齊 越， 向紹杰， 姜 鴻， 李紀(jì)彤， 秦文艷， 劉小虎， 韋 丹， 張冰冰， 賈 冬

海人藻酸致急慢性癲癇模型中Nrf2的變化及其對神經(jīng)元的影響

齊 越1， 向紹杰1， 姜 鴻1， 李紀(jì)彤3， 秦文艷1， 劉小虎1， 韋 丹2， 張冰冰2， 賈 冬2

目的 探討海人藻酸致急慢性癲癇模型中Nrf2的變化及其對神經(jīng)元的影響。方法 大鼠海馬內(nèi)注射濃度為(1 μg/μl)海人藻酸(KA)1.0 μl后，隨機(jī)分為模型24 h組(急性模型組)及模型28 d組(慢性模型組)，假手術(shù)組注射等體積的生理鹽水，每組10只。尼氏染色法觀察神經(jīng)元的變化；免疫組化及免疫印跡法測定Nrf2的表達(dá)。結(jié)果 尼氏染色結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型24 h組與模型28 d組尼氏小體均減少，但以模型28 d組減少顯著；免疫組化及免疫印跡結(jié)果表明，模型24 h組的表達(dá)增加，模型28 d組表達(dá)則減少。結(jié)論 Nrf2在急性模型表達(dá)上調(diào)，具有抗氧化作用，進(jìn)而保護(hù)神經(jīng)元；慢性模型中則不具有抗氧化作用，神經(jīng)元受損。

癲癇; 海人藻酸； Nrf2

氧化應(yīng)激是指體內(nèi)的氧化作用與抗氧化作用失衡所致，目前許多疾病的發(fā)生均與氧化應(yīng)激有關(guān)，如：癲癇、多發(fā)性硬化、帕金森病及肌萎縮性側(cè)索硬化等。大量研究發(fā)現(xiàn)，癲癇發(fā)生時常伴有非?；钴S的自由基活動[1～3]。因此，清除自由基成為阻斷癲癇發(fā)生的又一新領(lǐng)域。Nrf2-ARE通路是體內(nèi)內(nèi)源性抗氧化的一條重要通路，Nrf2是參與調(diào)節(jié)機(jī)體抗氧化應(yīng)激過程重要轉(zhuǎn)錄因子，研究證明，激活Nrf2-ARE信號通路可以有效地減輕氧化應(yīng)激損傷從而保護(hù)神經(jīng)元。因此本實驗考察了Nrf2對海人藻酸致急慢性癲癇模型中神經(jīng)元的影響，為闡明癲癇的病理生理機(jī)制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與試劑 選擇健康雄性SPF級Wistar大鼠40只，體重180～200 g，遼寧長生生物技術(shù)有限公司提供[動物許可證號：SCXK(遼)2010-0001]。動物于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院實驗動物中心飼養(yǎng)，許可證號：SYXK(遼):2010-0003。飼養(yǎng)室溫度：20 ℃～23 ℃，飼養(yǎng)室濕度：50%～60%。海人藻酸(KA)(Sigma公司)，一抗(Nrf2，北京博奧森生物試劑公司)，免疫組化試劑盒(武漢博士德生物技術(shù)有限公司)，甲苯胺藍(lán)，Nonident P40，EGTA，HEPES，DTT(Solarbio公司)，EDTA(Amresco公司)。

1.2 模型制備及分組 參考文獻(xiàn)并進(jìn)行改進(jìn)[4～6]，大鼠腹腔注射水合氯醛(350 mg/kg)麻醉后，固定于腦立體定位儀上，碘酒、酒精消毒，沿顱頂正中線做3～4 cm的手術(shù)切口，逐步分離骨膜，尋找囟門位置，以囟門為零點，向后5.7 mm，中線旁開4.6 mm，深約4.3 mm。牙科鉆刺破顱骨后，微量進(jìn)樣器垂直進(jìn)針，緩慢勻速地注射濃度為(1 μg/μl)KA 1.0 μl，留針5 min，待KA充分彌散后緩慢撤針(假手術(shù)組大鼠注射等體積的生理鹽水)，碘伏酒精再次消毒后，縫合皮膚。從注入腦內(nèi)KA后的時間點算起，4 h內(nèi)大鼠達(dá)到Racine分級的Ⅳ以上為造模成功。判斷癲癇發(fā)作程度按照Racine[7]制定的分級法：0級：正常，無任何反應(yīng)；Ⅰ級：面部出現(xiàn)抽搐、眨眼、咀嚼、哈欠、胡須顫抖；Ⅱ級：出現(xiàn)點頭動作、頸部肌肉抽動、頻繁的出現(xiàn)“濕狗樣動作”；Ⅲ級：出現(xiàn)一側(cè)前肢陣攣；Ⅳ級：出現(xiàn)雙側(cè)前肢陣攣、后肢站立；Ⅴ級：雙側(cè)前肢陣攣、后肢站立、失去平衡、跌倒。將造模成功的大鼠隨機(jī)分為急性模型組(模型成立后24 h)及慢性模型組(模型成立28 d后，每組10只，假手術(shù)組10只。

