劉奇琳，黃祥暉，廖素蘭

(武夷學(xué)院茶與食品學(xué)院，福建武夷山354300)

高效液相法測(cè)定牛奶中4-硝基咪唑抗生素殘留

劉奇琳，黃祥暉，廖素蘭

(武夷學(xué)院茶與食品學(xué)院，福建武夷山354300)

建立了一種分子印跡固相萃取（MISPE）-高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定奶粉中4-硝基咪唑抗生素殘留的方法，樣品經(jīng)自制磁性分子印跡聚合物富集凈化、酸性甲醇-水(9∶1,體積比)洗脫后，用高效液相-紫外檢測(cè)器測(cè)定。檢測(cè)波長(zhǎng)320 nm，色譜柱溫39℃，流動(dòng)相為乙腈-1.0%乙酸/水（體積比），線(xiàn)性范圍為20～5 000μg/L，檢測(cè)限為3.71μg/L，應(yīng)用此方法對(duì)實(shí)際奶粉樣品中4-硝基咪唑抗生素測(cè)定，89.4%～96.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%。該方法具有操作簡(jiǎn)單便捷、快速、靈敏高效等優(yōu)點(diǎn)，可滿(mǎn)足實(shí)際工作的需要。

高效液相；4-硝基咪唑；抗生素；奶粉

硝基咪唑類(lèi)藥物(nitroimidazoles)是一類(lèi)有硝基咪唑環(huán)結(jié)構(gòu)的藥物，因?yàn)槠渚哂歇?dú)特的抗菌抗原蟲(chóng)作用，在畜禽等動(dòng)物養(yǎng)殖領(lǐng)域被較普遍地使用。因其潛在的致畸和致癌性，已經(jīng)被國(guó)際上許多國(guó)家列入違禁藥物名單[1-3]，也被歐盟規(guī)定禁止用于食用動(dòng)物。2002年美國(guó)食品與藥物管理局(FDA)公布了禁止使用的抗生素名單中就有包括多種硝基咪唑化合物。在我國(guó)，農(nóng)業(yè)部和國(guó)家藥品監(jiān)督管理局也規(guī)定硝基咪唑類(lèi)藥物及其鹽、酯及制劑不準(zhǔn)添加入動(dòng)物飼料中，也不允許在食品中使用[4]。

目前，硝基咪唑類(lèi)抗生素的常用檢測(cè)方法主要有氣相色譜法[5]、液相色譜法[6-12]及免疫分析法[13]等。氣相色譜法需衍生，免疫法的檢測(cè)項(xiàng)目有限，質(zhì)譜法儀器昂貴。由于在實(shí)際樣品中硝基咪唑的含量很低且基質(zhì)的成分復(fù)雜，因此在檢測(cè)之前通常需要對(duì)實(shí)際樣品進(jìn)行預(yù)富集處理。固相萃?。╯olid phase extraction，SPE）是目前比較常用的預(yù)富集方法[14-15]，它具有操作簡(jiǎn)便快速、溶劑用量少等特點(diǎn)。磁性分子印跡聚合物（MMIP）結(jié)合了磁性和分子印跡聚合物的優(yōu)點(diǎn)；采用MMIP固相萃取高效液相紫外（HPLC-UV）測(cè)定動(dòng)物源性食品奶粉中4-硝基咪唑藥物殘留量；探索簡(jiǎn)單快捷、靈敏、成本低，可以用來(lái)快速檢測(cè)4-硝基咪唑抗生素的殘留。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀：Agilent 1260 LC（配備紫外檢測(cè)器，二元泵、脫氣泵、色譜工作站）、自動(dòng)進(jìn)樣器和柱溫箱，美國(guó)安捷倫公司；C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；超聲清洗器：上海躍進(jìn)醫(yī)用光學(xué)器械廠(chǎng)；水浴恒溫?fù)u床：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠(chǎng)；pH計(jì)：哈納沃德儀器有限公司；干燥烘箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；分析天平。

4-硝基咪唑（4-nitroimidazole，4-NMZ）標(biāo)準(zhǔn)品，百靈威科技有限公司；乙腈，色譜純，Sigma公司；氯化鈉，冰醋酸，分析純，西隴化工股份有限公司；純凈水，娃哈哈；甲醇，分析純，廣東光華科技股份有限公司；鹽酸，分析純，天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠(chǎng)；檸檬酸、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉，分析純，上海展云化工有限公司；有機(jī)相針式濾膜、一次性有機(jī)相針式過(guò)濾器，天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；一次性無(wú)菌注射器，山東新華安得醫(yī)療用品有限公司；硝唑磁性分子印跡聚合物。

