湯大北 金 艷 龔振琴 初 眾 曹仲茹 張清媛

·基礎(chǔ)研究·

三陰性乳腺癌中miRNA-124表達(dá)與E-鈣黏蛋白及雄激素受體的關(guān)系

湯大北 金 艷 龔振琴 初 眾 曹仲茹 張清媛

目的 研究三陰性乳腺癌(Triple-negative breast cancer，TNBC)中miRNA-124(miR-124)的表達(dá)與E-鈣黏蛋白(E-cadherin)及雄激素受體(Androgen receptor，AR)的關(guān)系。方法 采用RT-PCR在TNBC組織和癌旁正常乳腺組織中檢測(cè)miR-124的表達(dá)，免疫組化檢測(cè)TNBC中E-cadherin及雄激素受體(AR)的表達(dá)。結(jié)果 與癌旁正常乳腺組織相比，TNBC組織中miR-124表達(dá)明顯降低(P<0.05)；TNBC組織中，miR-124表達(dá)與組織分級(jí)、E-cadherin表達(dá)有關(guān)(P<0.05)，與AR表達(dá)無(wú)關(guān)(P>0.05)。結(jié)論 在TNBC中，miR-124可能通過調(diào)節(jié)E-cadherin的表達(dá)發(fā)揮抑癌作用。

三陰性乳腺癌；miR-124；E-鈣黏蛋白；雄激素受體

三陰性乳腺癌(Triple-negative breast cancer，TNBC)是指雌激素受體(Estrogen receptor，ER)、孕激素受體(Progesterone receptor，PR)和人表皮生長(zhǎng)因子受體(Human epidermal growth factor receptor，HER-2)均為陰性的一種特殊類型乳腺癌，約占所有乳腺癌的15%，侵襲性高，容易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，預(yù)后差?？笶R、PR的內(nèi)分泌治療和抗HER-2的靶向治療對(duì)TNBC無(wú)效，化療作為目前唯一較為成熟的治療方法卻普遍存在副作用。因此尋找到能夠準(zhǔn)確判定TNBC預(yù)后并對(duì)其進(jìn)行有效治療的方法迫在眉睫。雄激素受體(Androgen receptor，AR)在TNBC的發(fā)生發(fā)展中起重要作用并與預(yù)后相關(guān)，可能成為TNBC靶向治療的新選擇[1]。E-鈣黏蛋白(E-cadherin)是一類介導(dǎo)細(xì)胞間相互黏附的鈣依賴性跨膜糖蛋白，參與形成和維護(hù)細(xì)胞間連結(jié)，作為上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)過程中的重要分子，其表達(dá)下降或缺失可造成乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。相關(guān)研究證實(shí)TNBC組織中E-cadherin及AR的表達(dá)與患者臨床病理特征及預(yù)后有關(guān)[2]。目前雖然對(duì)AR和E-cadherin在TNBC中的表達(dá)情況有所研究，但二者在基因水平的調(diào)控因素尚不明確。

微小RNA(MicroRNA，miRNA)是指長(zhǎng)度約21nt的非編碼小RNA，能夠在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)人體基因組內(nèi)1/3以上的基因表達(dá)[4]。miRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用[5-6]。miR-124是一個(gè)高度保守的抑癌miRNA，它在多種腫瘤中表達(dá)下調(diào)，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及預(yù)后密切相關(guān)。細(xì)胞學(xué)研究證實(shí)在乳腺癌中miR-124直接靶向EMT相關(guān)重要轉(zhuǎn)錄因子Slug，繼而調(diào)節(jié)E-cadherin表達(dá)，影響乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[3]；關(guān)于前列腺癌的研究表明，miR-124可靶向AR，抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)[4]。Liang等[3]應(yīng)用miRanda和TargetScan進(jìn)行生物學(xué)信息預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示miR-124可以靶向人類AR及EMT相關(guān)重要轉(zhuǎn)錄因子Slug(又名Snail2)3′UTR區(qū)。那么在TNBC中，miR-124可否參與TNBC的發(fā)生發(fā)展，與E-cadherin和AR是否相關(guān)，值得進(jìn)一步研究。本研究擬分析TNBC中miR-124表達(dá)情況及其與AR和E-cadherin之間關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 臨床標(biāo)本

