胡海峰 馮謝敏 喬 健 段 偉 劉寧寧 孫曉東

miR-345在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及臨床意義

胡海峰 馮謝敏 喬 健 段 偉 劉寧寧 孫曉東

目的 探討microRNA-345(miR-345)在非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中的表達(dá)情況，并進(jìn)一步分析其與腫瘤的臨床病理特征和預(yù)后關(guān)系。方法 利用Real-time PCR檢測(cè)98例NSCLC患者組織及三種細(xì)胞系中miR-345的表達(dá)，分析miR-345的表達(dá)與臨床預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果 和對(duì)照組相比，miR-345的表達(dá)在NSCLC組織及細(xì)胞系中顯著下調(diào)(P<0.05)；組織中miR-345的表達(dá)水平和臨床病理指標(biāo)包括淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.001)、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移(P=0.028)、TNM分級(jí)(P=0.004)以及病理分期(P=0.011)有關(guān)；低表達(dá)miR-345的NSCLC患者組和高表達(dá)miR-345的患者組相比，其總生存率較低(P=0.021)。多因素分析表明miR-345的表達(dá)是NSCLC預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(HR=3.897，95%CI：2.263～10.440；P=0.012)。結(jié)論 miR-345在NSCLC組織及細(xì)胞系中的表達(dá)降低，低表達(dá)的miR-345和NSCLC的進(jìn)展及預(yù)后有關(guān)，表明miR-345可能作為NSCLC的一個(gè)潛在臨床診斷標(biāo)記。

生物標(biāo)記；miR-345；非小細(xì)胞肺癌；預(yù)后

肺癌是全球范圍內(nèi)癌癥死亡的主要原因之一，其中非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)約占其中的大約80%[1]。近年來(lái)，盡管手術(shù)、化療以及靶向治療等對(duì)肺癌患者的治療取得了很大的進(jìn)步，但是NSCLC患者的5年生存率依然較低[2]。因此，尋找一些高特異性和敏感性的生物標(biāo)記對(duì)NSCLC的早期診斷和惡性疾病的預(yù)后具有重要的臨床意義。

微小RNA(miRNAs)是一類小的非編碼RNA，對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控起著重要的作用[3]。miRNAs的表達(dá)改變對(duì)許多疾病的發(fā)生和發(fā)展起著關(guān)鍵作用，包括癌癥。一些miRNA在肺癌的探測(cè)、診斷和治療中具有很好的前景[4-5]。Nadal等[6]通過(guò)基因表達(dá)譜分析NSCLC和健康受試者血清miRNAs的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)很多差異表達(dá)的血清miRNAs，聯(lián)合四個(gè)miRNAs(miR-193b，miRNA-301，miR-141和miR-200b)可以從健康對(duì)照人群中準(zhǔn)確鑒別NSCLC患者。最近Mavridiset等[7]報(bào)道，miR-197在NSCLC組織中表達(dá)上調(diào)且與腫瘤的大小及分型密切相關(guān)。除此之外，miR-197的過(guò)表達(dá)是NSCLC惡性預(yù)后的獨(dú)立預(yù)警分子，表明miR-197可能作為NSCLC的潛在癌基因。

miR-345的表達(dá)失調(diào)是多種類型癌癥的普遍特征，包括前列腺癌、結(jié)腸癌以及急性淋巴細(xì)胞白血病[8-10]。然而，其在NSCLC患者組織中的表達(dá)尚不清楚，本研究對(duì)miR-345在NSCLC中的表達(dá)情況以及其潛在的臨床意義進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象及臨床樣本

收集2011年6月—2013年1月在我院手術(shù)切除的NSCLC組織標(biāo)本及正常肺組織標(biāo)本(距肺癌>5 cm)共98例。所有患者均經(jīng)病理確診為NSCLC，且所有患者均簽署患者知情同意書。所有患者術(shù)前均未接受過(guò)任何放化療、生物治療或靶向治療，手術(shù)切除的標(biāo)本迅速放入液氮中保存，后轉(zhuǎn)到-80℃冰箱中保存，且整個(gè)收集及保存過(guò)程均按照無(wú)酶原則操作。NSCLC根據(jù)美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)第四版關(guān)于肺癌TNM分級(jí)系統(tǒng)進(jìn)行分級(jí)。總體生存時(shí)間為在我院確診為NSCLC到死亡的時(shí)間間隔。NSCLC病人的臨床數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。

