吳筱瑩，李劍平，伍昌林，莊乃保，吳凡

（1.廣東省深圳市血液中心，廣東，深圳518035；2.遼寧省血液中心，遼寧，沈陽(yáng)110044；3.廣東省深圳市第二人民醫(yī)院，廣東，深圳518035）

Rh陰性孕婦產(chǎn)前抗-D抗體陽(yáng)性率分析*

吳筱瑩1，李劍平2，伍昌林3，莊乃保1，吳凡1

（1.廣東省深圳市血液中心，廣東，深圳518035；2.遼寧省血液中心，遼寧，沈陽(yáng)110044；3.廣東省深圳市第二人民醫(yī)院，廣東，深圳518035）

目的 綜合分析不同狀況Rh陰性孕婦抗-D抗體的發(fā)生率。方法采用微柱凝膠卡方法鑒定Rh（D）血型以及測(cè)定孕婦血清抗-D抗體，PCR方法檢測(cè)RHD1227A等位基因鑒別我國(guó)漢族Rh陰性個(gè)體中的一種變異體“DEL型”和真實(shí)Rh陰性表型。結(jié)果共觀察196例Rh陰性孕婦，抗-D檢出率14.3%（28/196）；其中56例病歷記錄無(wú)妊娠史，抗-D陽(yáng)性率5.4%（3/56）；77例有妊娠史（有生育史除外），抗-D陽(yáng)性率7.8%（6/77）；余63例有生育史，抗-D陽(yáng)性率30.2%（19/63）。所有樣本中檢出變異體DEL型41例，均未檢測(cè)到抗-D抗體。排除DEL按真實(shí)Rh陰性計(jì)算（155例），抗-D陽(yáng)性率18.1%（28/155）；無(wú)妊娠史者陽(yáng)性率6.4%（3/47）；有妊娠史者陽(yáng)性率上升為9.7%（6/62）；有生育史者抗-D陽(yáng)性率則達(dá)41.3%（19/46）。結(jié)論近半數(shù)有生育史的真實(shí)Rh陰性孕婦發(fā)生D抗原同種免疫反應(yīng)，DEL型孕婦不因妊娠和生育產(chǎn)生抗-D抗體。

Rh陰性；DEL型；孕產(chǎn)婦；抗-D抗體

Rh（D）可導(dǎo)致嚴(yán)重的新生兒溶血癥（hemolytic disease of the newborn，HDN），在歐美曾一度引起恐慌，但在Rh免疫球蛋白廣泛使用后，HDN發(fā)生率迅速下降和得以控制[1]。在中國(guó)Rh免疫球蛋白并未被廣泛使用，甚至國(guó)內(nèi)無(wú)法購(gòu)買有藥監(jiān)批號(hào)的產(chǎn)品，但是HDN在中國(guó)卻并沒有預(yù)想的嚴(yán)重，即使考慮到中國(guó)人Rh陰性血型比率較低（0.3%）以及多數(shù)孕婦無(wú)生育史等原因，臨床實(shí)驗(yàn)室依然發(fā)現(xiàn)Rh陰性孕婦產(chǎn)前抗-D抗體的檢出率低于預(yù)期，許多多次妊娠甚至多次生育的孕婦，也未出現(xiàn)抗-D陽(yáng)性，其中原因或機(jī)制尚有待全面系統(tǒng)地調(diào)查和分析。

目前有關(guān)資料尤其是大樣本系統(tǒng)性的分析資料的積累還遠(yuǎn)不夠，甚至關(guān)于孕婦抗-D抗體陽(yáng)性率的資料積累，也還不足夠進(jìn)行全面分析，部分研究者認(rèn)為[2-5]，我國(guó)漢族Rh陰性個(gè)體中的一種變異體“DEL型”（D放散型，D-elute），比率高達(dá)1/4左右，因其紅細(xì)胞具有基本完整的D抗原表位[6]，而不被Rh陽(yáng)性胎兒的D抗原刺激產(chǎn)生同種免疫反應(yīng)，或是漢族Rh陰性孕婦抗-D檢出率較低的原因之一。本文根據(jù)實(shí)驗(yàn)室結(jié)果和臨床資料，按照是否妊娠和生育等狀況，綜合分析抗-D陽(yáng)性率、DEL的影響程度以及抗體陰性的原因等，進(jìn)一步積累相關(guān)資料。

