細胞硅藻由海南大學海洋學院藻種實驗室提供，海鏈藻(Thalassiosira)和舟形藻(Navicula)的培養(yǎng)基采用浙江3號培養(yǎng)基[19]，按照配方稱取試劑，于容量瓶中定容，混勻分裝滅菌，待其冷卻后接種對數(shù)生長期的藻種。培養(yǎng)溫度20±1 ℃、光照強度為1600 lx、光照時間和無光照的時間比為14∶10 h。待硅藻處于對數(shù)生長期，進行實驗，盡可能取同齡藻作為實驗藻種。

采用高壓脈沖電源設(shè)備(DMC-200，大連鼎通科技發(fā)展有限公司)，最高輸出電壓為 40 kV，平行平板式電極，電極材料為銅，電極之間采用涂層樣品連接(可替換)， 脈沖波形為方波，其中電壓、頻率和占空比可調(diào)。選取高壓脈沖電場處理參數(shù)如下:電壓11, 13, 15, 17, 19 kV;頻率 15.06, 17.16, 23.15, 32.05, 53.19 kHz;占空比 0.1, 0.3, 0.5, 0.7, 0.9。

向7只具塞離心管中加入2 mL Tris-HCl緩沖液,1 mL 8%Na2S溶液(新配),1 mL 2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC)標準使用溶液,濃度分別為0, 5, 10, 20, 40, 60, 80 mg/L;7只離心管中的TTC含量分別為0, 5, 10, 20, 40, 60, 80 μg。將7只具塞離心管振蕩搖勻,置于32±1 ℃恒溫水浴中發(fā)色5 min,各管分別加入4 mL丙酮和5 mL石油醚,振蕩,提取TF,穩(wěn)定5 min,取上層有機溶液。在分光光度計上以石油醚為參比,487 nm處比色。繪制標準曲線(如圖1)。

將藻液樣品離心棄去上清液，加Tris-HCl緩沖液、TTC混合均勻。取5 ml混合液加0.5 ml甲醛作為對照樣。將混合液和對照樣放入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，分別向混合藻液和對照樣加入甲醛后離心去上清液，加入環(huán)己烷混合均勻，28 ℃恒溫培養(yǎng)10 min，離心取上清液，在485 nm處比色，記錄吸光度值。

采用TTC-脫氫酶活性測試高壓脈沖電場處理下藻細胞的失活率計算公式見式(1)～(3)：

(1)

(2)

(3)

式中γ1——脈沖實驗前的脫氫酶活性；γ2——脈沖電場實驗后的脫氫酶活性；M——藻液在485 nm處的吸光度值對應的TF含量；t——發(fā)色時間；V——實驗藻液體積；P——脈沖電場對藻樣的抑制率。

采用 S4800 場發(fā)射掃描電子顯微鏡(Hitachi公司)觀察復合涂層表面的形貌，電子加速電壓為 5 kV。采用英國 Renishaw in Via Reflex 顯微共聚激光拉曼光譜儀對復合涂層經(jīng)高壓脈沖電場作用前后的結(jié)構(gòu)進行分析。實驗在室溫下進行，采用波長為785 nm的氬離子激光器作為入射光源，激光功率為300 mW，操作過程采用背散射配置，其束斑直徑為1μm，掃描范圍為 50～2000 cm-1，衰減系數(shù)為30%，對通電前后的涂層進行二次掃描檢測并疊加。采用Novocontrol GmbH 的 Concept 40 型寬頻介電阻抗譜儀對復合涂層介電性能進行分析，頻率范圍為 0～107 Hz。

涂層的鉛筆硬度依據(jù)GB/T 6239-2006；涂層的沖擊強度依據(jù)GB/T 1732-1993；涂層的柔韌性依據(jù)GB/T1731-1993。

