謝冠群 季巾君 范永升

浙江中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院 杭州 310053

解毒祛瘀滋陰方對強的松治療的MRL/lpr狼瘡鼠肺、脾、腹腔巨噬細胞TLR4信號通路的影響

謝冠群 季巾君 范永升

浙江中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院 杭州 310053

[目的]觀察解毒祛瘀滋陰方對MRL/lpr狼瘡鼠巨噬細胞TLR4信號通路的影響。[方法]MRL/lpr狼瘡鼠分為模型組、強的松組、解毒祛瘀滋陰方組（以下簡稱：中藥組）以及強的松加中藥組(以下簡稱：中西藥結合組)，分別以生理鹽水、強的松、解毒祛瘀滋陰方中藥和強的松加解毒祛瘀滋陰方中藥灌胃4周，收集肺、腹腔、脾臟巨噬細胞，RT-PCR檢測相關基因的表達。[結果]經(jīng)強的松治療后狼瘡鼠肺巨噬細胞TLR4 mRNA和脾巨噬細胞TLR4蛋白都顯著升高（P＜0.05），而中西藥結合組則可以顯著降低升高的脾巨噬細胞TLR4蛋白水平（P＜0.05）。強的松還可以顯著降低肺、腹腔巨噬細胞MyD88、IFN-α、iNOS mRNA等TLR4下游分子的表達（P＜0.05），而中西藥結合組可以顯著升高已經(jīng)降低的肺巨噬細胞MyD88 mRNA的表達（P＜0.05）。[結論]MRL/lpr狼瘡鼠應用糖皮質激素后，巨噬細胞TLR4信號通路發(fā)生改變，解毒祛瘀滋陰方中藥可以降低糖皮質激素造成的TLR4蛋白的異常表達。

系統(tǒng)性紅斑狼瘡；MRL/lpr狼瘡鼠；巨噬細胞；解毒祛瘀滋陰方；糖皮質激素；副作用；Toll樣受體

巨噬細胞是具有防御、調(diào)節(jié)炎癥、誘導免疫等多方面作用的細胞，其主要功能是清除體內(nèi)衰老損傷或凋亡的細胞以及免疫復合物和病原體等抗原性異物，在系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus, SLE）的發(fā)病中具有重要的作用，而且作為固有免疫的重要的組成部分，在抵御入侵的病原微生物中具有重要作用。隨著SLE治療水平的提高，患者因疾病本身的死亡率大大降低，但由于糖皮質激素、免疫抑制劑等造成的感染而導致的死亡卻顯著上升。Toll樣受體（Toll like receptor,TLR）4是識別革蘭氏陰性菌細胞壁主要成分脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）的主要受體，在感染的發(fā)病中具有重要作用。中醫(yī)藥在調(diào)節(jié)患者免疫功能等方面具有很好的療效，課題組在前期臨床研究中發(fā)現(xiàn)，解毒祛瘀滋陰方可以減少SLE患者感染的發(fā)生[1]，因此希望通過本研究發(fā)現(xiàn)解毒祛瘀滋陰方治療MRL/lpr狼瘡鼠減少感染發(fā)生的機制。

1 材料與方法

1.1 動物來源 8周齡MRL/lpr狼瘡鼠購自中國科學院上海實驗動物中心[SCXK（滬）2008-0016]，在浙江中醫(yī)藥大學實驗動物中心SPF級封閉狀態(tài)下飼養(yǎng)[SYXK(浙)2013-0184]，正常飼料自由飲食飲水。

1.2 中藥制備 解毒祛瘀滋陰方（升麻9g、青蒿12g、白花蛇舌草15g、赤芍12g、積雪草15g、干地黃15g、炙鱉甲12g、炒薏仁15g、佛手片9g、生甘草6g）藥材，由浙江中醫(yī)藥大學中藥飲片廠提供。以水500mL煎煮1h，過濾藥液，加水500mL，煎煮1h，過濾藥液，二次的水煎劑混合后，濃縮成0.6g·mL-1生藥。

