吳杭源，陳衛(wèi)，吳鳴宇

（1.江蘇省無錫市第五人民醫(yī)院 肝病科，江蘇 無錫 214005；2.江蘇省無錫市第五人民醫(yī)院腫瘤科，江蘇 無錫 214005；3.江蘇省無錫市人民醫(yī)院 肝膽外科，江蘇 無錫 214021）

腹腔鏡下射頻消融聯合靜脈化療對PTEN通路和Wnt通路介導肝癌細胞生長的影響

吳杭源1，陳衛(wèi)2，吳鳴宇3

（1.江蘇省無錫市第五人民醫(yī)院 肝病科，江蘇 無錫 214005；2.江蘇省無錫市第五人民醫(yī)院腫瘤科，江蘇 無錫 214005；3.江蘇省無錫市人民醫(yī)院 肝膽外科，江蘇 無錫 214021）

目的探討腹腔鏡下射頻消融術（LRFA）聯合靜脈化療對PTEN通路、Wnt通路介導肝癌細胞生長的影響。方法收集2013年5月-2016年6月該院收治的肝細胞癌患者90例，按照隨機數表法分為觀察組（n=45）及對照組（n=45）。觀察組患者接受LRFA聯合靜脈化療，對照組患者僅接受靜脈化療。術后1周取兩組患者的肝臟病灶組織標本，采用逆轉錄-聚合酶鏈反應法（RT-PCR）檢測其中PTEN信號通路、Wnt信號通路相關基因mRNA表達量；采用放射免疫法檢測血清腫瘤標志物含量。結果治療1周后，觀察組患者的病灶組織PTEN通路相關基因PTEN mRNA表達量高于對照組患者，缺氧誘導因子-1（HIF-1）和血管內皮生長因子（VEGF）mRNA表達量低于對照組患者，差異有統計學意義（P＜0.05）；觀察組患者的病灶組織Wnt通路相關基因β-鏈蛋白（β-catenin）、細胞周期蛋白D1（CyclinD1）、c-myc和基質金屬蛋白酶7（MMP-7）mRNA表達量低于對照組患者，差異有統計學意義（P＜0.05）；觀察組患者的血清腫瘤標志物甲胎蛋白（AFP）、γ-谷胺酰轉肽酶同工酶Ⅱ（GGT-Ⅱ）、胰島素樣生長因子-2（IGF-2）、糖類抗原19-9（CA19-9）含量低于對照組患者，差異有統計學意義（P＜0.05）。結論LRFA聯合靜脈化療可通過PTEN通路、Wnt通路抑制肝癌細胞生長，具有積極的臨床意義。

肝癌；腹腔鏡下射頻消融術；靜脈化療；PTEN通路；Wnt通路

原發(fā)性肝細胞癌是惡性程度較大的腫瘤性疾病，多數患者早期癥狀不顯著、至臨床確診時已到中晚期，只能接受保守治療控制腫瘤細胞生長[1]。全身靜脈化療是最常見的保守治療方法，通過化療藥物的腫瘤細胞毒性作用遏制腫瘤生長。但是全身化療對正常組織臟器的損傷較大，且肝臟腫瘤局部的藥物濃度不高，腫瘤細胞殺滅作用有限[2-3]。腹腔鏡下射頻消融術（laparoscopic radiofrequency ablation，LRFA）是近年興起的全新惡性腫瘤治療方法，較多研究證實該術式與姑息性切除術相比，并未增加患者死亡率且可以減少手術創(chuàng)傷[4-5]。本次研究將LRFA與靜脈化療聯合應用于本院原發(fā)性肝細胞癌患者中，初步探討聯合治療對癌細胞生長的抑制作用?，F報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

經醫(yī)院倫理委員會批準，選取2013年5月-2016年6月本院收治的肝細胞癌患者90例作為研究對象。納入標準如下：①經臨床病理學確診；②原發(fā)性肝細胞癌；③肝細胞癌無遠處轉移；④患者簽署知情同意書。排除標準如下：①伴全身其他組織臟器惡性腫瘤性疾??；②伴嚴重心臟、腎臟功能不全；③伴自身免疫性疾病；④伴造血系統功能障礙；⑤患者自愿放棄治療或者中途退出治療。

