張緒良 胡亞華 黃丹青

蘇林酸在NF-κB對人乳腺癌TNF-α誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡增敏中的相關(guān)作用

張緒良1胡亞華1黃丹青2

目的 探討蘇林酸在NF-κB對人乳腺癌TNF-α誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡增敏中的相關(guān)作用。方法 取對數(shù)生長期的人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7，加入蘇林酸，使其終濃度分別為0.5 mmol/L和1.0 mmol/L，并設(shè)不加蘇林酸的對照組進(jìn)行培養(yǎng)；蘇林酸處理48 h后進(jìn)行MTT、流式細(xì)胞實驗和Western blot法檢測，分析蘇林酸對腫瘤細(xì)胞生長的作用與相關(guān)機(jī)制。結(jié)果 0.5 mmol/L和1.0 mmol/L蘇林酸分別刺激MCF-7細(xì)胞48 h后，對應(yīng)的MCF-7細(xì)胞的增殖抑制率為(29.17±1.23)%、(38.15±1.51)%，對照組為(1.15±0.02)%(P<0.05)。與對照組相比，0.5 mmol/L和1.0 mmol/L蘇林酸作用后均可導(dǎo)致滯留在G0～G1期的MCF-7細(xì)胞顯著增加(P<0.05)；0.5 mmol/L和1.0 mmol/L蘇林酸作用后MCF-7細(xì)胞的凋亡率明顯增加(P<0.05)；0.5 mmol/L和1.0 mmol/L蘇林酸作用后TNF-α的相對表達(dá)量分別為2.09±0.67、1.18±0.09，明顯低于對照組的7.42±0.56(P<0.05)。結(jié)論 蘇林酸具有一定抗人乳腺癌細(xì)胞生長的作用，能促使細(xì)胞周期G0～G1期延長，提高細(xì)胞凋亡增敏作用，其作用機(jī)制可能與抑制TNF-α活性有關(guān)。

蘇林酸；NF-κB；TNF-α；細(xì)胞凋亡；增敏作用

伴隨著乳腺癌診斷技術(shù)、放化療技術(shù)以及手術(shù)切除術(shù)的日益成熟，乳腺癌的治療取得了突破性進(jìn)展，治愈率逐年上升，然而還有部分患者不適應(yīng)手術(shù)治療，且對于放化療治療有抵抗性，導(dǎo)致預(yù)后不佳[1]?，F(xiàn)代研究表明細(xì)胞凋亡在腫瘤細(xì)胞的形成與發(fā)展中發(fā)揮重要作用，細(xì)胞凋亡的異?？梢砸鹨幌盗械姆磻?yīng)，包括增殖和轉(zhuǎn)移、細(xì)胞的生長等[2-4]。腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是常見的炎癥因子，被認(rèn)為是導(dǎo)致多種惡性腫瘤發(fā)病的NF-κB信號通路分子[5]。近年流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)常服用非甾體抗炎藥(NSAIDs)者，惡性腫瘤的發(fā)病率下降近50.0%[6-7]。蘇林酸是臨床上廣泛應(yīng)用的一種解熱鎮(zhèn)痛和抗炎NSAIDs，能通過抑制環(huán)氧合酶(COX)從而減少前列腺素(PGs)的合成[8-9]。本研究通過細(xì)胞學(xué)實驗探討了蘇林酸在NF-κB對人乳腺癌TNF-α誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡增敏中的相關(guān)作用，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究材料

人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7為本實驗室保存，采用無血清的干細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)和傳代。將MCF-7靜置培養(yǎng)于5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中。待細(xì)胞培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中MCF-7細(xì)胞的匯合度為85%～90%，采用0.25%胰酶消化處理貼壁細(xì)胞并用培養(yǎng)基重懸，傳代比為1∶3，保證乳腺癌細(xì)胞處于對數(shù)生長期。

1.2 細(xì)胞處理

取對數(shù)生長期的細(xì)胞，加入蘇林酸，使其終濃度分別為0.5 mmol/L(A組)和1.0 mmol/L(B組)，并設(shè)不加蘇林酸的對照組進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3 MTT實驗

蘇林酸處理48 h后，每孔加入MTT 20 μL，于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h后中止培養(yǎng)。將培養(yǎng)液吸入含有200 μL/孔DMSO的酶標(biāo)板中，將已混合液體的酶標(biāo)板常溫振蕩處理10 min，采用酶標(biāo)儀測量吸光度(570 nm)處值，測量三次取平均值，計算蘇林酸作用下的抑制率。

1.4 流式細(xì)胞實驗

蘇林酸處理48 h后，對細(xì)胞進(jìn)行收集工作。對細(xì)胞凋亡進(jìn)行測定時，在單細(xì)胞懸液中加入Propidium iodide(PI)及Annexin-FITC，混勻；在室溫條件中，避光孵育10 min左右，1 h內(nèi)上機(jī)檢測細(xì)胞凋亡率。在測定細(xì)胞周期時，將細(xì)胞冰乙醇固定24 h，然后去除乙醇，加入含有RNA酶的碘化PI 50 μL及1 mL PBS，低溫避光染45 min左右，流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞的周期分布。

