李君，劉恩令

（河北醫(yī)科大學附屬唐山市工人醫(yī)院 婦產(chǎn)科，河北 唐山 063000）

甲狀腺激素受體基因與卵巢癌順鉑耐藥關(guān)系的研究*

李君，劉恩令

（河北醫(yī)科大學附屬唐山市工人醫(yī)院 婦產(chǎn)科，河北 唐山 063000）

目的 探討甲狀腺激素受體基因（THRB）是否為耐藥相關(guān)基因或影響卵巢癌細胞耐藥。方法合成特異性基因探針，利用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）技術(shù)顯示細胞在激素作用下的基因表達差異。結(jié)果THRB的表達在人卵巢癌耐順鉑SKOV3/DDP細胞中的表達量高于非耐藥卵巢癌SKOV3細胞。結(jié)論甲狀腺激素能促進人卵巢癌SKOV3細胞和人卵巢癌SKOV3/DDP耐順鉑細胞的增殖，THRB在卵巢癌耐藥SKOV3/DDP細胞中的表達的量遠高于一般卵巢癌SKOV3細胞，THRB對卵巢癌耐藥起著非常重要的作用，可能是耐藥相關(guān)基因，其機制有必要進一步探討。

甲狀腺激素受體；卵巢癌；順鉑耐藥

卵巢癌在婦科惡性腫瘤中發(fā)病率占第3位，而死亡率居第1位。導致卵巢癌5年生存率不高的一個主要原因是腫瘤細胞對化療藥物發(fā)生耐藥性[1]。卵巢癌化療耐藥不光是當前研究的熱門，亦是卵巢癌治療走出瓶頸的關(guān)鍵。激素是人體組織細胞的重要調(diào)節(jié)物質(zhì)，在腫瘤細胞中，激素對其分裂、成形、遷移及凋亡均有重要調(diào)節(jié)作用，尤其在惡性腫瘤細胞中激素及激素受體基因的表達常常處于非正常狀態(tài)。為探討相關(guān)激素在卵巢癌細胞中是否與鉑類耐藥相關(guān)，本研究選擇了甲狀腺激素受體基因（thyroid hormone receptor，THRB）作為研究對象，分析其在卵巢癌耐藥細胞株（SKOV-3/DDP）的表達及功能，探討其與卵巢癌鉑類耐藥的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 細胞株及其培養(yǎng)

人卵巢癌細胞SKOV-3和人卵巢癌耐順鉑細胞SKOV-3/DDP購自中國醫(yī)學科學院細胞室。培養(yǎng)條件：溫度：37℃；氣相：5%二氧化碳CO2；空氣，95%；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%；McCOY's 5A（100 u/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素）90%。

1.2 激素作用

選擇對數(shù)生長期的細胞，經(jīng)胰酶消化后，用含10%FBS的McCOY's 5A培養(yǎng)基（100 u/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素）調(diào)整濃度為1.5×104個/ml的單細胞懸液，接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，每孔200μl（即每孔細胞數(shù)約為3×104個），于培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)條件37℃，5%CO2，棄上清。SKOV3激素協(xié)同處理組分別加入甲狀腺素，激素含量為lμg/ml的無血清培養(yǎng)液；SKOV3/DDP激素協(xié)同處理組分別加入甲狀腺素，激素含量為lμg/ml的無血清培養(yǎng)液；對照組為不含激素的無血清培養(yǎng)液；空白組為不含細胞無血清培養(yǎng)液，每孔均為200μl。每組10個重復(fù)孔,37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24和48 h，倒置顯微鏡下觀察。

1.3 特異性探針制備

根據(jù)NCBI收錄的基因序列，制備THRB激素類基因的特異性生物素標記基因探針。運用Primer 5.0設(shè)計特異性引物，正向引物：CTGAGTTGAAGGA AATGC；反向引物：AGGAGCTTGAGGATCTAA。使得擴增產(chǎn)物在500～800 bp，另外再設(shè)計特異性探針：FAM-AAGCGTCCTCCAGCCATCA-BHQ1。使得探針能夠與擴增產(chǎn)物匹配，同時使用生物信息學軟件對引物及探針進行同源性檢驗，排除假陽性擴增以及熒光。

