蔣 紅，何 雯，張 晨

（新疆醫(yī)科大學1.公共衛(wèi)生學院，2.第五附屬醫(yī)院，新疆烏魯木齊 830011）

心肌肥厚是人類心血管疾病的主要危險因子，在醫(yī)學界早已形成共識，主要表現(xiàn)為心肌細胞蛋白增加、細胞體積增大、間充質成分改變以及心臟順應性和循環(huán)功能降低，且多種因素參與了心肌肥厚的形成［1］。心肌肥厚時，心肌標志蛋白表達水平升高，發(fā)生心肌細胞肥大，同時伴隨有心肌細胞外間充質增多、心臟質量增加，還伴有心肌成纖維細胞的增殖與轉化，以及心肌間充質纖維化等病理改變，病理性心肌肥厚最終將導致心肌病和心衰［2］。其中，腎素-兒茶酚胺系統(tǒng)是與心肌肥厚發(fā)生發(fā)展有直接關系的神經體液因素。去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）是兒茶酚胺中的一種，能激活相應受體與G蛋白（Gq和Gs蛋白受體）偶聯(lián)，激活相應的細胞信號傳導通路，參與心肌肥厚的發(fā)生，表現(xiàn)為細胞蛋白含量、蛋白合成及體積均增大，但細胞數(shù)目無明顯變化，說明對細胞增殖沒有影響。NE通過激活α1和β腎上腺素能受體。α1受體激活后，可激活細胞內磷酸酯酶C（phosphatase C，PLC），水解磷脂酰肌醇4，5-雙磷酸（phosphatidylinositol 4，5-bisphosphate，PIP2），升高肌醇三磷酸（inositol triphosphate，IP3）和甘油二酯（diglyceride，DAG），DAG的升高可激活蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）。β受體激活后可活化腺苷酸環(huán)化酶（adenyl cyclase，AC），使ATP轉變成cAMP，導致細胞內cAMP蓄積，進而激活PKA。PKA可使許多在心臟收縮中起作用的蛋白磷酸化，包括L型鈣通道蛋白、肌質網受體蛋白和肌鈣蛋白等，增強它們的活性，進而增強心肌的收縮。PKC和PKA的激活是導致心肌肥厚的關鍵步驟，二者都可激活MAPK信號轉導通路，引起心肌肥厚［3-4］。異葉青蘭總黃酮（total flavonoids ofDracocephalum heterophyllumbenth，TFDH）是維吾爾族及藏族民間傳統(tǒng)用藥，有研究表明，其可治療高血壓、肺熱咳嗽和支氣管炎等，具有良好的抗氧化、保護心肌、治療冠心病和降血壓等作用［5］。鑒于此，本研究擬在NE誘導的新生SD大鼠心肌細胞肥大模型基礎上，觀察TFDH對心肌細胞肥大作用的影響，從離體水平上探討TFDH對心肌細胞肥厚的抑制作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

出生0～3 d的SD大鼠，由新疆醫(yī)科大學實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（新）2003-0001。飼養(yǎng)于新疆醫(yī)科大學SPF環(huán)境，許可證號：SCXK（新）2011-0004。

1.2 藥品、試劑和主要設備

TFDH由中國科學院新疆理化技術研究所提供，提取率為3.76 mg·g-1，經鑒定總黃酮含量為57.97%；D-Hanks溶液、胰蛋白酶、5-溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU）、CCK-8檢測試劑盒和NE均購自美國Sigma公司；Ⅱ型膠原酶購自美國Worthington公司；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco公司；抗心肌肌鈣蛋白T抗體和Dy Light594標記驢抗大鼠IgG二抗購自英國Abcam公司；逆轉錄酶試劑盒購自德國Thermo科技有限公司；驢血清為北京索萊寶生物技術有限公司產品；NO測定試劑盒和Ca2+熒光探針Fluo-3 AM為江蘇碧云天生物技術研究所產品；NOS測定試劑盒、Ca2+-ATP酶測定試劑盒為南京建成生物工程研究所產品；定量PCR試劑盒購置美國ABI公司。LSM 710共聚焦顯微鏡購自德國Leica公司；逆轉錄儀為伯樂生命醫(yī)學產品（上海）有限公司Bio-Rad產品；定量PCR儀為美國ABI 7500產品。