1.3 主要儀器與試劑 M-MLV逆轉錄酶（Takara，批號K4707CA），Taq酶（Takara，批號CKA3901C），醋酸潑尼松片（浙江仙居制藥，批號151022），TLR4兔抗鼠一抗（Santa sc16240，批號F0520），羊抗兔二抗（Licor 926-68021，批號C40325-02）；引物由上海生工合成；PCR儀（德國，Eppendorf），BIO-RAD凝膠圖像分析系統(tǒng)（美國，BIO-RAD）。

1.4 動物分組及處理 按體重隨機將24只MRL/lpr狼瘡鼠分成4組：模型組、強的松組、解毒祛瘀滋陰方組（以下簡稱：中藥組）以及強的松加中藥組(以下簡稱：中西藥結合組）。各組藥物劑量以體表面換算成人等效劑量，中藥組以0.6g·mL-1生藥濃度，每只小鼠灌胃0.5mL；強的松組以0.2mg·mL-1的強尼松灌胃0.5mL；中西藥結合組先灌強的松，0.5h后再灌中藥，劑量同上；模型組灌0.5mL生理鹽水。各組共連續(xù)灌胃4周后處死，收集相關標本。

1.5 巨噬細胞提取及培養(yǎng) 肺巨噬細胞制備[2]：MRL/lpr狼瘡鼠治療4周后處死，在75%酒精中浸泡2min，打開頸部皮膚，找出氣管，并從口中插入頂端磨平的注射器進入氣管，結扎氣管，先將肺中氣體吸凈，再向肺中注入1mL PBS，1min后回吸，重復3次，收集含巨噬細胞的液體。腹腔巨噬細胞制備：肺巨噬細胞收集完成后，向MRL/lpr鼠腹腔中注射PBS 5mL，輕輕按揉小鼠腹部3min，抽取腹腔液，收集含巨噬細胞的液體。脾巨噬細胞制備：腹腔巨噬細胞收集完成后，打開小鼠腹腔，取出脾臟，放入含有PBS的培養(yǎng)皿中，用無菌注射器吸取PBS，將針尖插入脾中反復吹打，直至脾臟呈白色，收集含有脾細胞的液體。將上述3種含巨噬細胞的液體3000r/min離心5min，去上清，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。2h后換液，棄去紅細胞、T細胞、B細胞等未貼壁的細胞，剩下的貼壁細胞即巨噬細胞。

1.6 RT-PCR實驗方法 收集上述細胞，加入1mL Trizol充分裂解細胞后-80℃保存。RT-PCR檢測TLR4、髓樣分化因子 88（myeloid differentiation factor88,MyD88）、TIR結構域銜接蛋白（TIR-domain-containing adapter-inducing interferon,TRIF）、干擾素α（interferon-α,IFN-α）、誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthesis,iNOS）基因的表達。將上述液體在室溫放置10min后加入氯仿混勻，離心后吸取上清，加入等體積異丙醇，-20℃靜置30min后離心去上清，加入無水乙醇洗滌后晾干得到RNA，測定濃度后加入等量RNA進行cDNA逆轉錄及PCR目的基因擴增。各引物序列（表1），PCR擴增結束后，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，拍照記錄結果。通過軟件計算各組的灰度值，與Actin比較，得出各基因mRNA的相對表達量。

表1 各基因引物序列Tab.1 The genetic sequences of primers

1.7 Western Blot實驗方法 收集脾臟巨噬細胞，加入細胞裂解液充分裂解，離心后取上清待用。配置SDS-PAGE，將上述樣品煮沸后加樣電泳，轉膜，脫脂奶粉封閉后一抗孵育過夜，二抗孵育2h后掃膜儀進行掃描拍照。

2 結果

2.1 巨噬細胞形態(tài)觀察 巨噬細胞1～2h開始貼壁，呈扁圓形，5～6h后逐漸伸出偽足，呈三角形或多邊形。24h后臺盼藍染色結果顯示，巨噬細胞成活率＞95%。

2.2 肺、腹腔、脾巨噬細胞TLR4信號通路相關mRNA表達的變化 收集各組巨噬細胞，RT-PCR結果顯示：與模型組比較，強的松組小鼠的肺巨噬細胞TLR4 mRNA顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），脾和腹腔的巨噬細胞有升高趨勢，中藥組有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與強的松組比較，肺、脾、腹腔的中西藥結合組都有一定程度的下降，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。與模型組比較，強的松組、中西藥結合組的3種巨噬細胞MyD88 mRNA顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），強的松組的肺、腹腔巨噬細胞IFN-α mRNA顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與強的松組比較，中西藥結合組肺巨噬細胞MyD88 mRNA顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其余指標變化不明顯。詳見表2～4。