1.4 細胞總RNA的提取

Trizoi法按照試劑盒說明書進行細胞總RNA的提取。

1.5 TaqMan實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)

設(shè)計特異性引物和熒光探針（TaqMan探針），先用隨機引物RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后進行實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase，qRT-PCR）。TaqMan探針是寡核苷酸探針，其被設(shè)計成靶向正反向引物配對的引物序列。熒光探針連接5'末端和3'末端的猝滅劑。完全匹配的探針與靶序列熒光團所發(fā)出的熒光3'末端和猝滅劑被接近淬滅，但延長反應(yīng)過程中，qTaq DNA聚合酶的5'探針殺滅核酸外切酶的活性，使熒光團和淬滅劑分離，檢測到的熒光強度不斷增加，擴增循環(huán)數(shù)，釋放的熒光團不斷積累，熒光強度與擴增產(chǎn)物的數(shù)目成正比。

1.6 MTT法測定細胞存活力

SKOV3/DDP及SKOV3均在1640培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，待懸浮生長至對數(shù)生長期時，調(diào)整細胞濃度至4×103個/ml混勻后加進96孔板中，每孔100μl，每組共計10孔，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；實驗組分別加入含有濃度為10、100和1 000 ng/ml的甲狀腺素和2.5μg/ml的順鉑無血清培養(yǎng)液；對照組為不含激素的無血清培養(yǎng)液，在第24、48和72 h，采用MTT法檢測各組細胞的OD值，計算增殖抑制率。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，每個實驗重復(fù)3次，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差（±s）表示，使用t檢驗檢測用藥組與對照組之間mRNA表達差異及甲狀腺激素作用前后細胞的增殖情況。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 THRB作用下SKOV3及SKOV3/DDP細胞形態(tài)比較

倒置顯微鏡下觀察：SKOV3、SKOV3/DDP細胞均貼壁生長，SKOV3細胞多呈圓形，上皮細胞樣，有少量長棍形、多邊形，能看見細胞核，邊界清楚，折光性好。SKOV3/DDP細胞較SKOV3細胞大呈多角形，神經(jīng)元細胞樣，體積膨脹，核仁多，細胞質(zhì)可見顆粒狀囊泡，邊界模糊，折光性差。

SKOV3細胞生長到對數(shù)生長期所用時間為4 d，SKOV3/DDP細胞生長到對數(shù)生長期所用時間為6 d。甲狀腺激素協(xié)同作用對SKOV3及SKOV3/DDP細胞的生長均有明顯促進作用，倒置顯微鏡下觀察：2種細胞均在作用48 h后到達對數(shù)生長期。激素處理的細胞液出現(xiàn)了不同程度的變化，卵巢癌耐順鉑細胞的培養(yǎng)液顏色變淺速度加快，原來3 d換液1次，激素處理后達到2 d換液1次，卵巢癌細胞培養(yǎng)液換液時間也比對照組提前，但與卵巢癌細胞相當。見圖1。

2.2 設(shè)計的基因探針及引物

根據(jù) Gen Bank數(shù)據(jù)庫THRB（批準號：NM001252634）和內(nèi)參照基因β-actin（ACTB批準號：NM001101)，應(yīng)用Primer Express 5.0設(shè)計各基因正反向引物和探針，并應(yīng)用BLAST引擎對設(shè)計的每條引物進行特異性分析，確?；驇烊祟愐阎钠渌蚺c每條引物比對無高度同源性。根據(jù)濾波器的波長定量PCR儀，TaqMan熒光探針熒光作為熒光報告基因，BHQ1為猝滅基因。引物和探針均由上海生物工程股份有限公司合成。