1.2 主要試劑

RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaqMan Universal PCR Master Mix試劑盒、microRNA熒光實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒、miR-345引物、U6B均購(gòu)于大連Takara公司；miRVana RNA提取試劑盒及Trizol購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

選取腺癌細(xì)胞A549、鱗癌細(xì)胞H157和大細(xì)胞癌細(xì)胞H460三種NSCLC細(xì)胞株，和一株正常的人成纖維細(xì)胞株(MRC-9)均購(gòu)自于美國(guó)ATCC公司。NSCLC細(xì)胞株培養(yǎng)基為含10%的胎牛血清、鏈霉素100 mg/mL、青霉素100 U/mL的RPMI 1640培養(yǎng)基，正常細(xì)胞株于α-MEM培養(yǎng)基，細(xì)胞培養(yǎng)在37℃、5% CO2相對(duì)濕度90%的培養(yǎng)箱中，間隔2～3天更換培養(yǎng)基。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)

根據(jù)用戶說(shuō)明書用Trizol從NSCLC、正常組織及細(xì)胞系中提取總RNA。20 μL RNA根據(jù)RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書反轉(zhuǎn)錄成cDNA。取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，按照TaqMan Universal PCR Master Mix試劑盒說(shuō)明書在Real-time PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系：1 μL cDNA(500 ng/20 μL)，0.6 μL primer(10 pmol/L)，10 μL 2×SYBR Green PCR Master Mix，無(wú)RNase水8.4 μL。反應(yīng)條件：95℃ 5 min預(yù)熱，95℃ 30 s變性，60℃ 30 s退火，72℃ 30 s延伸，40個(gè)循環(huán)。引物序列，miR-345：正向引物5′-GCTGACTCCTAGTCCA-3′，反向引物5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；U6B：正向引物5′-GCGCGTCGTGAAGCGTTC-3′，反向引物5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′。反應(yīng)結(jié)束后得到各反應(yīng)管的循環(huán)閾值(Ct)，miR-345的相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct法對(duì)基因表達(dá)量進(jìn)行相對(duì)定量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有的數(shù)據(jù)均使用SPSS 18.0軟件進(jìn)行分析，使用Mann-Whitney U檢驗(yàn)比較NSCLC組織和癌旁組織miR-345的表達(dá)水平，方差分析比較不同細(xì)胞系中miR-345的表達(dá)水平。使用χ2檢驗(yàn)分析miR-345的表達(dá)水平和臨床病理指標(biāo)的關(guān)系?？偵娣治霾捎肔og-rank檢驗(yàn)，生存曲線使用Kaplan-Meier分析。使用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行單因素和多因素分析探討NSCLC預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-345在NSCLC組織及細(xì)胞系中的表達(dá)

熒光實(shí)時(shí)定量PCR比較miR-345在NSCLC組織和細(xì)胞系中的表達(dá)，結(jié)果顯示miR-345的表達(dá)在NSCLC組織和正常肺組織相比顯著降低(P<0.01)(圖1)。同時(shí)，和正常人成纖維細(xì)胞系相比，三株NSCLC細(xì)胞系中miR-345的表達(dá)均下調(diào)(P<0.05)(圖2)。

2.2 組織miR-345與NSCLC臨床指標(biāo)的相關(guān)性

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR-345的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.001)、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移(P=0.028)、TNM分級(jí)(P=0.004)以及病理分期(P=0.011)相關(guān)。而miR-345的表達(dá)和年齡(P=0.960)、性別(P=0.649)以及家族史(P=0.215)無(wú)關(guān)(表1)。

圖1 miR-345在NSCLC組織中的表達(dá)Figure 1 The expression level of miR-345 in NSCLC tissues

圖2 miR-345在NSCLC組織中的表達(dá)Figure 2 The expression level of miR-345 in NSCLC cell linesNote：*P<0.05，**P<0.01，compared to MRC-9.