新鮮冰凍組織標(biāo)本(腫瘤組織及癌旁正常組織)來自2011年1月—2012年8月入組的74例哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院TNBC患者。中位年齡49歲(28～70歲)。腫瘤組織學(xué)分級(jí)Ⅰ+Ⅱ級(jí)28例(37.8%)，Ⅲ級(jí)46例(62.2%)。

1.2 方法及試劑

1.2.1 免疫組化染色主要試劑及方法 抗AR兔多克隆抗體購(gòu)自Abcam有限公司；抗E-cadherin兔多克隆抗體、即用型SABC(兔IgG)試劑盒和DAB顯色試劑盒均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；免疫組化染色采用SABC法，并按試劑盒操作；抗AR兔多克隆抗體稀釋濃度1∶100；抗E-cadherin兔多克隆抗體稀釋濃度1∶100。

1.2.2 結(jié)果判斷 AR陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)：以細(xì)胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒或棕褐色為陽(yáng)性細(xì)胞，對(duì)每片隨機(jī)選取3個(gè)高倍視野，分別統(tǒng)計(jì)每個(gè)視野的細(xì)胞總數(shù)和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，之后將這3個(gè)視野的陽(yáng)性細(xì)胞率取平均值得到該片的細(xì)胞陽(yáng)性率。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<10%為陰性，≥10%為陽(yáng)性[5]。E-cadherin陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)：以細(xì)胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞，結(jié)果采用半定量記分法判定。按染色強(qiáng)度評(píng)分：無(wú)顯色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；按陽(yáng)性細(xì)胞的百分比評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞≤25%為0分，26%～50%為1分，51%～75%為2分，>75%為3分。最后以兩者乘積所得分值作為判定標(biāo)準(zhǔn)：<4分者為陰性表達(dá)，≥4分者為陽(yáng)性表達(dá)[6]。

1.2.3 總RNA的抽提制備及實(shí)時(shí)定量RT-PCR檢測(cè) 應(yīng)用mirVanaTMRNA Isolation Kit提取總RNA，步驟按試劑盒說明書執(zhí)行。采用上海諾倫生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司的Two Step Stemaim-it miR qRT-PCR Quantitation Kit(SYBR Green)(Cat.NO.LM-0101A)，并依照說明書完成應(yīng)用BIO-RAD公司IQ5型實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃，3 min；變性95℃，20 s；退火及延伸62℃，40 s，重復(fù)40個(gè)循環(huán)。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 以U6為內(nèi)參基因檢測(cè)miRNA的相對(duì)表達(dá)量變化，每個(gè)標(biāo)本3次RQ均值用于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 miR-124在TNBC冰凍腫瘤組織中的表達(dá)

miR-124在TNBC組相對(duì)表達(dá)量為0.34±0.15，癌旁正常組miR-124的相對(duì)表達(dá)量為1.00±0.12。TNBC組明顯低于正常對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1)。

圖1 miR-124在乳腺癌組織與正常組織中表達(dá)的差異性分析Figure 1 Comparison of miR-124 expression in TNBC tissues vs. PN controlsNote：*P<0.05，vs PN controls.