按照隨機數表法，90例患者被分為觀察組及對照組各45例。對照組中，男24例，女21例，年齡40～76歲，平均（64.38±7.11）歲，體質指數（body mass index，BMI）值21.5～26.7 kg/m2，平均（23.14±2.98）kg/m2；觀察組中，男25例、女20例，年齡42～73歲，平均（64.15±7.53）歲，BMI值21.3～26.9 kg/m2，平均（23.52±2.76）kg/m2。兩組患者的性別、年齡和BMI值分布差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 治療方法

對照組患者接受常規(guī)靜脈化療，具體如下：奧沙利鉑（L-OHP）85 mg/m2，靜脈滴注、第15天；亞葉酸鈣（LV）200 mg/m2，5-氟尿嘧啶（5-FU）前2 h靜脈滴注，第15和16天； 5-FU 400 mg/m2，靜脈滴注，第15和16天，5-FU 600 mg/m2，微泵注入、持續(xù)22 h，第15和16天。

觀察組患者接受LRFA聯合靜脈化療，具體如下：患者取平臥位，經彩色多普勒超聲儀（荷蘭飛利浦公司，型號IE33）定位肝臟腫瘤位置后常規(guī)消毒鋪巾，局麻下在右上腹肋緣下作一弧形切口，入腹后適當游離腹腔粘連及肝臟。采用射頻治療儀（美國邁德醫(yī)療科技有限公司，型號S-1500）及射頻針，沿腫瘤周圍肝針縫合一圈，根據腫瘤大小步入2或3根射頻針并覆蓋腫瘤根部。設置射頻消融參數如下：輸出功率150 W、靶溫度105℃，對直徑＜4.0 cm的腫瘤科一次性完成治療，對直徑≥4.0 cm的腫瘤科進行多次射頻治療。消融結束后再次B超探查腫瘤是否消融完全，如存在未消融區(qū)域則再次布針對其進行消融。每次退針均在燒針道模式下退出，防止正常肝臟組織出血或者腫瘤種植轉移。拔針后明確無出血、膽漏后結束手術。術后靜脈化療方案同對照組患者。

1.3 蛋白表達的檢測

治療后1周，對兩組患者進行肝臟腫瘤組織活檢，采用逆轉錄-聚合酶鏈反應法（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）測定PTEN信號通路基因PTEN、缺氧誘導因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）mRNA表達量；Wnt信號通路基因β-鏈蛋白（β-catenin）、細胞周期蛋白D1（CyclinD1）、c-myc和基質金屬蛋白酶7（matrix metallo proteinase-7，MMP-7）mRNA表達量。具體方法如下：按照RNA提取試劑盒（美國Sigma公司，貨號T9424）說明進行肝組織標本總RNA提取，采用紫外分析、瓊脂糖電泳檢測總RNA濃度及完整性。根據逆轉錄試劑盒（美國Roche公司，貨號11939823001）說明書將總RNA反轉錄為cDNA。PCR反應條件：95℃，30 s（1個循環(huán)）→95℃，5 s（1個循環(huán)）→60℃，31 s（40個循環(huán)）。反應結束采用軟件分析PCR過程中的CT值，設置對照組患者的目標基因mRNA表達量為100，相應計算觀察組患者的目標基因mRNA表達量。

1.4 血清腫瘤標志物

治療后1周，取兩組患者的空腹、外周靜脈血2 ml，室溫靜置30 min、4℃離心（3 500 r/min）15 min，取上清液并采用放射免疫法測定其中腫瘤標志物甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）、γ-谷胺酰轉肽酶同工酶Ⅱ（gamma glutamyl peptidase Ⅱ，GGT-Ⅱ）、胰島素樣生長因子-2（insulin like growth factor -2，IGF-2）和糖類抗原19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA19-9）含量。