CharacteristicsnmiR-345expressionLow(n=45)High(n=53)PAge(years)0.960≤60462125>60522428Gender0.649Female462026Male522527Lymphaticmetastasis<0.001No422913Yes561640Distantmetastasis0.028No472720Yes511833TNMstage0.004Ⅰ～Ⅱ523121Ⅲ～Ⅳ461432Pathologicalgrade0.011Well/Moderate412516Poor572037Familyhistory0.215No904347Yes826

2.3 總生存分析

以組織miR-345的平均表達(dá)水平(0.78)作為標(biāo)準(zhǔn)，將98例NSCLC患者分為高表達(dá)miR-345組和低表達(dá)組。組織中高表達(dá)miR-345的NSCLC患者組中位生存時(shí)間為37.5個(gè)月(95%CI，30.2～42.4個(gè)月)，明顯長(zhǎng)于組織中低表達(dá)miR-345的NSCLC患者組(21.3月，95%CI，18.4～24.6個(gè)月)(P=0.021)(圖3)。

圖3 總生存時(shí)間和miR-345表達(dá)水平的關(guān)系Figure 3 The association between overall survival and miR-345 expression

2.4 NSCLC患者預(yù)后的影響因素分析

單因素分析結(jié)果顯示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(HR=3.623，95%CI：1.193～5.698；P=0.021)、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移(HR=3.126，95%CI：1.798～7.614；P=0.004)、TNM分級(jí)(HR=4.021，95%CI：2.405-9.997；P=0.009)、組織miR-345的表達(dá)水平(HR=3.431，95%CI：1.762-7.309)和總生存時(shí)間降低明顯相關(guān)(表2)。

多因素分析結(jié)果顯示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(HR=3.019，95%CI：1.621～7.009；P=0.042)、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移(HR=3.596，95%CI：2.298～8.908；P=0.009)、TNM分級(jí)(HR=4.798，95%CI：2.950-11.991；P=0.007)、組織miR-345表達(dá)水平(HR=3.897，95%CI：2.263～10.440；P=0.012)是NSCLC預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(表2)。

表2 Cox回歸模型對(duì)總生存時(shí)間的單因素和多因素分析

3 討論

miRNA在癌癥的發(fā)展過(guò)程中起著重要的作用[11-12]。miRNA的突變或者異常表達(dá)是肺癌患者表現(xiàn)的普遍特征，因此基于miRNA的治療對(duì)改善惡性疾病的臨床預(yù)后具有很大的潛力[13-14]。miR-345的表達(dá)改變和癌癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡以及癲癇等疾病相關(guān)[15-16]。本研究表明miR-345的表達(dá)在NSCLC組織及細(xì)胞系中下調(diào)。同時(shí)，組織miR-345的表達(dá)和NSCLC的一些臨床指標(biāo)具有相關(guān)性，包括淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移、TNM分期及腫瘤臨床分級(jí)。除此之外，組織中低表達(dá)miR-345的NSCLC患者通常總生存期(OS)較低。組織miR-345是NSCLC預(yù)后差的獨(dú)立預(yù)警分子。從目前來(lái)看，本研究表明miR-345可能在NSCLC的發(fā)展過(guò)程中扮演著抑制性的角色。由于組織miR-345的表達(dá)和NSCLC的臨床指標(biāo)密切相關(guān)，因此它有可能作為這類惡性疾病的一個(gè)非常有前景的診斷和預(yù)后生物標(biāo)記。同時(shí)，與本研究結(jié)果相類似，Chen等[17]的研究也表明miR-345的異位表達(dá)在體內(nèi)外都具有抑制前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移和浸潤(rùn)的能力。此外，Smad1被鑒定為miR-345的直接下游靶基因，表明miR-345很有可能在前列腺癌中是一個(gè)腫瘤抑制基因。Srivastava和他的研究團(tuán)隊(duì)的研究結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，miR-345的表達(dá)在胰腺癌(PC)患者組織及細(xì)胞系中和對(duì)照組相比顯著降低。在體外上調(diào)miR-345的表達(dá)可以抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖，并通過(guò)Bcl-2基因誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，表明恢復(fù)miR-345的表達(dá)可能成為治療胰腺癌的一種有效的手段[18]。同時(shí)也有類似研究表明miR-345是一個(gè)甲基化敏感的miRNA，它在結(jié)腸癌(CRC)組織中表達(dá)下調(diào)。除此之外，miR-345的表達(dá)下調(diào)還與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及組織學(xué)分型相關(guān)。miR-345的過(guò)表達(dá)可以通過(guò)靶向Bcl-2相關(guān)的永生基因3(Athanogene 3)抑制結(jié)腸癌細(xì)胞系的增殖和侵襲。因此，miR-345可能是結(jié)腸癌腫瘤發(fā)生的負(fù)調(diào)控因子[19]。