1.2 溶液的配制

0.1 mol/L檸檬酸-McIlvaine緩沖液：將21 g檸檬酸溶于水，并定容到1 L；將1 L的0.1 mol/L檸檬酸和625 mL 0.2 mol/L磷酸二氫鈉混合均勻（調(diào)節(jié)pH到5）。

準(zhǔn)確稱(chēng)取4-NMZ 50.0 mg，用甲醇溶解并定容至50 mL，配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，放置4℃冰箱中避光保存。臨用時(shí)取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，配制成一系列質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)液。

1.3 色譜條件

色譜柱：Agilent C18柱(250 mm×4.6 mm，5μm)；流動(dòng)相：乙腈-1%乙酸水溶液；流動(dòng)相流速：1mL/min；柱溫：39℃；進(jìn)樣量：8μL；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：320 nm；梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Program of gradient elution

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及定量參數(shù)

用流動(dòng)相溶液將硝基咪唑標(biāo)準(zhǔn)工作液稀釋成20～5 000μg/L系列濃度的混合工作液，如前所述的色譜條件對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作液依次進(jìn)樣3次，分別以各種物質(zhì)的質(zhì)量濃度C(μg/L)對(duì)峰面積A進(jìn)行線(xiàn)性回歸分析。并測(cè)定檢出限(instrument detection limit，IDL)。

1.5 樣品前處理方法

將100mg MMIPs加入到燒杯中，分別用5mL甲醇、去離子水活化；取5 mL乙腈奶樣加入20mL純凈水和20mL檸檬酸-Mcllvaine緩沖溶液，混合后在25℃，300 r/min振蕩萃取，再與活化的MMIPs混合，以300 r/min的轉(zhuǎn)速在25℃條件下振蕩；提取完成后，磁場(chǎng)分離；加入90%甲醇水溶液（pH=2）3mL洗滌MMIPs；磁場(chǎng)分離，收集洗脫液，用0.45μm濾膜過(guò)濾，待測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

對(duì)4-硝基咪唑抗生素進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果顯示其在310～320 nm范圍內(nèi)有最大紫外吸收波長(zhǎng)，因此選擇320 nm的波長(zhǎng)檢測(cè)。

2.1.2 流動(dòng)相的選擇

試用了乙腈-1.0%乙酸水溶液作為流動(dòng)相，發(fā)現(xiàn)分離效果較好。酸性條件下硝基咪唑類(lèi)藥物呈離子狀態(tài)，便于分離，峰型尖銳，峰型較好，改變出峰時(shí)間，改善峰型前沿和抑制拖尾的現(xiàn)象，提高了分離度。通常流動(dòng)相乙酸的濃度對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的保留有很大的影響?？疾炝?.5%、0.8%、1.0%以及1.2%的乙酸對(duì)4-硝基咪唑色譜保留的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著乙酸濃度的增加，4-硝基咪唑出峰時(shí)間縮短；考慮到色譜柱使用壽命，不宜使用過(guò)低的pH溶液，選擇1.0%為實(shí)驗(yàn)流動(dòng)相濃度。

2.1.3 柱溫的選擇

改變柱溫，對(duì)色譜保留造成一定的影響?？疾炝瞬煌鶞兀?7、38、39、40、41℃）對(duì)色譜保留的影響，綜合考慮39℃時(shí)色譜保留較為理想，因此選擇39℃為實(shí)驗(yàn)柱溫。

2.1.4 流速的選擇

提高流速可以加快物質(zhì)的出峰速度，降低流速會(huì)延長(zhǎng)出峰時(shí)間、降低柱效。改變流速對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的保留有一定作用。一般用來(lái)對(duì)色譜圖做精細(xì)調(diào)節(jié)。

在其他最優(yōu)色譜條件下考察了0.8、0.9、1.0、1.1、

1.2 mL/min這5個(gè)流速對(duì)4種抗生素的分離效果，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)的流速混合標(biāo)準(zhǔn)液均能完全分離，隨著流速的增加，混合標(biāo)準(zhǔn)液的分離時(shí)間縮短。綜合考慮流速為1mL/min時(shí)的效果最為理想，柱子壓力小。