1.5 統計學方法

文中數據錄入軟件SPSS 20.0，計量資料采用均數±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 PTEN通路相關基因表達

治療1周后，觀察組患者的病灶組織PTEN通路相關基因PTEN mRNA表達量高于對照組患者，HIF-1和VEGF mRNA表達量低于對照組患者，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

2.2 Wnt通路相關基因表達

治療1周后，觀察組患者的病灶組織Wnt通路相關 基因β-catenin、CyclinD1、c-myc和MMP-7 mRNA表達量均明顯低于對照組患者，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

2.3 腫瘤標志物

治療1周后，觀察組患者的血清腫瘤標志物AFP、GGT-Ⅱ、IGF-2和CA19-9含量均明顯低于對照組患者，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表1 治療后腫瘤組織PTEN通路相關基因表達量比較 （±s）Table 1 Comparison of expression of PTEN pathway related genes in tumor tissues after treatment （±s）

表1 治療后腫瘤組織PTEN通路相關基因表達量比較 （±s）Table 1 Comparison of expression of PTEN pathway related genes in tumor tissues after treatment （±s）

組別 PTEN HIF-1 VEGF觀察組（n=45） 143.28±18.29 67.21±7.05 70.12±7.65對照組（n=45） 100.00±10.19 100.00±9.88 100.00±11.17t值 7.29 8.19 8.36P值 0.019 0.013 0.011

表2 治療后腫瘤組織Wnt通路相關基因表達量比較 （±s）Table 2 Comparison of expression of Wnt pathway related genes in tumor tissues after treatment （±s）

表2 治療后腫瘤組織Wnt通路相關基因表達量比較 （±s）Table 2 Comparison of expression of Wnt pathway related genes in tumor tissues after treatment （±s）

組別 β-catenin CyclinD1 c-myc MMP-7觀察組（n=45） 67.28±7.09 59.84±6.74 65.37±7.94 71.28±7.69對照組（n=45） 100.00±9.74 100.00±10.05 100.00±9.82 100.00±11.17t值 8.29 9.17 8.62 9.02P值 0.012 0.008 0.010 0.009

表3 治療后血清腫瘤標志物含量比較 （±s）Table 3 Comparison of serum tumor markers after treatment （±s）

表3 治療后血清腫瘤標志物含量比較 （±s）Table 3 Comparison of serum tumor markers after treatment （±s）

組別 AFP/（μg/L） GGT-Ⅱ/（pg/ml） IGF-2/（μg/L） CA19-9/（u/ml）觀察組（n=45） 34.28±4.98 2.01±0.24 153.27±18.95 19.27±2.12對照組（n=45） 91.75±9.06 3.98±0.45 275.88±30.64 38.94±4.76t值 8.29 5.18 11.28 7.39P值 0.013 0.024 0.000 0.019

3 討論

LRFA是目前中晚期惡性腫瘤性疾病的主要治療方法之一，在結直腸肝轉移患者的研究中已經發(fā)現，LRFA可降低腫瘤局部復發(fā)率，肯定了其治療效果。LRFA是將400～500 kHz高頻電流產生的離子震蕩轉化為熱能并傳導至腫瘤細胞內，一旦惡性腫瘤細胞被加熱至≥50℃，將發(fā)現細胞膜溶解、蛋白質變性等一系列不可逆性改變，最終出現腫瘤細胞死亡[6]。LRFA可局部作用于腫瘤組織并使之壞死，對周圍正常組織臟器的影響較小，是目前廣受關注的中晚期惡性腫瘤輔助治療手段。本次研究在傳統靜脈化療基礎上加入LRFA治療，具體從腫瘤生長信號通路等方面展開研究。