2.3 脾巨噬細胞TLR4蛋白的表達變化 收集各組小鼠脾巨噬細胞，Western blot實驗結果顯示：與模型組比較，中藥組TLR4的表達顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），強的松組升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與強的松組比較，中西藥結合組顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖1。

表2 藥物對MRL/lpr鼠肺巨噬細胞TLR4信號通路相關基因mRNA表達的影響（±s）Tab.2 Effects of drugs on mRNA expression of TLR4 signaling pathway in lung macrophages of MRL/lpr mice（±s）

表2 藥物對MRL/lpr鼠肺巨噬細胞TLR4信號通路相關基因mRNA表達的影響（±s）Tab.2 Effects of drugs on mRNA expression of TLR4 signaling pathway in lung macrophages of MRL/lpr mice（±s）

注：與模型組比較，▲P＜0.05；與強的松組比較，◇P＜0.05。Note:Compared with model group,▲P＜0.05;compared with prednisone group,◇P＜0.05.

模型組 中藥組 強的松組 中西藥結合組TLR4 MyD88 TRIF IFN-α IFN-β iNOS 1.19±0.32 0.43±0.10 0.61±0.16 0.56±0.17 0.67±0.17 0.55±0.09 1.06±0.31 0.31±0.05▲0.76±0.24 0.48±0.13 0.60±0.19 0.48±0.11 2.04±0.50▲0.24±0.07▲0.64±0.16 0.35±0.10▲0.56±0.18 0.38±0.12▲1.82±0.44 0.33±0.08▲◇0.67±0.13 0.41±0.10 0.68±0.09 0.34±0.08▲

表3 藥物對MRL/lpr鼠脾巨噬細胞TLR4信號通路相關基因mRNA表達的影響（±s）Tab.3 Effects of drugs on mRNA expression of TLR4 signaling pathway in splenic macrophages of MRL/lpr mice（±s）

表3 藥物對MRL/lpr鼠脾巨噬細胞TLR4信號通路相關基因mRNA表達的影響（±s）Tab.3 Effects of drugs on mRNA expression of TLR4 signaling pathway in splenic macrophages of MRL/lpr mice（±s）

注：與模型組比較，▲P＜0.05。Note:Compared with model group,▲P＜0.05.

模型組 中藥組 強的松組 中西藥結合組TLR4 MyD88 TRIF IFN-α IFN-β iNOS 1.43±0.49 0.29±0.02 0.70±0.20 0.44±0.10 0.65±0.19 0.38±0.11 1.07±0.28 0.23±0.04 0.67±0.11 0.42±0.12 0.44±0.09 0.37±0.11 2.21±0.90 0.19±0.02▲0.59±0.14 0.32±0.09 0.49±0.11 0.28±0.05 1.93±0.76 0.21±0.04▲0.64±0.11 0.33±0.07 0.52±0.06 0.28±0.06

3 討論

SLE的發(fā)病機制非常復雜，而治療多以免疫抑制劑為主，雖然疾病得以控制，但感染等副作用凸顯，導致近年來疾病的死亡原因發(fā)生了很大的變化，疾病本身導致的死亡大大減少，而感染及藥物副作用導致的心血管疾病成為死亡的主因。課題組統(tǒng)計了12篇有關SLE死因分析及感染分析的文獻共涉及患者4653 例[3-14]，其中發(fā)生感染1872例，其中革蘭氏陰性細菌感染337例，革蘭氏陽性細菌感染202例，未區(qū)分種類346例，真菌434例，病毒384例，由以上結果可以發(fā)現(xiàn)，細菌感染占SLE所有感染的47.3%，因此課題組認為細菌感染，尤其是革蘭氏陰性菌的感染是SLE感染的主要因素。課題組之前的研究發(fā)現(xiàn)，糖皮質激素可以抑制巨噬細胞的吞噬功能，而解毒祛瘀滋陰方可以緩解糖皮質激素的作用[15]。因此，課題組進一步研究了解毒祛瘀滋陰方減少糖皮質激素副作用的作用機制。