1.5 Western blot實驗

采用細(xì)胞刮板收集已處理的MCF-7細(xì)胞，采用細(xì)胞裂解試劑盒處理細(xì)胞，離心收集裂解后上清所含總蛋白，通過BCA試劑盒定量分析蛋白濃度，根據(jù)BCA測定結(jié)果，取30 μg蛋白用于SDS-PAGE電泳，采用轉(zhuǎn)膜技術(shù)將蛋白從電泳膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜，用一定濃度的TNF-α等蛋白的一抗封閉轉(zhuǎn)膜后的PVDF膜，1 h后，用PBST洗3次，每次5 min，將二抗加入洗膜中，反應(yīng)90 min，洗膜后ECL發(fā)光法顯色。

試驗所用Annexin V FITC凋亡檢測試劑盒從BD公司購買，MTT試劑盒從Sigma公司購買，兔抗人TNF-α單克隆抗體為美國Cell Signaling Technology公司產(chǎn)品。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞生長抑制對比

蘇林酸可顯著抑制MCF-7細(xì)胞增殖，同時其增殖抑制作用在特定濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)劑量依賴性。實現(xiàn)結(jié)果顯示，0.5 mmol/L和1.0 mmol/L蘇林酸分別刺激MCF-7細(xì)胞，48 h后測量。發(fā)現(xiàn)MCF-7細(xì)胞的增殖抑制率為(29.17±1.23)%、(38.15±1.51)%，對照組為(1.15±0.02)%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

表1 三組細(xì)胞生長抑制率對比±s)

Note：Compared to the control group，*P<0.05.

2.2 細(xì)胞周期對比

與對照組相比，0.5 mmol/L和1.0 mmol/L蘇林酸作用后均可導(dǎo)致滯留在G0～G1期的MCF-7細(xì)胞顯著增加(P<0.05)(表2)。

GroupsCellcycleattheG0/G1phaseFPGroupA60.44±5.14*4.114<0.05GroupB66.39±4.89*Controlgroup44.20±5.32

Note：Compared to the control group，*P<0.05.

2.3 細(xì)胞凋亡對比

相較于對照組，0.5 mmol/L和1.0 mmol/L蘇林酸作用后MCF-7細(xì)胞的凋亡率明顯增加(P<0.05)(表3)。

表3 三組細(xì)胞凋亡率對比±s)

Note：Compared to the control group，*P<0.05.

2.4 TNF-α表達(dá)對比

經(jīng)過檢測，相較于對照組，0.5 mmol/L和1.0 mmol/L蘇林酸作用后TNF-α的相對表達(dá)量分別為2.09±0.67、1.18±0.09，明顯低于對照組的7.42±0.56(P<0.05)(表4)。

表4 三組細(xì)胞TNF-α相對表達(dá)量對比

Note：Compared to the control group，*P<0.05.

3 討論

乳腺癌是一種高發(fā)的惡性腫瘤疾病，常見于女性，目前臨床主要通過藥物治療來延緩或抑制病情，已有一些藥物可顯著改善乳腺癌患者生活質(zhì)量以及延長患者壽命，然而治療過程中藥物耐受性問題日益凸顯，甚至引起部分乳腺癌患者治療失敗[10]。目前市面上的乳腺癌治療藥物的作用機(jī)制普遍為誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，腫瘤細(xì)胞也普遍是通過突變細(xì)胞凋亡信號通路來實現(xiàn)藥物治療抵抗[11-12]。

細(xì)胞凋亡是一個復(fù)雜的生物過程，凋亡能否進(jìn)行取決于抗凋亡因子和促凋亡因子間的動態(tài)平衡。腫瘤細(xì)胞生存微環(huán)境具備低氧、低pH值、葡萄糖含量偏低以及營養(yǎng)不良等特征，上述微環(huán)境下，腫瘤細(xì)胞的能量代謝、物質(zhì)轉(zhuǎn)運和信號傳導(dǎo)機(jī)制都會發(fā)生顯著改變[13-14]。腫瘤細(xì)胞凋亡通路在長期藥物作用下可能發(fā)生多種不同的突變，大部分常規(guī)治療藥物出現(xiàn)耐受性后，就很難恢復(fù)腫瘤對該藥物的敏感性，因此在藥物治療過程中，通常給予可作用于多個信號通路的藥物或藥物復(fù)合物，以改善臨床中腫瘤對藥物治療的敏感性。NSAIDs對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移均有抑制作用，有規(guī)律服用NSAIDs可使結(jié)腸癌的發(fā)生率降低40%～50%，使直腸癌和結(jié)腸癌的死亡率減少50%，其機(jī)制可能是抑制COX-2、抗血管生成、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等[15-16]。本研究顯示，0.5 mmol/L和1.0 mmol/L蘇林酸分別刺激MCF-7細(xì)胞48 h后，對應(yīng)MCF-7細(xì)胞的增殖抑制率為(29.17±1.23)%、(38.15±1.51)%，對照組為(1.15±0.02)%(P<0.05)；0.5 mmol/L和1.0 mmol/L蘇林酸作用后均可導(dǎo)致滯留在G0～G1期的MCF-7細(xì)胞顯著增加(P<0.05)；相較于對照組，0.5 mmol/L和1.0 mmol/L蘇林酸作用后MCF-7細(xì)胞的凋亡率明顯增加(P<0.05)，說明蘇林酸對乳腺癌細(xì)胞具有一定的抑制作用，促使細(xì)胞周期G0～G1期延長，提高細(xì)胞凋亡增敏作用。