較多研究均證實，PTEN信號通路在細胞增殖、凋亡中發(fā)揮重要作用，是腫瘤血管生成的調節(jié)中心[7-8]。PTEN是一種抑癌基因，較多腫瘤中存在其突變及表達減少，是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要因素之一。HIF-1和VEGF均是PTEN信號通路的下游基因，HIF-1在腫瘤缺氧狀態(tài)下充當轉錄激活介質，可與VEGF啟動子缺氧效應元件HRE結合共同調節(jié)VEGF表達、血管內皮生長因子受體（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）轉錄，實現促腫瘤血管新生的作用[9-10]。本研究在治療后獲得肝癌病灶組織標本，經RT-PCR檢測PTEN信號通路基因表達后發(fā)現：與對照組患者相比，觀察組患者的腫瘤組織PTEN信號通路基因PTEN mRNA表達量較高，HIF-1和VEGF mRNA表達量較低，提示加入LRFA治療后肝癌組織的PTEN抑癌活性被激活，同時HIF-1和VEGF等促腫瘤血管生成基因表達被遏制，整體腫瘤細胞的血供及氧供均被阻斷，腫瘤細胞向凋亡發(fā)展。

Wnt信號通路在多種惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中均扮演重要角色，潘理會等[11]的研究明確Wnt信號通路組間蛋白的異常表達直接促使了胃癌的發(fā)生及發(fā)展；蘇金玲等[12]的研究指出，Wnt信號通路間接促進了酒精性肝纖維化患者的肝星狀細胞活化。在近期對肝癌細胞的研究中也發(fā)現，Wnt信號通路及其下游基因參與了肝細胞癌變的過程。β-catenin、CyclinD1、c-myc和MMP-7均是目前公認的Wnt信號通路下游分子，β-catenin處于該通路的關鍵部位，其降解異常及積聚可刺激Wnt信號靶基因CyclinD1、c-myc和MMP-7等轉錄，影響腫瘤細胞生長[13]。有研究發(fā)現β-catenin過表達可存在于82.9%左右的原發(fā)性肝細胞癌患者中，且其表達量與下游基因表達成正相關[14]。本次研究對Wnt信號通路相關基因表達進行檢測發(fā)現：與對照組患者相比，觀察組患者的治療后肝癌組織中Wnt通路相關基因β-catenin、CyclinD1、c-myc和MMP-7 mRNA表達量均較低，提示LRFA可以抑制Wnt信號通路表達，這也是本手術方法發(fā)揮腫瘤殺滅作用的根本途徑之一。

除了PTEN通路、Wnt通路，血清腫瘤標志物的表達情況可宏觀反應臨床治療效果。AFP是最常見的肝癌腫瘤標志物，其含量與肝癌病情嚴重程度呈正相關。GGT-Ⅱ廣泛分布于機體各臟器中，是原發(fā)性肝癌診斷的特異性標志物，其檢測的特異性高達98.0%。戴衛(wèi)鋒[15]的研究指出，肝癌患者的血清GGT-Ⅱ明顯高于非肝癌患者。IGF-2具有促細胞有絲分裂、抗凋亡等作用，可以上調周期素D1表達而促進細胞周期中G1～S期的轉化。CA19-9是胃腸道腫瘤診斷標志物，可以作為肝癌診斷的輔助標志物，與AFP聯合檢測可以大幅提升其診斷價值。本次研究對上述4種血清腫瘤標志物含量進行檢測，結果顯示與對照組患者相比，觀察組患者的血清AFP、GGT-Ⅱ、IGF-2和CA19-9含量均較低，宏觀說明在靜脈化療基礎上加入LRFA可以更為有效地遏制腫瘤活性、具有更為理想的整體治療效果。

綜上所述，LRFA聯合靜脈化療可通過PTEN通路、Wnt通路抑制肝癌細胞生長，可以作為遠期中晚期肝癌治療的可靠手段。

[1] YU S J, YOON J H, LEE J M, et al. Percutaneous ethanol injection therapy is comparable to radiofrequency ablation inhepatocellular carcinoma smaller than 1.5 cm: A matched case-control comparative analysis[J]. Medicine (Baltimore), 2016, 95(35): e4551.

[2] 劉光藝, 李洋, 陳振海, 等. DC-CIK細胞聯合全身靜脈化療治療晚期結直腸癌伴彌漫性肝轉移臨床療效分析[J]. 重慶醫(yī)科大學學報, 2014, 39(3): 368-371.