表4 藥物對MRL/lpr鼠腹腔巨噬細胞TLR4信號通路相關基因mRNA表達的影響（±s）Tab.4 Effects of drugs on mRNA expression of TLR4 signaling pathway in peritoneal macrophages of MRL/lpr mice（±s）

表4 藥物對MRL/lpr鼠腹腔巨噬細胞TLR4信號通路相關基因mRNA表達的影響（±s）Tab.4 Effects of drugs on mRNA expression of TLR4 signaling pathway in peritoneal macrophages of MRL/lpr mice（±s）

注：與模型組比較，▲P＜0.05。Note:Compared with model group,▲P＜0.05.

模型組 中藥組 強的松組 中西藥結合組TLR4 MyD88 TRIF IFN-α IFN-β iNOS 1.81±0.73 0.31±0.05 0.88±0.34 0.58±0.14 0.66±0.12 0.37±0.08 1.36±0.41 0.20±0.03▲0.51±0.17▲0.42±0.11 0.47±0.10 0.31±0.08 2.54±0.67 0.15±0.03▲0.69±0.14 0.36±0.09▲0.46±0.07 0.22±0.06▲2.17±0.52 0.17±0.02▲0.74±0.18 0.36±0.13▲0.44±0.05▲0.17±0.05▲

圖1 各組脾巨噬細胞TLR4蛋白電泳圖（A）及其統(tǒng)計（B）Fig.1 The electrophoretogram of TLR4 protein expression in splenic macrophages in each group(A)and its statistical graph(B).

TLR4主要識別革蘭氏陰性菌的LPS、革蘭氏陽性菌的磷壁酸和熱休克蛋白60等，因此TLR4與細菌等感染密切相關。未經(jīng)治療的初發(fā)SLE患者的外周血細胞TLR4 mRNA水平顯著升高[16]，而穩(wěn)定期的SLE患者合并感染與不合并感染者外周血單個核細胞的TLR4的陽性率沒有差異，活動期SLE患者合并感染及不合并感染者PBMC的TLR4的陽性率也沒有差異[17]，而正常情況下伴有細菌感染特別是革蘭氏陰性菌感染的患者TLR4的表達都有一定程度的升高。應用糖皮質激素、硫唑嘌呤、環(huán)磷酰胺、來氟米特、甲氨蝶呤、霉酚酸酯等免疫抑制劑的自身免疫病患者（包括SLE、類風濕關節(jié)炎、強直性脊柱炎、干燥綜合癥等），有TLR4表達升高的現(xiàn)象[18]，說明TLR4的異常不僅與糖皮質激素等免疫抑制劑的治療有關，而且與疾病也有密切關系。這些患者的外周血單個核細胞經(jīng)TLR1/2/4/5/6配體的刺激后，IL-8和TNF-α的分泌比正常組顯著升高，因此自身免疫病患者應用免疫抑制劑后，其固有免疫反應不是減弱而是增強。但這些患者更容易發(fā)生感染，原因并非固有免疫被抑制，而是功能失調(diào)，同時這可能與TLR4相關信號通路異常有關。因此，TLR4信號通路的異常與SLE的發(fā)病、免疫抑制劑的副作用都有密切關系。