2.3 THRB在人卵巢癌SKOV-3細胞與耐順鉑SKOV-3/DDP細胞中的表達

qRT-PCR反應(yīng)液采用大連寶生物工程股份有限公司的Premix Ex Taq試劑盒，引物和探針由上海生物工程股份有限公司合成。循環(huán)參數(shù)：95℃1min，1個循環(huán)；95℃10 s，60℃30 s，40個循環(huán)，每個循環(huán)后檢測熒光。結(jié)果如下圖所示，THRB激素受體基因在耐順鉑SKOV-3/DDP細胞及其人卵巢癌SKOV-3細胞中均有表達。為了明確THRB在人卵巢癌SKOV-3細胞及其耐順鉑SKOV-3/DDP細胞中表達有無差異，本實驗提取了激素干預(yù)后人卵巢癌SKOV-3細胞及其耐順鉑SKOV-3/DDP細胞中的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，進行THRB在人卵巢癌SKOV-3細胞與耐順鉑SKOV-3/DDP細胞的定量分析。定量分析結(jié)果見表1及圖2、3：在甲狀腺激素作用下，THRB表達水平均有提高，在耐順鉑SKOV3/DDP細胞中的表達水平高于其親本細胞人卵巢癌SKOV3細胞。（t=2.2553，P=0.0436）。

2.4 甲狀腺激素作用前后SKOV3和SKOV3/DDP細胞的增殖情況

甲狀腺素對卵巢癌SKOV3細胞及耐順鉑SKOV3/ DDP細胞的體外生長有明顯的促進作用，隨著激素濃度的增加及作用時間的延長，其對細胞生長的促進作用增加。SKOV3細胞在不同濃度激素作用24、48和72 h作用后，其細胞增殖情況采用重復(fù)測量方差進行分析，結(jié)果：①不同時間點的細胞增殖情況有差別（F=252.935，P=0.000）；②不同濃度激素作用后細胞的增殖情況有差別（F=39.372，P=0.000），激素濃度越大，細胞增殖作用越明顯；③不同濃度激素作用下的細胞增殖趨勢有差別（F=28.846，P=0.000）。SKOV3/DDP細胞在不同濃度激素作用24、48和72 h后細胞增殖情況采用重復(fù)測量方差分析，結(jié)果：①不同時間點的細胞增殖情況有差別（F=607.076，P=0.000）；②不同濃度激素作用后細胞的增殖情況有差別（F=57.965，P=0.000），激素濃度越大，細胞增殖作用越明顯；③不同濃度激素作用下的細胞增殖趨勢有差別（F=61.248，P=0.000）。見表2、圖4。

表1 THRB相對初始拷貝數(shù) （n=3，±s）

表1 THRB相對初始拷貝數(shù) （n=3，±s）

組別THRB表達水平無激素作用48 h SKOV3 0.0449±0.0115無激素作用48 h SKOV3/DDP 0.0497±0.0108 1 000 ng/m l激素作用48 h SKOV3 0.0515±0.0127 1 000 ng/m l激素作用48 h SKOV3/DDP 0.0938±0.0299