1.3 新生大鼠原代心肌細胞分離和培養(yǎng)［6］

無菌開胸，迅速取出心臟，置于盛有4℃的D-Hanks溶液中，減去整個心臟的1/3～1/2，留心尖部心室組織，剪碎后加入0.1%的胰蛋白酶溶液，4℃振蕩過夜。次日加入與胰蛋白酶等量的含胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，終止消化后，加入濃度為0.08%的Ⅱ型膠原酶置37℃水浴箱，以80次·min-1的頻率震蕩10 min，收集上清液，并以等體積的含胎牛血清的培養(yǎng)液終止消化，此步驟重復4～5次，到組織基本消失為止。完畢后用200目的尼龍篩網除去殘留的組織塊，接種于100 mm培養(yǎng)皿中，靜置90min差數(shù)貼壁后，取上清液，加入BrdU0.1mmol·L-1抑制非心肌細胞增殖，吹打均勻，細胞分別以3×106L-1密度接種于25 mm培養(yǎng)瓶、1.5×106L-1接種于60 mm培養(yǎng)皿、3×108L-1接種于96孔板和1×106L-1接種于6孔板中，置于5%CO2，37℃孵箱中培養(yǎng)。

1.4 細胞分組及處理

將上述細胞用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h后，換無血清培養(yǎng)液，按照處理分為細胞對照組、NE模型組和NE+TFDH組。細胞對照組和NE模型組加入PBS，NE+TFDH組分別加TFDH 10，25和50 μmol·L-1作用30 min，而后，除細胞對照組外，各組分別加入NE 2 μmol·L-1作用48 h。

1.5 CCK-8法檢測細胞存活率

將接種在96孔板的各組原代心肌細胞用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h后，換無血清培養(yǎng)液，按1.4方法加藥處理后，用PBS洗3遍，每孔加入10 μL CCK-8檢測液孵育2 h，于酶標儀430 nm波長處檢測吸光度（A）值。檢測過程中設不加細胞的調零孔。每組設5個復孔。細胞存活率（%）=（給藥組A430nm-調零組A430nm）（/細胞對照組A430nm-調零組A430nm）×100%。

1.6 RT-PCR法檢測心肌細胞心房利鈉肽（atrial natriuretic peptide，ANP）和 β-肌球蛋白重鏈（ βmyosin heavy chain， β-MHC）mRNA 表達水平

將接種在60 mm培養(yǎng)皿中的各組原代心肌細胞用含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h后，換無血清培養(yǎng)液，按1.4處理細胞48 h后，加入TRIzol試劑1 mL裂解細胞，收集細胞裂解液，氯仿抽提，異丙醇沉淀，用DEPC處理水回收總RNA，紫外分光光度計A260nm/A280nm鑒定其濃度及純度，并逆轉錄成cDNA。所用PCR引物由上海生工有限公司設計，反應條件：95℃ 30 s，95℃ 5 s，62℃ 20 s，40個循環(huán)。取1 μg cDNA進行RT-PCR檢測，將甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內參因子，以2-ΔΔct法計算目標基因的相對表達水平。引物序列見表1。

Tab.1 Primer sequence for PCR

1.7 激光共聚焦進行心肌細胞鑒定及心肌細胞表面積檢測

取出接種在6孔板的心肌細胞，按1.4方法藥物處理48 h后，棄培養(yǎng)基，用PBS清洗細胞3次，用4%多聚甲醛固定15 min，再用0.25%Triton X-100透化10 min，驢血清室溫封閉30 min，加入抗心肌肌鈣蛋白T抗體（1∶500）室溫孵育1 h。加入熒光二抗（1∶1000）避光室溫孵育1 h。避光加入0.1 mL DAPI 50 μg·L-1作用3 min。心肌細胞圖像通過 LSM 710激光共聚焦儀獲取。每次獨立實驗中，每組各取3孔細胞進行處理。每孔細胞樣品隨機獲取4個不同視野的圖片，每個圖片取10個細胞，并通過Image-Pro Plus 6.0軟件測量3次實驗的細胞表面積，以μm2表示面積。

1.8 心肌細胞［Ca2+］i濃度和Ca2+-ATP酶活性測定

取出接種在6孔板的心肌細胞，按1.4方法藥物處理48 h后，棄培養(yǎng)基，用PBS清洗3次，加入鈣離子探針 Fluo-3/AM（終濃度為 5 μmol·L-1）置于5%CO2，37℃培養(yǎng)箱內孵育 45～60 min，PBS清洗3次，加入培養(yǎng)基，采用激光共聚焦顯微鏡每組隨機選擇20個細胞進行動態(tài)掃描，通過分析軟件分析細胞內鈣離子熒光強度。同時，取出接種在60 mm培養(yǎng)皿中的各組原代心肌細胞，按1.4方法藥物處理48 h后，用胰酶消化細胞，胎牛血清培養(yǎng)基中和胰酶，生理鹽水稀釋后離心20 min，吸出上清液后破碎細胞，酶促反應測定磷的含量，根據標準曲線計算酶活性。嚴格按試劑盒說明書進行操作。