3 結(jié) 果

3.1 HPEF參數(shù)變化對炭黑復合涂層上硅藻細胞活性的影響

3.1.1 HPEF參數(shù)變化對炭黑復合涂層上海鏈藻細胞活性的影響

圖1為最佳實驗條件下的標準曲線，表述了不同吸光度所對應的1,3,5-三苯基甲臜(TF)含量,代入式(3)可得在不同高壓脈沖電場參數(shù)處理條件下HPEF對炭黑復合涂層上海鏈藻細胞活性的影響(如圖2)。在炭黑復合涂層上海鏈藻的失活率隨電場參數(shù)變化表現(xiàn)出了一定的規(guī)律性。由圖2a可見，在同一脈寬、頻率及通電時間下，隨著高壓脈沖電場電壓的升高，炭黑復合涂層上的海鏈藻的失活率顯著增大，說明電壓對海鏈藻的抑制效果十分顯著，但是當電壓超過15 kV時，藻細胞的失活率增幅變小。當電壓達到19 kV時海鏈藻的失活率達到最大，為89.2%。由圖2b可見，在保持不變的電壓、脈寬及處理時間條件下，隨脈沖次數(shù)(頻率)的增加，海鏈藻的失活率表現(xiàn)出先增大后略微減小的趨勢。當頻率為23.15 kHz時，海鏈藻的失活率達到最大。由圖2c可以發(fā)現(xiàn)，隨HPEF的占空比的升高，海鏈藻細胞失活率呈現(xiàn)出先增后減最后平穩(wěn)的趨勢。其中在脈沖頻率和電壓一定時，其占空比的改變意味著脈寬的變化，當占空比為0.5時海鏈藻的失活率達到最大值，說明在占空比為0.5時電場對海鏈藻的抑制效果最為明顯。

圖1 吸光度與TF含量的關(guān)系曲線Fig.1 Relationship between absorbance and TF content

圖2 高壓脈沖電場參數(shù)對炭黑復合涂層上海鏈藻失活的影響：(a)電壓、(b)頻率、(c)占空比Fig.2 Effects of HPEF parameters on the inactivity rate of thalassiosira attached to carbon black composite coating: (a) voltage, (b) frequency and (c) duty cycle

3.1.2 HPEF參數(shù)變化對復合涂層上舟形藻細胞活性的影響

采用TTC-脫氫酶活性測試表征炭黑復合涂層上，方波高壓脈沖電場處理前后，底棲性硅藻舟形藻的細胞活性。實驗結(jié)果表明，高壓脈沖電場對舟形藻具有顯著的抑制效果。高壓脈沖電場的電壓對涂層殺藻性能的影響如圖 3a所示，控制通電時間10 min、占空比0.5和頻率23.15 kHz的條件下，從圖中可以看出舟形藻的失活率均隨著電壓的升高逐漸增大，當電壓超過 15 kV 后趨向平衡。電壓為 19 kV 時其失活率達最大，舟形藻的最大失活率為92.1%。處理條件為 10 min、占空比 0.5 和電壓 15 kV，及頻率分別為 15.06、17.86、23.15、32.05 和 53.19 kHz時，從圖 3b可以發(fā)現(xiàn)藻細胞TTC-脫氫酶活性測試的失活率前期隨頻率逐漸升高，當頻率超過 23.15 kHz 后略微降低并趨向平衡。炭黑復合涂層上的舟形藻細胞失活率在頻率為 23.15 kHz 時達到最大值，為90.7%。在保持高壓脈沖電場的電壓、脈沖次數(shù)以及處理時間10 min固定不變的條件下，不同的占空比下復合涂層對舟形藻細胞活性的影響見圖 3c。從圖中可以看出舟形藻的失活率隨占空比的升高逐漸增大，且占空比超過0.5后逐漸下降最終趨于平衡。占空比為0.5時HPEF對舟形藻活性影響最為顯著，達最高值90.7%。

圖3 高壓脈沖電場參數(shù)對炭黑復合涂層上舟形藻失活的影響：(a)電壓,(b)頻率,(c)占空比Fig.3 Effects of HPEF parameters on the inactivity rate of navicula attached to carbon black composite coating: (a) voltage, (b) frequency and (c) duty cycle

3.2 炭黑添加量對復合涂層力學性能的影響

圖4為炭黑復合涂料在涂層厚度和風干時間為定值只改變炭黑含量情況下的力學性能曲線。從圖4可以看出炭黑的添加明顯增強了涂層的抗沖擊性能和柔韌性。添加少量的炭黑對涂層硬度沒有影響，當炭黑含量超過0.1%后涂層硬度下降(如圖4a)。從圖4b看出，隨著炭黑含量的增加，涂層的抗沖擊性能由17 kg·cm 增大到20 kg·cm。但當炭黑含量超過0.5%，涂層的抗沖擊性能反而下降；炭黑含量超過0.7%后，涂層的抗沖擊性能不再下降。涂層柔韌性由不引起涂層破裂的最小棒軸直徑表示，直徑越小涂層柔韌性越好。由圖4c可看出，添加極少量炭黑時，涂層的柔韌性沒有發(fā)生明顯變化。添加適量的炭黑可以增強涂層的柔韌性且在炭黑含量為0.3%時得到最佳柔韌性。但炭黑含量超過0.3%后，涂層柔韌性急劇下降；添加的炭黑含量在0.5%以上時，復合涂層的柔韌性比環(huán)氧樹脂差。炭黑含量達到0.7%后再繼續(xù)增加炭黑含量，涂層的柔韌性趨于平穩(wěn)。在實際應用中，優(yōu)先考慮抗沖擊性能和柔韌性，所以添加0.3%炭黑的復合涂料綜合力學性能最佳。