[2] LIU G Y, LI Y, CHEN Z H, et al. Clinica therapeutic effects of DCCIK cells immunotherapy with FOLFOX regimen on advanced colorectal cancer with diffusely hepatic metastasis[J]. Journal of Chongqing Medical University, 2014, 39(3): 368-371. Chinese

[3] NISKA J R, KEANE F K, WOLFGANG J A, et al. Impact of intravenous contrast enhancement phase on target definition for hepatocellular carcinoma (HCC) and intrahepatic cholangiocarcinoma (IHC): Observations from patients enrolled on a prospective phase 2 trial[J]. Pract Radiat Oncol, 2016, 6(1): e9-e16.

[4] 張前進, 胡伯年, 裴俊烽, 等. 腹腔鏡下射頻消融術在肝癌患者中的臨床應用價值及其對血清血管內皮生長因子和基質金屬蛋白酶-2的影響[J]. 中國內鏡雜志, 2016, 22(9): 10-13.

[4] ZHANG Q J, HU B N, PEI J F, et al. Clinical values of laparoscopic radiofrequency ablation in liver cancer and its impacts on serumal VEGF and MMP-2[J]. China Journal of Endoscopy, 2016, 22(9): 10-13. Chinese

[5] SUCANDY I, CHEEK S, GOLAS B J, et al. Longterm survival outcomes of patients undergoing treatment with radiofrequency ablation forhepatocellular carcinoma and metastatic colorectal cancer liver tumors[J]. HPB (Oxford), 2016, 18(9): 756-763.

[6] GUO Y, WANG J, ZHANG L, et al. Theranostical nanosystemmediated identi fi cation of an oncogene and highly effective therapy inhepatocellular carcinoma[J]. Hepatology, 2016, 63(4): 1240-1255.

[7] 王加佳, 夏中元, 趙博, 等. DJ-1/PTEN通路在糖尿病大鼠心肌缺血/再灌注期間對心肌損傷的影響[J]. 中國現代醫(yī)學雜志, 2013, 23(23): 37-40.

[7] WANG J J, XIA Z Y, ZHAO B, et al. Effects of DJ-1/PTEN signal pathway in myocardial ischemia reperfusion on diabetes rats[J]. China Journal of Modern Medicine, 2013, 23(23): 37-40. Chinese

[8] 朱明月, 符史干, 李孟森, 等. 甲胎蛋白抑制PTEN活性導致肝癌細胞耐受ATRA誘導的凋亡[J]. 生物化學與生物物理進展, 2011, 38(3): 228-231.

[8] ZHU M Y, FU S G, LI M S, et al. Alpha fetoprotein inhibited PTEN activity and caused tolerance to ATRA induced apoptosis in hepatocellular carcinoma cells[J]. Progress in Biochemistry and Biophysics, 2011, 38(3): 228-231. Chinese

[9] HANG X, ZHU S, DI H, et al. Nedd4 depletion inhibits hepatocellular carcinoma growth via targeting PTEN[J]. Cell Physiol Biochem, 2016, 39(2): 768-779.

[10] RAKSHIT N, YANG S, ZHOU W, et al. Adenovirus-mediated co-expression of ING4 and PTEN cooperatively enhances their antitumor activity in human hepatocellular carcinoma cells[J]. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai), 2016, 48(8): 704-713.

[11] 潘理會, 李春輝, 佟曉波, 等. Wnt信號通路的組件蛋白DKK-1、β-catenin及CyclinD1在胃癌中的表達與相互關系[J].實用醫(yī)學雜志,2013,29(15):2517-2519.

[11] PAN L H, LI C H, TONG X B, et al. Expression of Wnt signaling pathway component protein DKK-1、β-catenin、CyclinD1 in gastric cancer and the relationship between them[J]. Journal of Practical Medicine, 2013, 29(15): 2517-2519. Chinese

[12] 蘇金玲, 姜希娟, 郭茂娟, 等. Wnt信號通路對酒精性肝纖維化中肝星狀細胞活化的影響以及整合素連接激酶的調節(jié)作用[J]. 實用醫(yī)學雜志, 2013, 29(5): 718-720.