1.9 細胞勻漿液中一氧化氮（nitric oxide，NO）濃度和一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）活性的測定

取出接種在25 mm培養(yǎng)瓶中的心肌細胞，按1.4方法藥物處理48 h后，收集細胞并制成細胞勻漿液。采用比色法測定NO濃度和NOS活性，嚴格按照試劑盒說明書操作。用酶標儀于540 nm測定NO2-與Griess試劑反應后溶液的吸光度，根據標準曲線計算每孔NO水平。在530 nm測定吸光度，根據吸光度計算NOS活性。

1.1 0統(tǒng)計學分析

實驗結果數(shù)據采用x±s表示，用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據進行分析。兩組之間比較使用t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，各組間的兩兩比較用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 TFDH對NE誘導肥大心肌細胞存活率的影響

CCK-8檢測結果顯示，與細胞對照組比較，NE模型組細胞存活率明顯下降（P＜0.05）；與NE模型組比較，NE+TFDH 25和50 μmo·L-1組細胞存活率顯著升高（P＜0.05），且具有濃度依賴性（r=0.998，P＜0.05）（圖1）。表明TFDH可使NE誘導肥大心肌細胞的存活率升高。

Fig.1 Effect of total flavonoids of Dracocephalum heterophyllum benth（THDH）on survival rate of myocar?dial cells induced by norepinephrine（NE）.The cells were cultured for 30 min with TFDH 0,10，25 and 50 μmol· L-1，respectively，then NE 2 μmol·L-1was added and cultured for 48 h.±s，n=5.＊P＜0.05，compared with cell control group；#P＜0.05 ，compared with NE group.

2.2 TFDH對NE誘導肥大心肌細胞ANP和 β-MHC mRNA表達的影響

RT-PCR檢測結果顯示（表2），與細胞對照組相比，NE模型組ANP和β-MHC的mRNA表達均上調，分別增加2.14±0.42和（2.03±0.19）倍（P＜0.05）；與NE 模型組比較，NE+TFDH 10，25和50 μmol·L-1組ANP和 β-MHC 的mRNA表達均下調，其中以NE+TFDH 25和50 μmol·L-1處理組較為明顯（P＜0.05），且具有濃度依賴性（r=-0.995，P＜0.05；r=-0.997，P＜0.05）。結果表明，TFDH可阻斷由NE誘導的心肌細胞ANP和β-MHC mRNA表達上調。

Tab.2 Effect of TFDH on expression of mRNA of atrial natriuretic peptide（ANP）and β-myosin heavy chain（ β-MHC） to myocardial cells induced by NE

2.3 TFDH對NE誘導的肥大心肌細胞表面積的影響

Fig.2 Effect of TFDH on surface area of myocardial cells induced by NE observed by phase contrast microscopy.See Fig.1 for the cell treatment.A：cell control group；B：NE 2 μmol·L-1；C：NE+TFDH 10 μmol·L-1group；D：NE+TFDH 25 μmol·L-1group；E：NE+TFDH 50 μmol·L-1group.

使用Image-Pro Plus 6.0軟件計算各組心肌細胞表面積結果顯示（圖2），與細胞對照組心肌細胞表面積（178±29）μm2相比，NE 模型組心肌細胞明顯增大，為（274±38）μm2（P＜0.05）；與 NE模型組比較，NE+TFDH 10，25和50 μmol·L-1組心肌細胞表面積分別為242±43，223±32和（201±30）μm2，均明顯縮?。≒＜0.05）。表明TFDH可緩解由NE誘導的心肌細胞表面積增大。

2.4 TFDH對NE誘導肥大心肌細胞內［Ca2+］i和Ca2+-ATP酶活性的影響

與細胞對照組比較，NE模型組明顯使心肌細胞［Ca2+］i增加（P＜0.05）和 Ca2+-ATP 酶的活性下降；與 NE模型組比較，NE+TFDH 10，25和50 μmol·L-1組均對心肌細胞［Ca2+］i有明顯的抑制作用（P＜0.05），使Ca2+-ATP酶活性明顯增加（P＜0.05），并呈濃度依賴性（r=0.995，P＜0.05）（表3）。表明TFDH可抑制由NE誘導的心肌細胞［Ca2+］i增加和Ca2+-ATP酶活性降低。