解毒祛瘀滋陰方在之前的臨床研究中發(fā)現(xiàn)，可以減少糖皮質激素導致的SLE患者感染的發(fā)生[1]，細胞實驗發(fā)現(xiàn)解毒祛瘀滋陰方可以減輕糖皮質激素抑制巨噬細胞吞噬細菌的作用，故本研究希望通過MRL/lpr狼瘡鼠動物模型進一步明確解毒祛瘀滋陰方減輕糖皮質激素導致的感染副作用的機制。MRL/ lpr狼瘡鼠應用糖皮質激素之后，TLR4 mRNA的表達升高與文獻報道一致，糖皮質激素結合解毒祛瘀滋陰方治療后TLR4 mRNA的表達有不同程度的降低，脾巨噬細胞TLR4蛋白的表達也降低，表明中藥可以調(diào)控糖皮質激素造成的TLR4 mRNA和蛋白的異常表達。由于肺、腹腔巨噬細胞含量較少，因此只檢測脾TLR4蛋白的表達。課題組推測因為糖皮質激素具有免疫抑制作用，可以降低巨噬細胞的吞噬作用，而TLR4是識別革蘭氏陰性菌細胞膜上的LPS的受體，機體通過升高TLR4的表達以降低機體感染的風險，這相當于機體在糖皮質激素作用下的負反饋調(diào)節(jié)。同時TLR4下游信號通路亦被抑制，如MyD88、TRIF以及發(fā)揮激活炎癥反應的效應分子IFN-α、IFN-β、iNOS也都有不同程度的降低，這可能就是糖皮質激素導致感染發(fā)生的原因之一。糖皮質激素合用中藥后，TLR4的表達不同程度的降低，而其下游分子未見進一步下降，可見中藥可以恢復糖皮質激素對TLR4分子的異常調(diào)控，但未進一步抑制其下游信號分子，導致免疫抑制進一步加重。綜上所述，應用糖皮質激素后，MRL/lpr狼瘡鼠免疫受到抑制，TLR4信號通路發(fā)生異常，而合用解毒祛瘀滋陰方中藥后TLR4蛋白的異常表達得到緩解，而其下游的信號分子未進一步惡化，這可能就是中藥減輕糖皮質激素造成感染副作用的作用機制。

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Effects of Jiedu Quyu Ziyin Decoction on TLR4 Signal Pathway in Lung,Spleen and Peritoneal Macrophagocyte of MRL/lpr Lupus Mice Treated by Prednisone

XIE Guanqun,JI Jinjun,FAN Yongsheng College of Basic Medical Sciences,Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310053)China

[Objective]To observe the effect of Jiedu Quyu Ziyin decoction on TLR4 signaling pathway in macrophages of MRL/lpr lupus mice.[Method]MRL/ lpr lupus mice were divided into four groups:model group,prednisone group,Jiedu Quyu Ziyin decoction group(hereinafter referred to as:Chinese medicine group)and prednisone plus Chinese medicine group(hereinafter referred to as:combination of Chinese and western medicine group).The mice were gavaged with saline,prednisone,Jiedu Quyu Ziyin decoction and prednisone added Jiedu Quyu Ziyin decoction for 4 weeks.Macrophages of lung,peritoneal and spleen were collected and the expression of related genes was detected by RT-PCR.[Result]TLR4 mRNA in lung macrophages,and TLR4 protein in splenic macrophages increased significantly(P＜0.05)after the treatment of prednisone.The increased TLR4 protein in splenic macrophages was significantly decreased by combining with Jiedu Quyu Ziyin decoction(P＜0.05).Prednisone can significantly reduce the TLR4 downstream molecules such as MyD88, IFN-α,iNOS mRNA expression in lung and peritoneal macrophages(P＜0.05).The decreased MyD88 mRNA in lung macrophages was increased significantly by combining with Jiedu Quyu Ziyin decoction(P＜0.05).[Conclusion]TLR4 signaling pathway is changed in macrophages after glucocorticoid administration in MRL/lpr lupus mice.Jiedu Quyu Ziyin decoction can reduce the abnormal glucocorticoid-induced TLR4 protein expression.

systemic lupus erythematosus;MRL/lpr lupus mice;macrophagocyte;Jiedu Quyu Ziyin decoction;glucocorticoid;side effect;Toll-like receptor

R331

A

1005-5509（2017）04-0318-05

10.16466/j.issn1005-5509.2017.04.016

2016-11-25）

國家自然科學基金（81403289）；浙江省自然科學基金（LQ14H270003）；浙江省教育廳科研項目（Y201327513）；浙江中醫(yī)藥大學校級課題（2012ZR01）；浙江中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院院級科研基金

Fund projects:NationalNaturalScience Foundation ofChina(81403289);NaturalScience Foundation ofZhejiang Province(LQ14H270003);Scientific Research Projects of Zhejiang Province Education Department(Y201327513);Science Foundation of Zhejiang Chinese Medical University(2012ZR01);Science Foundation of College of Basic Medical Sciences of Zhejiang Chinese Medical University

范永升，E-mail：fyszjtcm@163.com