2.2 miR-124表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

miR-124表達(dá)水平與腫瘤的組織學(xué)分級(jí)有關(guān)，組織學(xué)分級(jí)越高，miR-124表達(dá)水平越低(P=0.012)。miR-124表達(dá)與年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)狀態(tài)、臨床分期、月經(jīng)狀態(tài)、及組織學(xué)類型無(wú)關(guān)(P>0.05)(表1)。

表1 miR-124表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 miR-124表達(dá)與AR、E-cadherin的關(guān)系

免疫組化法檢測(cè)TNBC患者冰凍腫瘤組織中AR及E-cadherin在TNBC中表達(dá)情況。AR的陽(yáng)性表達(dá)率為21.6%，E-cadherin的陽(yáng)性表達(dá)率為32.4%(圖2)。

在組織中，AR陽(yáng)性組與陰性組miR-124表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；E-cadherin陽(yáng)性組miR-124表達(dá)水平高于E-cadherin陰性組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.045)(表2)，所以miR-124表達(dá)水平與E-cadherin表達(dá)有關(guān)，與AR表達(dá)無(wú)關(guān)。

表2 miR-124與AR及E-cadherin的關(guān)系

圖2 AR及E-cadherin在TNBC組織中的陽(yáng)性表達(dá)(400×)Figure 2 The positive expression of AR and E-cadherin in TNBC tissue(400×)Note：A.The positive expression of AR in TNBC；B.The positive expression of E-cadherin in TNBC；C.The negative expression of AR in TNBC；D.The negative expression of E-cadherin in TNBC.

3 討論

TNBC是乳腺癌中的特殊亞型，Lehmann等[7]通過基因集群序列表達(dá)法將TNBC分為基底細(xì)胞樣1型(Basal-like 1，BL1)、基底細(xì)胞樣2型(Basal-like 2，BL2)、免疫調(diào)節(jié)亞型(Immunomodulatory，IM)、間質(zhì)型(Mesenchymal，M)、間質(zhì)干細(xì)胞樣亞型(Mesenchymal stem-like，MSL)和管腔雄激素受體亞型(Luminal androgen receptor，LAR)6種亞型。LAR亞型高表達(dá)AR DNA及AR蛋白。對(duì)比其他亞型，化療pCR低，但對(duì)抗雄激素治療敏感[6]。對(duì)AR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的研究有助于TNBC診治及預(yù)后判斷。國(guó)內(nèi)外研究表明[8-9]，AR在非三陰乳腺癌中的表達(dá)率超過70%，在TNBC表達(dá)為10%～50%的AR。多項(xiàng)研究認(rèn)為AR表達(dá)與TNBC預(yù)后不良相關(guān)[9]。本研究中，AR的陽(yáng)性表達(dá)率為21.6%。

E-cadherin是鈣黏蛋白家族的一員，其表達(dá)水平下降可導(dǎo)致細(xì)胞間黏附功能喪失，腫瘤細(xì)胞容易從原發(fā)灶中脫落并發(fā)生浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移，是上皮間質(zhì)化過程的標(biāo)志。研究報(bào)道65%～73%的TNBC患者存在E-cadherin表達(dá)缺失現(xiàn)象[10-11]。在本研究中，有67.6%的患者E-cadherin表達(dá)陰性。在TNBC中，E-cadherin的表達(dá)意義尚無(wú)定論，但多數(shù)研究認(rèn)為E-cadherin表達(dá)陰性組預(yù)后不良。既往研究結(jié)果顯示E-cadherin和AR可作為TNBC預(yù)后的預(yù)測(cè)因子[2]，通過兩者表達(dá)狀態(tài)的聯(lián)合分析，有助于評(píng)價(jià)TNBC的預(yù)后。