1.3 標(biāo)本制備 各組大鼠分別于模型成立24 h及28 d后，冰上取腦，快速分離出海馬，稱重，液氮冷凍后，用于免疫印跡檢測；余下大鼠腹腔注射水合氯醛(350 mg/kg)實施麻醉后，將其固定在手術(shù)臺上，暴露心臟，預(yù)冷的生理鹽水心臟灌流，待流出的血液呈無色澄清時，換成4%多聚甲醛進(jìn)行灌流，直至大鼠身體變僵硬為止，取腦，放入4 ℃的4%多聚甲醛固定，用于HE染色、尼氏染色及免疫組化檢測。

1.4 HE染色 按常規(guī)方法對腦組織標(biāo)本進(jìn)行HE染色。

1.5 尼氏染色 將石蠟切片標(biāo)本常規(guī)脫蠟至水后，浸入到10 g/L 的甲苯胺藍(lán)溶液中染色6 min，蒸餾水浸泡5 min，用于去除浮色，再依次放入70% 乙醇2 min，95%乙醇乙醇5 min，無水乙醇3 min；二甲苯透明兩次，每次5 min，中性樹膠封片[8]。顯微鏡下觀察各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)細(xì)胞尼氏小體的染色情況。

1.6 免疫組化染色 石蠟切片常規(guī)脫蠟，脫水后，按照DBA 試劑盒說明書進(jìn)行免疫組化染色，顯微鏡下觀察大鼠海馬區(qū)的病理變化，并使用Image J 軟件對經(jīng)免疫組化染色的大腦切片海馬區(qū)40倍放大圖片進(jìn)行灰度值分析。

1.7 Western blot 印跡法檢測海馬Nrf2的表達(dá) 各組大鼠的海馬組織按照10 ml/g的比例加入全細(xì)胞裂解液，組織進(jìn)行勻漿、超聲破碎后，加入400 μl Buffer A(1 mol HEPES 400 μl，pH 7.9；1 mol KCl 400 μl，0.1 mmol EDTA 40 μl；0.1 mmol EGTA 40 μl；加入去離子水39.12 ml。臨用前加入50 μl 10% NP-40,20 μl 0.1 mol DTT/1 ml buffer A和1× PMSF)液，移液器反復(fù)吹打混勻，冰上裂解15 min，震蕩10 s，12000 ×g，離心3 min，轉(zhuǎn)移上清(即胞漿蛋白)，加入30 μl Buffer B(1 mol HEPES 800 μl，pH 7.9；5 mol NaCl 3.2 ml，0.1 mmol EDTA 400 μl；0.1 mmol EGTA 400 μl；加入去離子水35.2 ml。臨用前加入10 μl 0.1 mol DTT/1 ml buffer B和1× PMSF，3倍沉淀體積)液到沉淀中，重新懸浮細(xì)胞核，冰上裂解30 min，12000×g，離心15 min，取上清，即為核蛋白[9]。BCA 法蛋白定量，12% SDS-PAGE 凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜到PVDF 膜。PVDF膜經(jīng)過5% 脫脂牛奶封閉2 h后，與Nrf2一抗( 1∶500)進(jìn)行雜交反應(yīng)，4 ℃過夜后，PBS漂洗3 次，每次10 min。加入相對應(yīng)的二抗( 1∶3000)，雜交反應(yīng)2 h。Tris-Nacl 漂洗3 次，每次10 min，加入ECL 發(fā)光液，反應(yīng)5 min，暗室內(nèi)進(jìn)行X 線膠片曝光、顯影和定影。同一張PVDF 膜再次經(jīng)過一二抗去除液去除后，再與β-actin ( 1∶500 ) 進(jìn)行雜交反應(yīng)。Western blot 印跡條帶經(jīng)Gel-oc凝膠成像分析系統(tǒng)掃描處理。