Tab.3 Effect of TFDH on［Ca2+］iand activity of Ca2+-ATP of hypertrophic cardiomyocytes induced by NE

2.5 TFDH對NE誘導的肥大心肌細胞NO濃度和NOS活性的影響

比色法測定結果顯示（表4），與細胞對照組相比，NE模型組心肌細胞NO濃度和NOS活性明顯降低（P＜0.05）；與 NE 2模型組比較，NE+TFDH 10，25和50 μmol·L-1組心肌細胞NO 濃度和NOS活性明顯增加（P＜0.05），并呈濃度依賴性（r=0.997，P＜0.05）。表明TFDH可返轉NE誘導的心肌細胞NO濃度和NOS活性降低。

Tab.4 Effect of TFDH on concentration of nitric oxide（NO）and activity of nitric oxide synthase（NOS）of hypertrophic cardiomyocytes induced by NE

3 討論

本研究結果顯示，TFDH能明顯提高由NE誘導的肥大心肌細胞存活率、抑制心肌肥大標志物ANP和β-MHC的mRNA表達以及減小肥大心肌細胞表面積，提示其對肥大心肌細胞起到了明顯的保護作用。筆者課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，TFDH可降低腎血管性高血壓大鼠的血壓，改善左心室舒縮功能和心肌收縮力，其機制可能與降低血循環(huán)、心肌組織和腎組織中的內皮素水平，升高NO水平，調節(jié)體內內皮素與NO平衡狀態(tài)有關［7-8］。

本研究中，由NE誘導的心肌細胞肥大模型組中，NO濃度和NOS的活性均減低，提示NE一方面可引起心肌細胞肥大，同時可減低NO濃度和NOS活性，而這些作用均可能與α1受體和酪氨酸蛋白激酶受體不敏感的G蛋白介導有關，通過增加外源性NO可防止NE誘導的心肌細胞肥大反應，提示NO除引起冠脈舒張、冠脈血流量增加和心肌收縮力下降外，可能在防止心肌肥厚反應中起重要作用［9-11】。本研究結果顯示，TFDH抑制NE誘導的心肌細胞肥大的同時，明顯升高心肌細胞勻漿液中NO的濃度和NOS的活性，而心臟中NO濃度升高可引起冠脈舒張血流量增加等，并抑制心肌肥厚。提示TFDH對心肌肥厚的保護作用可能與心臟NO濃度有關。

心肌肥大是一種由多種因素參與調節(jié)的復雜動態(tài)過程，現(xiàn)已證實磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶通路、鈣調神經磷酸酶通路、MAPK通路、NO/cGMP通路等多條信號通路均參與其病理過程［12-13］。在分子水平表現(xiàn)為心肌重構時心肌細胞核內基因表達模式改變、BNP和ANP表達上調、胚胎型成熟基因表達下降，以及心肌蛋白合成增加、單個細胞蛋白含量增高、心肌細胞肥大和收縮力減弱。本研究結果顯示，TFDH能明顯降低NE誘導的心肌細胞ANP和β-MHC mRNA表達，提示TFDH抑制心肌細胞肥大作用與多條信號傳導通路有關。同時，心肌肥厚常伴有肌漿網鈣泵活性降低、Ca2+紊亂等，而心肌肌漿網Ca2+-ATP通過攝取和釋放Ca2+在心臟的舒張活動中起重要作用。在心肌興奮收縮中，Ca2+參與了心肌動作電位的形成，同時Ca2+還能直接與肌絲結合，引起心肌收縮。當細胞內Ca2+濃度降低時，Ca2+從肌鈣蛋白上解離下來，引起心肌舒張。Ca2+是細胞內最重要的第二信使，通過出入胞漿傳遞多種生物信號調節(jié)細胞的生長發(fā)育等途徑，其中包括調節(jié)心臟功能［14］。Ca2+也是心肌細胞肥大反應的重要信號通路，而鈣調磷酸酶（calcineurin，CaN）和鈣調素依賴性蛋白激酶Ⅱ（calmodulin dependent protein kinase，CaMKⅡ）是重要調節(jié)信號。胞內Ca2+信號的改變是肥厚反應的首要刺激，在心臟肥厚和基因表達中發(fā)揮中心作用，Ca2+依賴的CaN/NFAT途徑和CaMKⅡ/HDAC途徑均參與其中［13，15】。本研究結果顯示，TFDH抑制NE誘導的心肌細胞肥大的同時明顯降低心肌細胞Ca2＋濃度和升高Ca2+-ATP酶的活性，并呈濃度依賴性，提示TFDH對心肌細胞Ca2＋濃度和Ca2+-ATP酶活性的調節(jié)可能是其抗心肌肥厚的機制之一。

綜上所述，本研究顯示，TFDH對NE誘導的肥大心肌細胞具有明顯的保護作用，其機制可能與促進NO釋放、調節(jié)細胞內Ca2+濃度和Ca2+-ATP酶活性有關。其他的作用機制及細胞傳導信號通路還有待進一步研究。

參考文獻：

［1］ Kawai H，Mohan A，Hagen J，Dong E，Armstrong J，Stevens SY，et al.Alterations in cardiac adrenergic terminal function and beta-adrenoceptor density in pacing-induced heart failure［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2000，278（5）：H1708-H1716.