然而，miR-345還可能在腫瘤發(fā)生過(guò)程中扮演癌基因的角色。Schou等[20]的研究表明miR-345在全血中的高表達(dá)可以作為結(jié)腸癌患者整體生存率及預(yù)后較差診斷的生物學(xué)標(biāo)記。同時(shí)，miR-345的表達(dá)上調(diào)和西妥昔單抗及伊立替康治療的耐藥性相關(guān)。miR-345在結(jié)腸癌中可能是癌基因，這和Tang及其研究團(tuán)隊(duì)的報(bào)道相悖[19]。和正?？谇火つは啾龋琺iR-345的表達(dá)在口腔黏膜白斑病組織中表達(dá)升高，且這類組織中核的數(shù)目及核/質(zhì)比增加。這些結(jié)果表明miR-345在促進(jìn)口腔癌前病變進(jìn)展為口腔鱗狀細(xì)胞癌扮演著重要角色[21]。Guled等[22]比較了間皮瘤組織和正常對(duì)照組織中差異表達(dá)的miRNAs，發(fā)現(xiàn)miR-345在惡性間皮瘤中的表達(dá)顯著上調(diào)，表明miR-345可能促進(jìn)這類惡性疾病的進(jìn)展。為什么在不同類型的腫瘤甚至是同種類型的腫瘤中miR-345扮演著相反的角色？最主要可能有以下兩個(gè)方面的原因：首先，一個(gè)miRNA可能有多個(gè)被其調(diào)控的靶基因，其發(fā)揮不同的功能取決于它所調(diào)控的靶基因，因此一種miRNA可能在一種類型的腫瘤中起著促進(jìn)作用，而在另外一種類型的腫瘤中起著抑制性的作用。除此之外，miR-345的生物學(xué)功能還可能取決于腫瘤微環(huán)境，而不同的腫瘤類型有其特定的微環(huán)境。

本研究尚存在一些局限性。首先，腫瘤組織樣本相對(duì)較小，還需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行驗(yàn)證。其次，在本研究中我們沒(méi)有在NSCLC患者血清或血漿中檢測(cè)miR-345的表達(dá)變化。在血清或者血漿中檢測(cè)生物標(biāo)記的表達(dá)可能在臨床上實(shí)時(shí)監(jiān)控治療的效果。最后，miR-345調(diào)控非小細(xì)胞發(fā)生的細(xì)胞及分子機(jī)制尚不清楚。

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(收稿：2016-10-18)

The expression and clinical significance of miR-345 in non-small cell lung cancer

HUHaifeng，F(xiàn)ENGXiemin，QIAOJian，DUANWei，LIUNingning，SUNXiaodong

Department of Oncology，The Affiliated Hospital of Yan′an University，Yan′an 716000，China

Objective The objective of this study was to investigate the miR-345 expression level in non-small cell lung cancer(NSCLC)tissue and its potential clinical significance.Methods Real-time PCR was conducted to evaluate the expression of miR-345 in NSCLC tissues in 98 samples and cell lines.Then the association between tissue miR-345 expression level and clinical outcomes was further analyzed.Results The expression level of miR-345 was significantly decreased in NSCLC tissues and cell lines when compared to the controls(P<0.05).miR-345 expression level in NSCLS tissues was associated with various clinicopathological parameters including LN metastasis(P<0.001)，distant metastasis(P=0.028)，TNM stage(P=0.004)and grade(P=0.011).In addition，the NSCLC patients in the low miR-345 expression group showed significantly shorter overall survival time than that in the high miR-345expression group(P=0.021).Multivariate analysis showed that the expression of miR-345 was an independent risk factor for NSCLC(HR=3.897，95%CI：2.263～10.440；P=0.012).Conclusion The expression level of miR-345 was decreased in NSCLC tissues as well as cell lines compared with normal controls.Low miR-345 expression in tissues was associated with progression and poor prognosis of NSCLC.These results indicate that miR-345 may be a novel prognostic marker in NSCLC.

Biomarker；miR-345；Non-small cell lung cancer；Prognosis

延安大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤科(延安 716000)

胡海峰，男，(1983-)，碩士研究生，主治醫(yī)師，從事消化道腫瘤、乳腺腫瘤、肺癌、婦科腫瘤和淋巴瘤等的研究。

胡海峰，E-mail：huhaifeng1983@126.com

R734.2

A

10.11904/j.issn.1002-3070.2017.02.005