在正常生理狀態(tài)下，機(jī)體內(nèi)抗氧化和氧化機(jī)制之間存在動態(tài)平衡機(jī)制，然而炎癥反應(yīng)的出現(xiàn)會導(dǎo)致體內(nèi)抗氧化和氧化平衡機(jī)制發(fā)生改變，幾天會釋放大量氧自由基，氧自由基可氧化脂質(zhì)形成炎癥因子，進(jìn)而放大機(jī)體炎癥狀態(tài)[17]。在炎癥的發(fā)展過程中，TNF-α的表達(dá)量會明顯增加，且受NF-κB通路的調(diào)控。正常生理條件下，機(jī)體內(nèi)的TNF-α通常與抑制物NF-κB結(jié)合，然而當(dāng)外界因子刺激機(jī)體后，可激活NF-κB激酶，激酶可磷酸化NF-κB，磷酸化的NF-κB可被釋放并與細(xì)胞核內(nèi)的靶基因結(jié)合，促進(jìn)靶基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)[18]。本研究顯示相較于對照組，0.5 mmol/L和1.0 mmol/L蘇林酸作用后TNF-α的相對表達(dá)量分別為2.09±0.67、1.18±0.09，明顯低于對照組的7.42±0.56(P<0.05)，表明蘇林酸誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用可能與抑制TNF-α活性相關(guān)。當(dāng)前也有研究表明，蘇林酸處理乳腺癌細(xì)胞后，可導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變，比如形成凋亡小體、染色質(zhì)濃縮、核致密化、胞膜下陷等[19-21]。

綜上所述，蘇林酸具有一定抗人乳腺癌細(xì)胞生長的作用，能促使細(xì)胞周期G0～G1期延長，提高細(xì)胞凋亡增敏作用，其作用機(jī)制可能與抑制TNF-α活性有關(guān)。

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(收稿：2016-10-22)

Sulindac enhances sensitization effect of NF-κB on apoptosis induced by TNF-α in human breast cancer

ZHANGXuliang1，HUYahua1，HUANGDanqing2

1.Department of Breast Cancer Surgery，Edong Healthcare Huangshi Central Hospital，Puai District，Huangshi 435000，China；2.Department of Ultrasonography，Edong Healthcare Huangshi Central Hospital

Objective The objective of this study was to investigate the role of sulindac in sensitization effects of NF-κB on apoptosis induced by TNF-α in human breast cancer.Methods The human breast cancer MCF-7 cell line was added sulindal in the logarithmic growth phase and the final concentrations of sulindac were 0.5 and 1.0 mmol/L.The cells in control group was cultured without adding succinic acid.After sulindac treatment for 48 h，flow cytometry，MTT and Western blotting were used to analyze the effect and mechanism of cell growth in MCF-7 cells.Results The inhibitory rate of cell proliferation was(29.17±1.23)% and(38.15±1.51)% in MCF-7 cells treated with 0.5 and 1.0 mmol/L of Sulindac for 48 h，respectively，when compared to the control group(1.15 ± 0.02)%(P<0.05).Compared with the control group，0.5 and 1.0 mmol/L of sulindac were significantly increased the G0/G1phase in MCF-7 cells(P<0.05).The apoptosis rate of sulindac in MCF-7 cells was significantly higher than that in the control group(P<0.05).The expression levels of TNF-α were(2.09±0.67)% and(1.18±0.09)% in the concentrations of 0.5 and 1.0mmol/L sulindac，respectively，in MCF-7 cells when compared to the control group(7.42±0.56)%.Conclusion Sulindac has a certain effect on the growth of human breast cancer cells，which can promote the prolongation of cell cycle at the G0/G1phase and improve sensitization of apoptosis.This mechanism may be related to the inhibition of TNF-α activity.

Sulindac；NF-κB；TNF-α；Cell apoptosis；Sensitization effect

黃石市科學(xué)技術(shù)局項目(2015b016-13)

1.鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市中心醫(yī)院普愛院區(qū)乳腺腫瘤外1科(黃石 435000)；2.鄂東醫(yī)療集團(tuán)黃石市中心醫(yī)院超聲科

張緒良，男，(1980-)，碩士，主治醫(yī)師，從事乳腺及甲狀腺腫瘤方面的研究。

黃丹青，E-mail：huangdanq33@163.com

R737.9

A

10.11904/j.issn.1002-3070.2017.02.002