1 資料與方法

1.1 樣本和統(tǒng)計(jì)對(duì)象

從2013年1月至2015年10月，收集深圳市第二人民醫(yī)院送檢產(chǎn)前抗-D抗體檢測(cè)的Rh陰性孕婦外周血樣本，血漿用于抗體測(cè)定，全血用于DNA提取。周期內(nèi)調(diào)查對(duì)象排除未在本院生育者，抗體檢測(cè)＜3次者，臨床資料顯示曾注射過Rh免疫球蛋白者、或產(chǎn)后發(fā)現(xiàn)新生兒為Rh陰性者，在產(chǎn)前抗-D檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)配偶為Rh陰性者，有輸血史者。同時(shí)，由于DEL型主要存在于漢族人群，非漢族孕婦不納入統(tǒng)計(jì)。

1.2 血型鑒定和抗-D抗體檢測(cè)

使用微柱凝膠檢測(cè)卡鑒定Rh（D）抗原（Diagnostic Grifols，S.A，Spain），抗-D抗體檢測(cè)按衛(wèi)計(jì)委《中國(guó)輸血技術(shù)操作規(guī)程（血站部分）》的實(shí)驗(yàn)室操作規(guī)程進(jìn)行[7]，抗體篩選細(xì)胞購(gòu)自長(zhǎng)春博訊生物技術(shù)有限公司，鑒定譜試劑紅細(xì)胞購(gòu)自上海血液生物醫(yī)藥有限公司或由廣州血液中心贈(zèng)送。

1.3 DEL型鑒定

Rh變異體DEL型鑒定采用PCR技術(shù)，檢測(cè)DEL的等位基因RHD1227A，方法參考文獻(xiàn)“中國(guó)人RHD基因定型系統(tǒng)”中的“Del反應(yīng)管”[8]，部分樣本送天津秀鵬生物技術(shù)開發(fā)有限公司DNA鑒定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料用率表示，樣本陽(yáng)性率比較使用χ2檢驗(yàn)，分別分析單次妊娠組和多次妊娠組、有生育史組和單次妊娠組、以及有生育史組和多次妊娠組。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Rh（D）表型

共觀察Rh（D）陰性孕婦196例，檢出Rh變異體DEL型41例，占20.9%，其余155例為真實(shí)Rh（D）陰性表型（79.1%），變異體DEL型的檢出率，略低于以往在捐血者中進(jìn)行大樣本研究報(bào)道的檢出率[9]，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 抗-D抗體

2.2.1 Rh陰性孕婦 196例Rh陰性孕婦中，檢出28例抗-D抗體陽(yáng)性（含僅末次抗體測(cè)定陽(yáng)性者），陽(yáng)性率14.3%（28/196）。其中，56例孕婦為首次妊娠（無(wú)妊娠史），3例抗-D陽(yáng)性，陽(yáng)性率5.4%（3/56）；77例有妊娠史（排除有生育史者），抗-D陽(yáng)性6例，比率7.8%（6/77）；余下63例均有生育史，抗-D陽(yáng)性19例，陽(yáng)性率達(dá)到30.2%（19/63）。χ2檢驗(yàn)（見附表）顯示第1次妊娠（G=1）與多次妊娠（G≥2）孕婦的抗-D陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.840），但有生育史（P≥1）與無(wú)生育史孕婦（G=1組和G≥2組）的抗-D檢出率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.0005和P=0.0006），有生育史孕婦的抗-D陽(yáng)性率是無(wú)生育史孕婦（無(wú)論是否有妊娠史）的4倍以上。