目前雖然對(duì)AR和E-cadherin在TNBC中的表達(dá)情況有所研究，但二者在基因水平的調(diào)節(jié)因素尚不明確。miRNA能夠識(shí)別特定的目標(biāo)miRNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。人類腫瘤中普遍存在miRNA的表達(dá)失調(diào)，發(fā)揮癌基因或抑癌基因的功能參與細(xì)胞增殖、凋亡和分化的調(diào)控，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能。在前列腺癌中，miR-124可靶向作用于AR，抑制前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[12]。Lv等[13]通過細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-124可以調(diào)節(jié)一系列轉(zhuǎn)移相關(guān)基因進(jìn)而抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移的多個(gè)步驟。MiR-124/miR-147/miR-193a-3p可共同靶向EGFR驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞周期網(wǎng)絡(luò)蛋白進(jìn)而抑制細(xì)胞周期進(jìn)展和乳腺癌增殖[14]。既往研究提示miR-124在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有抑癌功能，那么在TNBC中，miR-124與E-cadherin和AR是否有關(guān)，其又可否參與TNBC的發(fā)生發(fā)展值得研究。本研究首次在TNBC患者癌組織及其配對(duì)癌旁正常組織中比較miR-124的表達(dá)，RT-PCR結(jié)果顯示TNBC組織miR-124的表達(dá)明顯低于癌旁正常組織。MiR-124的表達(dá)與腫瘤分級(jí)呈負(fù)相關(guān)，與E-cadherin表達(dá)有關(guān)。Wang等[15]報(bào)道結(jié)直腸癌組織中miR-124比其配對(duì)癌旁正常組織的表達(dá)水平要低，并且與腫瘤組織分化程度相關(guān)；Liang等[16]報(bào)道乳腺癌組織中miR-124比其配對(duì)癌旁正常組織的表達(dá)水平低，并且與腫瘤的組織學(xué)分級(jí)及年齡呈負(fù)相關(guān)，與E-cadherin表達(dá)呈正相關(guān)；Lv等[17]在乳腺癌中未發(fā)現(xiàn)miR-124與E-cadherin存在相關(guān)性。本研究結(jié)果與既往研究結(jié)果相似，提示miR-124可能作為一個(gè)抑癌基因參與TNBC的發(fā)生發(fā)展。雖然Shi等[18]發(fā)現(xiàn)miR-124靶向作用于AR，通過抑制AR表達(dá)，上調(diào)抑癌基因p53，抑制前列腺癌細(xì)胞增殖，但本研究結(jié)果未顯示TNBC組織miR-124的表達(dá)與AR表達(dá)具有相關(guān)性，這與Peters在乳腺癌細(xì)胞之中的研究結(jié)果一致[19]。這一結(jié)果提示在不同腫瘤中，同種基因可能受不同的靶基因調(diào)控，乳腺癌中miR-124與AR的關(guān)系需大樣本量的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。

綜上所述，在TNBC中miR-124可能通過調(diào)節(jié)E-cadherin的表達(dá)發(fā)揮抑癌作用。然而本研究樣本量有限，且未進(jìn)行細(xì)胞學(xué)及動(dòng)物學(xué)研究，結(jié)果仍需進(jìn)行大樣本量臨床研究及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)。本研究為揭示TNBC中miR-124的作用及其與AR和E-cadherin的關(guān)系提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 Pietri E，Conteduca V，Andreis D，et al.Androgen receptor signaling pathways as a target for breast cancer treatment[J].Endocr Relat Cancer，2016，23(10)：485-498.

2 Tang D，Xu S，Zhang Q，et al.The expression and clinical significance of the androgen receptor and E-cadherin in triple-negative breast cancer[J].Med Oncol，2012，29(2)：526-533.

3 Liang YJ，Wang QY，Zhou CX，et al.MiR-124 targets Slug to regulate epithelial-mesenchymal transition and metastasis of breast cancer[J].Carcinogenesis，2013，34(3)：713-722.

4 Shi XB，Xue L，Ma AH，et al.Tumor suppressive miR-124 targets androgen receptor and inhibits proliferation of prostate cancer cells[J].Oncogene，2013，32(35)：4130-4138.

5 Luo X，Shi YX，Li ZM，et al.Expression and clinical significance of androgen receptor in triple negative breast cancer[J].Chin J Cancer，2010，29(6)：585-590.

6 Kashiwagi S，Yashiro M，Takashima T，et al.Advantages of adjuvant chemotherapy for patients with triple-negative breast cancer at stage II：usefulness of prognostic markers E-cadherin and Ki67[J].Breast Cancer Res，2011，13(6)：122.

7 Lehmann BD，Jovanovic B，Xi C，et al.Refinement of triple-negative breast cancer molecular subtypes：implications for neoadjuvant chemotherapy selection[J].PLoS One，2016，11(6)：e0157368.