2 結(jié) 果

2.1 HE染色 假手術(shù)組可見神經(jīng)元完整，細(xì)胞排列整齊且有層次，細(xì)胞核及核仁清晰，形態(tài)完整，與假手術(shù)組相比，模型24 h組可見，神經(jīng)元細(xì)胞排列較疏松，形態(tài)欠完整，層次感稍差；模型28 d組表現(xiàn)為神經(jīng)元細(xì)胞排列疏松無層次感，完整的神經(jīng)元細(xì)胞較少，呈空泡樣的神經(jīng)元細(xì)胞較多，核仁不清，固縮神經(jīng)元細(xì)胞較多，可見大量壞死神經(jīng)元細(xì)胞，細(xì)胞與細(xì)胞間的縫隙較大(見圖1)。

2.2 尼氏染色 假手術(shù)組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰、排列整齊，染色質(zhì)分布均勻，可見豐富藍(lán)色顆粒狀的尼氏小體，與假手術(shù)組相比，模型24 h組可見，神經(jīng)元細(xì)胞排列稍松散，尼氏小體減少；模型28 d組可見，神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)明顯改變，數(shù)目減少，核內(nèi)染色質(zhì)凝集，尼氏小體顯著減少(見圖2)。

2.3 各組大鼠Nrf2免疫組織化學(xué)表達(dá)結(jié)果 Nrf2 免疫反應(yīng)在大鼠腦內(nèi)錐體細(xì)胞的胞漿和胞核均可見其表達(dá)，可見棕黃色顆粒(見圖3)。對3組大鼠腦內(nèi) Nrf2 表達(dá)的平均光密度值(OD)測量，與假手術(shù)組相比，模型24 h組內(nèi)的Nrf2表達(dá)增加，模型28 d組Nrf2表達(dá)則顯著減少(P<0.05，見表1)。

2.4 Nrf2免疫蛋白印跡 KA模型大鼠24 h組海馬組織胞核內(nèi)的 Nrf2 的表達(dá)明顯增強(qiáng)，而在假手術(shù)組和模型大鼠28 d組 Nrf2 表達(dá)相對較弱，且模型大鼠28 d組 Nrf2 表達(dá)更弱于假手術(shù)組(見圖4)，Nrf2 與 β-action 免疫印跡條帶相對吸光度比值，假手術(shù)組比模型28 d組增加顯著，模型24 h組比假手術(shù)組明顯增加，具有明顯統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，見表2)。

表1 不同組別小鼠海馬組織Nrf2免疫組織化學(xué) 染色結(jié)果

與對照組比較*P<0.05；與模型組比較#P<0.05

表2 各組小鼠海馬組織Nrf2蛋白表達(dá)水平±s)

與對照組比較*P<0.05;與模型24 h組比較#P<0.05

A：假手術(shù)組;B：模型24 h 組;C：模型28 d組

圖1 各組大鼠HE染色結(jié)果( ×10)

A：假手術(shù)組;B：模型24 h 組;C：模型28 d組

圖2 各組大鼠造模后海馬CA1區(qū)的尼氏染色(×20)

A：假手術(shù)組;B：模型24 h組;C：模型28 d組

圖3 各組大鼠造模后大腦皮質(zhì)Nrf2免疫組織化學(xué)染色(×40)

模型24 h組 假手術(shù)組 模型28 d組

圖4 各組大鼠海馬組織Nrf2蛋白表達(dá)水平

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，癲癇大鼠海馬CA3區(qū)的鈣超載現(xiàn)象在癲癇發(fā)病機(jī)制中起到了重要的作用。CA3區(qū)鈣超載可破壞膜電位的穩(wěn)定性，從而導(dǎo)致病灶向周圍正常組織放電，如CA1區(qū)，此發(fā)病機(jī)制與癲癇大發(fā)作的發(fā)病機(jī)制相同。此外，海馬 CA3區(qū)神經(jīng)元凋亡也是海人藻酸顳葉癲癇模型的一個顯著的病理特點[10,11]。另外，我們前期的預(yù)實驗表明，濃度為(1 μg/μl)的KA 1.0 μl注入到海馬CA1區(qū)時可造成大鼠過半的致死量，而同樣劑量注入到海馬CA3區(qū)時致死量則大大降低，且癲癇發(fā)作程度與其無差異，因此，我們選用(1 μg/μl)的KA 1.0 μl單次注入海馬CA3區(qū)，致癇潛伏期短，癲癇發(fā)作率高。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)在遭受外界藥物或內(nèi)毒素侵害時，其抗氧化系統(tǒng)就會發(fā)生紊亂，產(chǎn)生大量的活性氧。過多的活性氧可引起脂質(zhì)過氧化并且造成DNA損傷，從而引發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，不斷發(fā)展的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病則有可能誘導(dǎo)其癇性發(fā)作。有文獻(xiàn)報道，大鼠海馬CA3區(qū)注射海人酸可導(dǎo)致其癇性發(fā)作，同時對其腦內(nèi)生化指標(biāo)進(jìn)行檢測時發(fā)現(xiàn)有大量的活性氧生成。另有研究表明，匹羅卡品制備的癲癇模型中發(fā)現(xiàn)，大鼠腦內(nèi)發(fā)生了明顯的氧化應(yīng)激損傷，有大量的氧自由基存在[12]。由此我們可知，氧化應(yīng)激參與了癲癇的發(fā)生與發(fā)展。