2.2.2 DEL型孕婦 41例DEL型孕婦均未檢測(cè)到抗-D抗體，其中12名孕婦記錄有生育史，即使其中2例有2次以上的生育史，提示DEL孕婦不被胎兒或新生兒紅細(xì)胞D抗原刺激而產(chǎn)生同種免疫反應(yīng)，較大程度地降低了我國(guó)漢族Rh陰性婦女因妊娠導(dǎo)致抗-D陽(yáng)性的比率。

2.2.3 真實(shí)Rh陰性孕婦 排除DEL型孕婦，在余下的155例真實(shí)Rh陰性表型個(gè)體中，由于DEL型個(gè)體的抗-D陽(yáng)性率為0，所以無(wú)論是總體陽(yáng)性率、還是按妊娠和生育分類統(tǒng)計(jì)的陽(yáng)性率，都相應(yīng)增高?？傮w陽(yáng)性率為升高為18.1%（28/155）；無(wú)妊娠史者47例，抗-D陽(yáng)性率上升為6.4%（3/47）；有妊娠史者62例，抗-D陽(yáng)性率上升為9.7%（6/62）；有生育史者46例，抗-D陽(yáng)性率則達(dá)到41.3%（19/46）。另外，在有生育史的46例真實(shí)Rh陰性孕婦中，27例（58.7%）包括其中4例有2次以上生育史的孕婦，未檢測(cè)到抗-D抗體，提示即使排除DEL型，仍有半數(shù)Rh陰性孕婦未知原因不被胎兒或新生兒D抗原致同種免疫反應(yīng)。

附表 孕婦血清抗-D抗體陽(yáng)性率分析

3 討論

Rh（D）陰性孕婦產(chǎn)前血清抗-D抗體檢測(cè)具有重要的臨床意義，當(dāng)抗-D抗體陽(yáng)性時(shí)，即直接提示新生兒面臨發(fā)生Rh（D）溶血病的風(fēng)險(xiǎn)。本文通過2年半的時(shí)間，連續(xù)觀察和分析196例Rh陰性孕婦，抗-D抗體總體陽(yáng)性率14.3%，與以往類似報(bào)道相近[2-5]，結(jié)果提示這一比例低于理論預(yù)期。但當(dāng)筆者按照有無(wú)妊娠和生育史進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)時(shí)發(fā)現(xiàn)，有生育史的孕婦的抗-D抗體陽(yáng)性率（30.2%）是無(wú)妊娠史孕婦的5倍（5.4%）、是有妊娠史無(wú)生育史孕婦的4倍（7.8%），充分提示生產(chǎn)過程更容易刺激母體產(chǎn)生Rh（D）初次免疫反應(yīng)，從而在第2次懷孕時(shí)產(chǎn)生高效價(jià)的抗-D抗體，也即免疫回憶反應(yīng)；另外，結(jié)果也提示孕婦有無(wú)妊娠史，似乎對(duì)抗-D陽(yáng)性率的影響不大（5.4%和7.8%），但作者認(rèn)為數(shù)據(jù)可能受到病歷記錄和孕婦口述隱私等因素的影響，本研究即有少數(shù)孕婦初次陳述無(wú)妊娠史，但在醫(yī)師改變問診環(huán)境和反復(fù)詢問后，改變了無(wú)妊娠史的陳述。

Rh變異體DEL型，在中國(guó)漢族Rh陰性個(gè)體中常見，達(dá)20%～30%，該變異體紅細(xì)胞膜D抗原的分子數(shù)極少，但其紅細(xì)胞膜D抗原結(jié)構(gòu)基本完整，本文共檢出DEL型孕婦41例，均未檢測(cè)到抗-D抗體，即使其中12名孕婦有生育史，且2例有2次以上的生育史，這與過往報(bào)道一致[2-5]，提示DEL孕婦不被胎兒或新生兒的紅細(xì)胞D抗原刺激產(chǎn)生同種免疫反應(yīng)，關(guān)于DEL臨床輸血同種免疫的報(bào)道[10-13]，也反證了這一觀點(diǎn)。重新討論孕婦抗-D陽(yáng)性率，如果排除DEL型，僅按真實(shí)Rh陰性統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)有生育史孕婦的抗-D陽(yáng)性率達(dá)到41.3%，是無(wú)妊娠史孕婦的近7倍，說明產(chǎn)前孕婦抗-D抗體的陽(yáng)性率和新生兒溶血病的發(fā)生與個(gè)體生育史密切相關(guān)。