8 Sutton LM，Cao D，Sarode V，et al.Decreased androgen receptor expression is associated with distant metastases in patients with androgen receptor-expressing triple-negative breast carcinoma[J].Am J Clin Pathol，2012，138(4)：511-516.

9 Gasparini P，F(xiàn)assan M，Cascione L，et al.Androgen receptor status is a prognostic marker in non-basal triple negative breast cancers and determines novel therapeutic options[J].PLoS One，2014，9(2)：e88525.

10 Nakagawa M，Bando Y，Nagao T，et al.Expression of p53，Ki-67，E-cadherin，N-cadherin and TOP2A in triple-negative breast cancer[J].Anticancer Res，2011，31(6)：2389-2393.

11 Kashiwagi S，Yashiro M，Takashima T，et al.Significance of E-cadherin expression in triple-negative breast cancer[J].Br J Cancer，2010，103(2)：249-255.

12 Quiros RM，Rao G，Plate J，et al.Elevated serum heparanase-1 levels in patients with pancreatic carcinoma are associated with poor survival[J].Cancer，2006，106(3)：532-540.

13 Lv XB，Jiao Y，Qing Y，et al.miR-124 suppresses multiple steps of breast cancer metastasis by targeting a cohort of pro-metastatic genes in vitro[J].Chin J Cancer，2011，30(12)：821-830.

14 Uhlmann S，Mannsperger H，Zhang JD，et al.Global microRNA level regulation of EGFR-driven cell-cycle protein network in breast cancer[J].Mol Syst Biol，2012，8：570.

15 Van Kouwenhove M，Kedde M，Agami R.MicroRNA regulation by RNA-binding proteins and its implications for cancer[J].Nat Rev Cancer 2011，11(9)：644-656.

16 Siegel R，Naishadham D，Jemal A.Cancer statistics，2012[J].CA Cancer J Clin，2012，62(1)：10-29.

17 O′Day E，Lal A.MicroRNAs and their target gene networks in breast cancer[J].Breast Cancer Res，2010，12(2)：201.

18 Lewis BP，Burge CB，Bartel DP.Conserved seed pairing，often flanked by adenosines，indicates that thousands of human genes are microRNA targets[J].Cell，2005，120(1)：15-20.

19 Melo SA，Esteller M.Dysregulation of microRNAs in cancer：playing with fire[J].FEBS Lett，2011，585(13)：2087-2099.

(收稿：2016-10-27)

Expression of miR-124 and its relationship with E-cadherin and androgen receptor in triple-negative breast cancer

TANGDabei，JINYan，GONGZhenqin，CHUZhong，CAOZhongru，ZHANGQingyuan

Harbin Medical University Cancer Hospital，Harbin 150081，China

Objective The objective of this study was to explore the expression of miRNA-124(miR-124)and its correlation with E-cadherin and androgen receptor(AR)in triple-negative breast cancer(TNBC).Methods The expression of miR-124 was detected by RT-PCR in TNBC tissues and adjacent normal breast tissues.The expression of E-cadherin and AR in TNBC was detected by immunohistochemistry.Results The expression of miR-124 in TNBC tissues was significantly correlated with histological grade and the expression of E-cadherin(P<0.05)，and the expression of miR-124 in TNBC tissues was significantly lower than that in adjacent normal breast tissues.No correlation was found between miR-124 and AR in TNBC tissues(P>0.05).Conclusion In TNBC，miR-124 may play an anti-tumor effect by modulating the expression of E-cadherin.

Triple-negative breast cancer；miR-124；E-cadherin；Androgen receptor

黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(12541507)

哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院(哈爾濱 150081)

湯大北，女，(1983-)，博士，副主任醫(yī)師，從事乳腺癌診療的研究。

張清媛，E-mail：doctortang2008@126.com

R37.9

A

10.11904/j.issn.1002-3070.2017.02.001