圖4 炭黑含量對復合涂層力學性能的影響：(a)硬度，(b)抗沖擊性能，(c)柔韌性Fig.4 Effects of carbon black content on physical properties of coatings: (a) hardness, (b) impact properties and (c) flexible

4 討 論

4.1 HPEF對炭黑復合涂層上硅藻的作用機理

在海洋環(huán)境中在微生物膜形成之后，海洋微藻的附著是海洋生物污損形成不可或缺的一個重要環(huán)節(jié)。實驗結(jié)果表明高壓脈沖電場對浮游形的海鏈藻和舟形藻都有顯著的抑制效果，也表明高壓脈沖電場參數(shù)如電壓、頻率和占空比對硅藻失活率有著非常明顯的影響。圖5為硅藻在高壓脈沖電場處理前后所拍攝的SEM照片。從圖5中可以明顯看到經(jīng)HPEF處理的海鏈藻的細胞膜上出現(xiàn)了孔洞，舟形藻的細胞膜已經(jīng)呈碎片狀。由此說明了HPEF使藻細胞失活的主要原理是電穿孔理論。高壓脈沖電場在用于殺藻時，會形成一些亞損傷細胞，對硅藻的致死作用是由于脈沖電場對藻細胞的穿孔損傷積累所致[20-25]。當跨膜電位達到1 V時，細胞膜的完整性遭到破壞，細胞裂解。臨界電位的改變由電場持續(xù)時間和電場參數(shù)及溫度決定。炭黑作為導電填料可以均勻體系內(nèi)的電壓并增強細胞電場之間的相互作用，使細胞膜對外加電場和膜電位差的響應更加頻繁、強烈。

圖5 高壓脈沖電場處理前后硅藻的SEM照片：(a)未處理的海鏈藻，(b)未處理的舟形藻，(c)處理后的海鏈藻，(d)處理后的舟形藻Fig.5 SEM images of the diatom, (a) and (b) are not subjected to HPEF,(c) and (d) are from a slide subjected to HPEF: (a) and (c) thalassiosira, (b) and (d) navicula

高壓脈沖電場參數(shù)電壓對硅藻活性有著十分顯著的抑制效果，結(jié)合HPEF不同電壓對海鏈藻和舟形藻細胞活性的影響結(jié)果表明，在頻率為23.15 kHz、占空比為0.5時，兩種硅藻的失活率隨電壓增大而增大。當電壓為19 kV時，兩種藻的失活率均達到最大值。而且，兩種硅藻的失活率在電壓由11 kV升高到15 kV這一階段急劇升高，電壓超過15 kV后失活率增幅變小。高壓脈沖頻率對硅藻細胞活性有顯著的抑制效果。保持電壓15 kV、占空比0.5不變，電場頻率由15.06 kHz增大到23.15 kHz，兩種硅藻的失活率也隨之增至最大值；繼續(xù)增加電場頻率，失活率反而降低。當通電時間和占空比一定時說明硅藻經(jīng)過電場處理的有效時長固定不變，頻率的增加就意味著脈沖次數(shù)的增加，也意味著脈寬的減少。不同脈寬的脈沖作用于細胞體內(nèi)結(jié)構(gòu)是不同的。脈寬大于20 μm時，高壓脈沖電場作用于藻細胞膜等，而脈寬小于20 μm時電場則作用于細胞內(nèi)的細胞質(zhì)等有機體。談亞芳等[26]研究不同波形參數(shù)的電脈沖對腫瘤細胞的電穿孔效應時有著相似實驗結(jié)論。高壓脈沖占空比對硅藻有著一定的抑制效果。在電壓15 kV、頻率23.15 kHz條件下，失活率隨占空比的增加而增大；占空比增至0.5時，失活率達到最大值；繼續(xù)增加占空比，失活率逐漸降低。實驗結(jié)果表明；脈寬通過占空比的改變來調(diào)節(jié)。當脈沖次數(shù)和脈沖電壓一定時，脈寬越大意味著有效通電時長越大，而且不同脈寬的脈沖電場會產(chǎn)生不一樣的細胞生物效應。作用于細胞膜的脈寬主要是微秒和亞微秒級的脈沖，跨膜電壓超過額定電壓時，細胞膜產(chǎn)生不可逆的穿孔效應，致使藻細胞的死亡。實驗過程中脈寬范圍為4～36 μm。