綜上所述，在我國(guó)Rh免疫球蛋白并未被臨床廣泛使用的情況下，HDN卻并沒有發(fā)生普遍性的嚴(yán)重后果，除前文分析的中國(guó)人Rh陰性比率較低外，還與一些孕婦無(wú)妊娠史、多數(shù)孕婦無(wú)生育史，以及DEL型個(gè)體不產(chǎn)生抗-D抗體有關(guān)，雖然有文獻(xiàn)報(bào)道個(gè)別DEL個(gè)體輸血產(chǎn)生抗-D抗體[14]，但可能與該個(gè)例或攜帶罕見DEL等位基因有關(guān)[15]；按照本文結(jié)果，尚有58.7%的有生育史的真實(shí)Rh陰性孕婦并未檢測(cè)到抗-D抗體，作者認(rèn)為有以下幾個(gè)原因：部分個(gè)體胎母出血量極少不足以刺激發(fā)生同種免疫反應(yīng)[16]；部分個(gè)體或因ABO血型不合間接影響了抗-D免疫反應(yīng)的發(fā)生[17]；還有部分個(gè)體并不是不產(chǎn)生抗-D，在再次生育后或發(fā)生抗-D同種免疫反應(yīng)；余下一部分個(gè)體可能屬于不明原因的“始終”不發(fā)生抗-D同種免疫的人群，即使臨床輸血200ml以上，也有約15%的個(gè)體并不產(chǎn)生抗-D免疫反應(yīng)[18]。

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（張蕾 編輯）

Analysis of positive rate of anti-D antibody in Rh-negative pregnantwomen*

Xiao-yingWu1,Jian-ping Li2,Chang-linWu3,Nai-bao Zhuang1,Wu Fan1
(1.Shenzhen Blood Center,Shenzhen,Guangdong 518035,China；2.Liaoning Blood Center, Shenyang,Liaoning 110044,China；3.The Second People's Hospital of Shenzhen, Shenzhen,Guangdong 518035,China)

ObjectiveTo investigate the incidence of anti-D antibody in Rh-negative pregnantwomen.MethodsRh(D)blood group and serum anti-D antibody were tested by micro column gel method.PCR detection of RHD1227A was used for identification of DEL and truly Rh-negative phenotypes.ResultsTotally 196 cases of Rh-negative pregnant women were observed.Among them,56 cases without history of pregnancy had anti-D positive rate of 5.4%(3/56);77 caseswith pregnancy history(excluding the history of birth)had anti-D positive rate of 7.8% (6/77),and 63 cases with childbearing history had anti-D positive rate of 30.2% (19/63);the overall positive rate of anti-D antibody was 14.3% (28/196).There were 41 cases of DEL phenotype detected in all the samples,but anti-D antibody was not found,even in the 12 pregnantwomen who had a history of childbearing.After excluding DEL phenotype,the total anti-D positive rate in the 155 truly Rh-negative cases was 18.1%(28/155). Among them,the positive rate of anti-D antibody was 6.4%(3/47)in thewomen with no history of pregnancy,9.7% (6/62)in the women with pregnancy history and 41.3% (19/46)in the cases with reproductive history.ConclusionsNearly half of the truly Rh-negative pregnantwomen with childbearing history have immune response to D antigen. And the pregnantwomen of DEL phenotype do not produce anti-D antibody.

Rh-negative;DEL phenotype;pregnantwomen;anti-D antibody

R457.11

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.07.011

1005-8982（2017）07-0050-04

2016-09-21

廣東省醫(yī)學(xué)研究基金（No：A2015054）；深圳市第二人民醫(yī)院院級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（No：2015L05）