Nrf2-ARE信號通路可編碼的內(nèi)源性保護(hù)基因超過200個，分別起到抗氧化、抗炎及抗凋亡等作用。生理狀態(tài)下，Nrf2存在于細(xì)胞漿中與Keap1緊密結(jié)合，處于低活性狀態(tài)，并且此復(fù)合物很容易被泛素蛋白酶迅速降解，當(dāng)機(jī)體受到外界刺激和內(nèi)源性毒素侵害時，Nrf2與Keap1解離，解離后的Nrf2轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，在細(xì)胞核中與Maf等小分子物質(zhì)結(jié)合形成異二聚體，此異二聚體又可以與抗氧化元件ARE結(jié)合，誘導(dǎo)其下游的抗氧化蛋白及解毒酶的基因表達(dá)，以此來抵抗外界刺激和內(nèi)毒素的侵害[13,14]。激活Nrf2-ARE信號通路則可以有效地減輕氧化應(yīng)激損傷從而保護(hù)神經(jīng)元。

但是，目前關(guān)于Nrf2-ARF信號通路在癲癇發(fā)病過程中的表達(dá)改變尚未有明確相關(guān)報道。本研究結(jié)果顯示，急性癲癇(模型24 h組)發(fā)作后，海馬組織細(xì)胞核內(nèi)Nrf2表達(dá)明顯增加，說明急性癲癇發(fā)作激活了Nrf2信號通路；慢性癲癇(模型28 d組)發(fā)作則細(xì)胞核內(nèi)Nrf2表達(dá)顯著減少，說明Nrf2信號通路失活；與此同時，神經(jīng)元HE染色及尼氏染色結(jié)果表明，與假手術(shù)組比較，模型24 h組及模型28 d組的神經(jīng)元受損，尼氏小體減少，但以模型28 d組神經(jīng)元損傷較重，尼氏小體減少的更為突出。以上實驗結(jié)果說明，急性癲癇發(fā)作可激活Nrf2信號通路，進(jìn)而發(fā)揮抗氧化作用，保護(hù)神經(jīng)元，減少海馬損傷；而慢性癲癇發(fā)作時，由于大量自由基的長期作用，可使Nrf2-ARE信號通路失活，無法發(fā)揮其抗氧化作用，從而誘導(dǎo)神經(jīng)元發(fā)生凋亡或壞死。

因此，激活Nrf2-ARF信號通路，誘導(dǎo)其編碼的內(nèi)源性保護(hù)基因產(chǎn)物的生成，能夠有效減少癲癇后氧化應(yīng)激損傷，可能是癲癇治療的潛在靶點。

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Expression of Nrf2 on epileptic rat model induced by kianic acid and effect on neuron

QIYue,XIANGShaojie,JIANGHong,etal.

(LiaoningProvinceChineseMedicineResearchInstitute,Shenyang110034,China)

Objective To investigate the expression of Nrf2 in epileptic rat model induced by kianic acid and its effect on neuron.Methods Rats were injected kianic acid (1 μg/μl)1.0 μl into hippocampal,and divided randomly into model 24 h (acute model group),model 28 d (chronic model group),sham group were inject equal volume saline,10 for each group.We observed the change of neuron by using Nissl staining; Immunohistochemistry and Western blotting were to measure the expression of Nrf2.Results Compared with sham,the results of Nissl staining suggested that Nissl bodies in nervous cells decreased in model 24 h group and model 28 d group,and especially in model 28 d group;the results of Immunohistochemistry and Western blotting demonstrated that the expression of Nrf2 increased in model 24 h group,decreased in model 28 d group.Conclusion Nrf2 had possible neuroprotective effect in acute kianic acid model and the mechanism was probably related to the upregulation the expression of Nrf2.

Epilepsy; Kianic acid; Nrf2

1003-2754(2017)04-0328-04

2016-12-09；

2017-03-30

國家科技部“十二五”“重大新藥創(chuàng)制”專項課題(2012ZX09102201-005)；遼寧省科技廳基金資助項目(2004226010-6)作者單位：(1.遼寧省中醫(yī)藥研究院，遼寧 沈陽 110034； 2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，遼寧 沈陽 110847；3.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院，遼寧 沈陽 110032)

賈 冬，E-mail:jiadg2003@126.com

R742.1

A