結(jié)合TTC-脫氫酶活性染色對經(jīng)脈沖電場處理前后藻細胞活性進行表征對比發(fā)現(xiàn)脈沖電場對兩種藻活性的抑制效果是十分顯著，且兩種藻的失活率并不相同，這是由于生物各異性造成的。但是其隨著脈沖參數(shù)的變化規(guī)律還是一致的。

4.2 炭黑對復合涂層力學性能的影響機理

炭黑原生粒子表面由細小的石墨狀晶體無規(guī)排列構(gòu)成，結(jié)構(gòu)粗糙,呈凹凸不平的原子臺階形貌[27]。炭黑粒子的表面粗糙度越大，炭黑粒子與環(huán)氧樹脂之間的相互作用越強。原因是表面粗糙度越大的炭黑粒子棱角(活化點)越多，表面能越高，吸附環(huán)氧樹脂的熵損失越小，與環(huán)氧樹脂的物理和化學作用越強。由于與粗糙炭黑粒子表面緊密結(jié)合的環(huán)氧樹脂鏈不易移動，因此當外力作用時，吸附在炭黑粒子表面的環(huán)氧樹脂分子鏈滑動十分困難，分子鏈的應力松弛、分子鏈局部和粒子鏈的重新定向會消耗較多能量，能夠延緩微裂紋產(chǎn)生，從而起到增強復合涂層力學性能的作用[28]。但是加入過量炭黑，使得體系的粘度增大，炭黑無法均勻分散，則可能由于形成較多的孔隙而產(chǎn)生一些缺陷，使復合涂層的力學性能下降。

5 結(jié) 論

通過研究高壓脈沖電場不同處理條件下對兩種硅藻細胞活性的影響，采用TTC-脫氫酶活性檢測的方法，得到經(jīng)過脈沖處理前后兩種藻的細胞活性，算出藻細胞的失活率，發(fā)現(xiàn)高壓脈沖電場對硅藻有著十分顯著的抑制作用，其中，高壓脈沖電場的電壓、頻率及占空比對兩種硅藻細胞活性有著明顯的抑制作用，都呈現(xiàn)出一定的規(guī)律性。硅藻失活率隨電壓增大而增大，當電壓增加到19 kV時達到最大。而電壓超過15 kV后繼續(xù)增加，硅藻失活率的增幅不大。在炭黑復合涂層上的海鏈藻最大失活率為89.2%，舟形藻最大失活率為92.1%。此外，HPEF對硅藻細胞活性的影響還依賴于頻率和占空比，最佳頻率和占空比分別為23.15 kHz和0.5。添加適量的炭黑可以增強涂層的力學性能。炭黑的含量為0.3%時，可以得到綜合力學性能最佳的復合涂層。

HPEF結(jié)合炭黑復合涂層防污方法的優(yōu)勢在于其優(yōu)異的防污效果和不產(chǎn)生二次污染的特點。因此，這一防污方法在海洋工業(yè)應用中有較大的潛力。

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(編輯 吳 琛)

The Effect of High Voltage Pulse Electric Field on Inactivation of Diatom Attached to Carbon Black Composite Epoxy Coating in Marine Environment

SUN Yuying, WU Jinyi, CHAI Ke, YAN Xiaoyu

(Key Laboratory of Ministry of Education for Advanced Materials in Tropical Island Resources,Material and Chemical Engineering College, Hainan University, Haikou 570228, China)

With increasing restrictions of environmental regulations and safety concerns over traditional poisonous coatings, it is highly desirable to develop a new green method for anti-biofouling in marine environment. In this paper, a green method that is high voltage pulse electric field (HPEF) combined with carbon black composite coating was introduced to inhibit the adhesion of diatom. Results are presented from diatom inactivation assays on the composite coating upon applications of HPEF. Diatom on the composite coating surfaces was visualized using SEM for exploring the mechanism of why HPEF inhibit the adhesion of diatom. Using pulses of 10 min in duration, 23.15 kHz in frequency, 0.5 in duty cycle and 19 kV in pulse amplitude, diatom inactivation rate reached the maximum. The largest inactivation rate of thalassiosira was 89.2%. The maximum inactivation rate of navicular was 92.1%. Furthermore, we find that carbon black could increase the mechanical properties of epoxy resin, and the optimum content of carbon black was 0.3%.

carbon black; high voltage pulse electric field; diatom inactivation performance; mechanical propertie; epoxy anticorrosive coating

2016-08-30

國家自然科學基金資助項目(51261006,51161007,50761004)

孫玉營，女，1991年生，碩士

柴 柯，男，1972年生，講師，Email： chaike888@sina.com

10.7502/j.issn.1674-3962.2017.04.08

TQ637

A

1674-3962(2017)04-0301-06