圖1 THRB作用下SKOV3及SKOV3/DDP細胞的形態(tài)比較

圖2 內(nèi)參基因的擴增曲線以及標準曲線

圖3 THRB的擴增曲線以及標準曲線

表2 不同濃度激素作用不同時間后各組細胞的吸光度值比較

圖4 激素對卵巢癌細胞增殖的影響

3 討論

卵巢癌起病隱匿，75%的患者確診時已為晚期并伴有廣泛轉(zhuǎn)移,手術(shù)常不能完全切除，故目前最常用的治療方案為腫瘤減滅術(shù)+以鉑類為基礎(chǔ)的藥物聯(lián)合化療[2]；雖然80%患者對以鉑類為基礎(chǔ)的一線化療方案敏感[3]，但3年內(nèi)復(fù)發(fā)率卻高達60%～70%以上；其中大部分患者在一線化療后出現(xiàn)繼發(fā)性鉑類耐藥,最終導致復(fù)發(fā)[4]。而鉑類耐藥最近研究較多，MARIYA等[5]研究表明，免疫逃逸可能是卵巢癌鉑類耐藥的機制之一。而大量研究證明，卵巢癌是一種激素依賴性腫瘤，一旦人體多種激素分泌失調(diào)會導致人體對細胞的正常調(diào)控作用出現(xiàn)失調(diào)，進而導致細胞自主增殖或凋亡減少，進而導致卵巢癌產(chǎn)生耐藥。甲狀腺激素對鉑類耐藥的卵巢癌細胞的影響較少，國外研究表明[6]，卵巢癌上皮組織中TSHRmRNA表達降低而蛋白表達升高,此項驗研究證明卵巢癌患者甲狀腺刺激素受體蛋白的轉(zhuǎn)錄和表達異常。順鉑是治療卵巢癌的主要化療藥物，正是因為順鉑的出現(xiàn)使卵巢癌治療出現(xiàn)了重大轉(zhuǎn)機，使卵巢癌5年生存率有了較大改觀。而一些患者在治療一段時間后會產(chǎn)生耐藥，這導致治療失敗，影響了預(yù)后。因此為進一步探討順鉑耐藥的機制，從而為克服耐藥提供理論依據(jù)，縱多學者從多方面進行的深入研究，本研究從激素角度探討卵巢癌鉑類耐藥機制，結(jié)果表明，THRB的表達在人卵巢癌耐順鉑SKOV3/DDP細胞中的表達量高于卵巢癌SKOV3細胞。因此認為甲狀腺激素能促進人卵巢癌SKOV3細胞和人卵巢癌SKOV3/DDP耐順鉑細胞的增殖，THRB在卵巢癌耐藥SKOV3/DDP細胞中的表達量也高于一般卵巢癌SKOV3細胞，THRB對卵巢癌耐藥起著非常重要的作用，可能是耐藥相關(guān)基因。

卵巢癌鉑類耐藥機制復(fù)雜而多樣，涉及多藥耐藥基因及多種激素類基因。本研究為探討激素類基因在卵巢癌鉑類耐藥中的作用進行了初步研究，為將來進一步探討更深層次的機制奠定了一定的基礎(chǔ)。

[1]BALCH C,HUANG TH,BROWN R,et al.The epigenetics of ovarian cancer drug resistance and resensitization[J].American Journal of Obstetrics and Gynecology,2004,191(5):1552-1572.

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（張西倩 編輯）

Relationship betweenTHRBand cisp latin resistance in ovarian cancer cells*

Jun Li,En-ling Liu
(Department of Gynecology and Obstetrics,Tangshan Gongren Hospital Affiliated to HebeiMedical University,Tangshan,Hebei063000,China)

ObjectiveTo investigate whether thyroid hormone receptor gene(THRB)is a drug resistance related gene in ovarian cancer cells.MethodsThe specific gene probe was synthesized.RT-PCR technique was used to display the difference of gene expression under the action of thyroid hormone.ResultsThe expression ofTHRBin the human ovarian cancer SKOV3/DDP cells was significantly higher than that in the non-resistant ovarian cancer SKOV3 cells.ConclusionsThyroid hormone can promote the proliferation of human ovarian cancer SKOV3 and SKOV3/DDP cells.The expression ofTHRBin the ovarian cancer SKOV3/DDP cells ismuch higher than that in the non-resistant ovarian cancer SKOV3 cells.THRBmay play a very important role in drug-resistance of ovarian cancer and may be a drug resistance related gene,and itsmechanism is necessary to be further explored.

thyroid hormone receptor,ovarian cancer;platinum resistance

R 737.31

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.07.008

1005-8982（2017）07-0036-05

2016-11-27

河北省醫(yī)學重點科技研究計劃（No：1020140385）

劉恩令，E-mail：enling111@sina.com；Tel：13832828669