［2］ Yamamoto S，Kita S，Iyoda T，Yamada T，Iwamoto T.New molecular mechanisms for cardiovascular disease：cardiac hypertrophy and cell-volume regulation［J］.J Pharmacol Sci，2011，116（4）：343-349.

［3］ Barry SP，Davidson SM，Townsend PA.Molecular regulation of cardiac hypertrophy［J］.Int J Biochem Cell Biol，2008，40（10）：2023-2039.

［4］ Liu XL，Xing XW，Huang LH，Huang ZJ，Yuan H.Research advances on the role of β1-adrenergic receptor in heart failure，hypertension and myocardial fibrosis［J］.Chin Pharmacol Bul（l中國藥理學通報），2013，29（12）：1640-1644.

［5］ X，Janifer Raj，Chaurasia OP，Vajpayee PK，Pal Murugan M.Antioxidative activity and phytochemical investigation on a high altitude medicinal plantDracocephalum heterophyllumBenth［J］.Phcog J，2010，2（6）：112-117.

［6］ Qin XY，Lu XZ，Zhang H，Yang YQ，Yang XH，Zheng HJ，et al.Influence of zofenopril to rats hypertrophic cardiomyocytes on ACE2 and Mas［J］.Chin J Clin Pharmacol（中國臨床藥理學雜志），2014，30（1）：11-13.

［7］ He W，Yiming WLY，Si LJ，Miao N，Aisa HJ Akber，Kerram Parhat.Effects ofDracocephalum hetero?phyllumBenth flavonoid on cardiac hypertrophy of hypertension rats［J］.Chin Pharmacol Bul（l中國藥理學通報），2013，29（7）：1008-1011.

［8］ Ma XL.Effect ofDracocephalum heterophyllumBenth of the renovascular hypertensive rats andmechanisms investigation（異葉青蘭總黃酮對腎性高血壓大鼠的影響和作用機制研究）［D］.Urumqi：Xinjiang Medical University（新疆醫(yī)科大學），2012.

［9］ Haynes MP，Li L，Sinha D，Russell KS，Hisamoto K，Baron R，et al.Src kinase mediates phosphatidylinositol 3-kinase/Akt-dependent rapid endothelial nitric-oxide synthase activation by estrogen［J］.J Biol Chem，2003，278（4）：2118-2123.

［10］ Cozza EN，Gomez-Sanchez CE，F(xiàn)oecking MF，Chiou S.Endothelin binding to cultured calf adrenal zona glomerulosa cells and stimulation of aldosterone secretion［J］.J Clin Invest，1989，84（3）：1032-1035.

［11］ Shah MS，Brownlee M.Molecular and cellular mechanisms of cardiovascular disorders in diabetes［J］.Circ Res，2016，118（11）：1808-1829.

［12］ Klawitter J，Klawitter J，Agardi E，Corby K，Leibfritz D，Lowes BD，et al.Association of DJ-1/PTEN/AKT-and ASK1/p38-mediated cell signalling with ischaemic cardiomyopathy［J］.Cardiovasc Res，2013，97（1）：66-76.

［13］ Liou SF，Hsu JH，Chen YT，Chen IJ，Yeh JL.KMUP-1 attenuates endothelin-1-induced cardiomyocyte hypertrophy through activation of heme oxygenase-1 and suppression of the Akt/GSK-3β，calcineurin/NFATc4 and rhoA/ROCK pathways［J］.Molecules，2015，20（6）：10435-10449.

［14］ Kohlhaas M，Zhang T，Seidler T，Zibrova D，Dybkova N，Steen A，et al.Increased sarcoplasmic reticulum calcium leak but unaltered contractility by acute CaMK Ⅱ overexpression in isolated rabbit cardiac myocytes［J］.Circ Res，2006，98（2）：235-244.

［15］ Ito H.Endothelins and cardiac hypertrophy［J］.Life Sci，1997，61（6）：585-593.