2.1.5 標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

綜合上述因素，最終采用1%乙酸/水（體積比）為流動(dòng)相，采用梯度洗脫程序，實(shí)現(xiàn)了4 min內(nèi)4-硝基咪唑快速分離檢測(cè)，標(biāo)準(zhǔn)色譜圖如圖1所示，峰形尖銳，峰對(duì)稱(chēng)性好。

圖1 4-硝基咪唑抗生素標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Figure 1 4-nitro imidazole antibiotic standard solution chromatograms

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的線(xiàn)性范圍、檢出限、精密度

定量采用外標(biāo)法，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和相關(guān)參數(shù)見(jiàn)表2。從表中可知，4-硝基咪唑抗生素在20～5 000μg/L濃度范圍內(nèi)具有極好的線(xiàn)性，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 99。經(jīng)測(cè)定標(biāo)樣的檢出限為3.71μg/L，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差3.2%。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和相關(guān)參數(shù)Table 2 Standard curve and calibration parameters

2.3 實(shí)際牛奶粉樣品的測(cè)定

采用磁分散固相萃取-HPLC方法對(duì)實(shí)際奶粉樣品中的4種硝基咪唑抗生素殘留進(jìn)行檢測(cè)，奶粉中均未檢出這4種物質(zhì)，實(shí)際奶粉樣品測(cè)定色譜圖見(jiàn)圖2。對(duì)實(shí)際奶粉樣品的加標(biāo)回收率為89.4%～96.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%。加標(biāo)奶粉樣品色譜圖見(jiàn)圖3。實(shí)際奶粉樣品測(cè)定的前處理過(guò)程中采用90%的甲醇水溶液（pH=2）3.0 mL洗滌MMIPs，洗脫液未經(jīng)氮?dú)獯蹈珊瓦M(jìn)一步濃縮，簡(jiǎn)化了前處理步驟，節(jié)約了時(shí)間與成本。

圖2 空白奶粉樣品色譜圖Figure 2 Blank milk powder sample chromatograms

圖3 加標(biāo)奶粉樣品色譜圖Figure 3 Add themilk powder sample chromatograms

表3 4-硝基咪唑抗生素在奶粉中的平均回收率及精密度Table 3 The recovery and RSD of 4-NMZ standard addition for realmilk power samples

3 結(jié)論

建立了一種磁性固相微萃取-HPLC法同時(shí)測(cè)定奶粉中4-硝基咪唑抗生素的方法，該方法對(duì)奶粉中的4-NMZ的回收率進(jìn)行測(cè)定，回收率89.4%～96.6%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%。證明建立的方法可對(duì)奶粉中的硝基咪唑藥物進(jìn)行檢測(cè)，且具有簡(jiǎn)便、成本低、較高的特異性和靈敏性。

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（責(zé)任編輯：葉麗娜）

Determ ination of 4-Nitroim idazole Antibiotic in M ilk Sam ples Using High Performance Liquid Chromatography

LIU Qilin,HUANG Xianghui,LIAO Sulan
(School of Tea and Food Science,Wuyi University,Wuyishan,Fujian 354300)

Amolecularly imprinted solid-phaseextraction(MISPE)-high performance liquid chromatography(HPLC)method hasbeen developed for determination of4-nitroimidazole antibiotic inmilk power．The analyteswere firstenriched and purified through amagnetic MISPE，and elutedwith acidmethanol-watersolution(9∶1，V/V),then detected by a HPLCwith a UV detector．The detectionwavelengthwas320 nm and the column temperaturewas39℃，usinggradientelution processwith acetonitrile-1.0%aceticacid/water(V/V)as themobilephase．The linearity rangewas 20～5 000μg/L,the limitof detection was 3.71μg/L．The recovery ranges of standard addition for realmilk power sampleswere 89.4%～96.6%，RSD less than 10%．Proving thismethod iseasy,rapid,sensitiveand efficienttomeettheneedsofactualwork．

high performance liquid chromatography(HPLC);nitroimidazoles;antibiotics;milk power

O657.72

A

1674－2109(2017)03－0017－04

2016-12-30

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（201407118）；武夷學(xué)院科技項(xiàng)目（XL201303）。

劉奇琳（1974-），男，漢族，講師，主要從事化學(xué)工程食品安全的研究。