[12] SU J L, JIANG X J, GUO M J, et al. The role of Wnt signaling pathway in the activation of hepatic stellate cells in alcoholic liver fi brosis and the regulation of integrin linked kinase[J]. Journal of Practical Medicine, 2013, 29(5): 718-720. Chinese

[13] LIU L J, XIE S X, CHEN Y T, et al. Aberrant regulation of Wnt signaling in hepatocellular carcinoma[J]. World J Gastroenterol, 2016, 22(33): 7486-7499.

[14] 張志成, 肖影群, 章萍, 等. Wnt信號通路下游靶基因在HBV相關肝細胞癌中的表達及意義[J]. 廣東醫(yī)學, 2013, 34(1): 75-77.

[14] ZHANG Z C, XIAO Y Q, ZHANG P, et al. Expression and significance of downstream target genes of Wnt signaling pathway in HBV associated hepatocellular carcinoma[J]. Guangdong Medicine, 2013, 34(1): 75-77. Chinese

[15] 戴衛(wèi)鋒. 血清胰島素樣生長因子-2甲胎蛋白-谷氨酰轉肽酶同工酶Ⅱ及異常凝血酶原聯合檢測在肝癌診斷中的價值[J].中國現代醫(yī)學雜志, 2015, 25(15): 34-37.

[15] DAI W F. Clinical value of insulin-like growth factor-2 combinded with alpha-fetoprotein, -glutamyl transferase isoenzymeⅡ and abnormal prothrombin in diagnosis of hepatocellular carcinoma[J]. China Journal of Modern Medicine, 2015, 25(15): 34-37. Chinese

（吳靜 編輯）

In fl uence of laparoscopic radiofrequency ablation combined with intravenous chemotherapy on hepatoma cell growth mediated by PTEN and Wnt pathway

Hang-yuan Wu1, Wei Chen2, Ming-yu Wu3
(1.Department of Hepatology; 2.Department of Oncology, the Fifth People's Hospital, Wuxi, Jiangsu 214005, China; 3.Department of Hepatobiliary Surgery, Wuxi People's Hospital, Wuxi, Jiangsu 214021, China)

ObjectiveTo study the influence of laparoscopic radiofrequency ablation combined with intravenous chemotherapy on hepatoma cell growth mediated by PTEN and Wnt pathway.Methods90 cases of hepatocellular carcinoma patients from May 2013 to June 2016 were chosen as study subjects, all patients were divided into observation group (n= 45), control group (n= 45) randomly. Patients in observation group received laparoscopic radiofrequency ablation combined with intravenous chemotherapy, while those in control group received intravenous chemotherapy only. One week after treatment, two groups patients’ liver lesion tissue PTEN signaling pathway, Wnt signaling pathway related gene mRNA expression were detected by RT-PCR method; serum contents of tumor markers were tested by Radioimmunoassay.ResultsOne week after treatment, liver lesion tissue PTENmRNA expression was higher in observation group than that in control group, HIF-1, VEGF mRNA expression were lower in observation group than those in control group, the difference was statistically signi fi cant (P＜ 0.05); liver lesion tissue Wnt pathway related genes mRNA expression such as β-catenin, CyclinD1, c-myc, MMP-7 were lower in observation group than those in control group, the difference was statistically signi fi cant (P＜ 0.05); serum contents of tumor markers such as AFP, GGT-II, IGF-2, CA19-9 were lower in observation group than those in control group, the difference was statistically signi fi cant (P＜ 0.05).ConclusionLaparoscopic radiofrequency ablation combined with intravenous chemotherapy can inhibit the growth of HCC cells through the PTEN and Wnt pathway, which has positive clinical signi fi cance.

hepatocellular carcinoma; laparoscopic radiofrequency ablation; intravenous chemotherapy; PTEN pathway; Wnt pathway

R735.7

A

10.3969/j.issn.1007-1989.2017.04.012

1007-1989（2017）04-0067-05

2016-12-24