張志勇+陽靜+齊澤民

摘要：針對鐵皮石斛富含多糖、多酚等次生代謝物質的特點，以鐵皮石斛葉片為材料，比較改良AB-LiCl法、SDS法以及試劑盒法提取總RNA的質量，利用電泳檢測、核酸蛋白儀濃度測定、RT-PCR等進行驗證分析。結果表明，3種方法均能提取鐵皮石斛葉片中總RNA，但提取效果存在差異。改良AB-LiCl法提取總RNA的28S和18S條帶清晰、D600 nm/D280 nm與D260 nm/D230 nm分別為1.96和2.03，RNA完整性好、純度高，RNA濃度在3種方法中最高，達到560.6 mg/L，RT-PCR擴增出目的基因片段條帶最明顯，適用于后續(xù)的分子生物學研究。

關鍵詞：鐵皮石斛；總RNA；多糖；AB-LiCl法

中圖分類號： Q522；S567.23+9.01文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）04-0033-02

鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）為蘭科石斛屬多年生草本植物，為2010年版《中華人民共和國藥典》收載的名貴中藥材品種。其干燥鱗莖入藥，具有滋陰清熱、益胃生津、增強免疫力、降血脂、降血糖、抗氧化、抗衰老等多種藥理和保健作用，是石斛屬中最為珍稀名貴的種，位列“中華九大仙草”之首[1-3]。對鐵皮石斛的研究主要集中在化學成分[4]、藥理和臨床作用[1，5-6]、分類鑒定[7-8]、誘變育種[9-10]、組織培養(yǎng)及栽培技術[11-13]等方面。隨著研究的深入，對鐵皮石斛藥用有效成分關鍵基因克隆和相關代謝調控網絡的分子機理解析越來越受到研究者的重視。高質量RNA提取是基因克隆及其功能分析等分子生物學研究的前提，常用的RNA小量提取方法有SDS酚法[14]、異硫氰酸胍法[15]、AB法[16-18]等。鐵皮石斛莖葉中富含多糖、酚類及生物堿等多種次生代謝產物[19]。尤其多糖多酚不易與RNA分離而共沉淀，影響RNA的質量，不利于后續(xù)分子生物學試驗的開展。因此，本研究針對鐵皮石斛多糖、多酚等次生代謝物質含量高的特點，通過比較改良AB-LiCl法、SDS法以及試劑盒法等3種方法提取的總RNA質量，建立1種簡便高效的鐵皮石斛總RNA提取方法，為鐵皮石斛分子生物學研究中RNA高效獲取提供一定的參考。

1材料與方法

1.1材料與試劑

供試鐵皮石斛采自四川省高校特色農業(yè)資源研究與利用重點實驗室大棚，為組培苗移栽后的2年生葉片，分別在相應部位剪取約1 g幼嫩葉片，液氮速凍后置于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

主要試劑：RNAiso Plus試劑盒（Takara公司），Reverse transcriptasM-MLV反轉錄試劑盒（Takara公司）；RNase固相清除劑（華越洋公司）；異硫氰酸胍；DEPC；AB；DL2000 Marker（Takara公司）；SDS、飽和Tris酚、三氯甲烷、β-巰基乙醇、無水乙醇、異戊醇、PVP等均為國產分析純。

試驗中所使用的塑料制品均在RNase固相清除劑為 1/1 000 的溶液中浸泡4 h，高溫高壓滅菌30 min，烘干備用；非塑料制品180 ℃烘烤8 h后使用。所有配制的提取溶液經0.1% DEPC水處理12 h以上，高壓滅菌后使用。

1.2方法

1.2.1SDS法提取總RNA取鐵皮石斛組培苗葉片在液氮中快速研磨至粉末狀，加入80 ℃預熱的SDS提取液，具體操作過程參考劉波等文獻[14]提取百蕊草根系總RNA方法，獲得的RNA沉淀自然干燥后加入30 μL 0.1% DEPC水溶解，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2改良AB-LiCl法提取總RNA取鐵皮石斛組培苗葉片在液氮中快速研磨至粉末狀，在2 mL離心管中加入700 μL 65 ℃預熱的AB提取液和60 μL β-巰基乙醇，劇烈振蕩混勻后置65 ℃水浴10 min，其間搖動4～5次；加入等體積的酚 ∶[KG-*3]氯仿 ∶[KG-*3]異戊醇（25 ∶[KG-*3]24 ∶[KG-*3]1），振蕩混勻，冰浴 10 min；4 ℃、12 000 r/min離心10 min，取上清液至另一新的2 mL離心管，用等體積的酚 ∶[KG-*3]氯仿 ∶[KG-*3]異戊醇（25 ∶[KG-*3]24 ∶[KG-*3]1）重復抽提1次；取上清液，加入1/2體積無水乙醇和1/3體積 10 mol/L LiCl，混勻后-20 ℃靜置過夜；4 ℃、12 000 r/min離心10 min，棄上清；用DEPC處理的75%乙醇漂洗沉淀2次；4 ℃、10 000 r/min 離心5 min，棄上清，RNA沉淀自然干燥后用30 μL 0.1% DEPC處理水溶解沉淀，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3RNAiso Plus試劑盒法提取總RNA將鐵皮石斛葉片在液氮中快速研磨成粉末，使用寶生物（大連）有限公司的RNAiso Plus試劑盒，相關操作參照使用說明進行，提取的RNA沉淀用30 μL 0.1% DEPC水溶解，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4總RNA質量檢測3種方法提取的總RNA樣品濃度和純度均使用核酸蛋白儀檢測，分別記錄D260 nm/280 nm、D260 nm/230 nm值及其濃度，并分別取2 μL RNA溶液在1.0%瓊脂糖凝膠上以10 V/cm電泳15 min，檢測RNA的完整性。

1.2.5RT-PCR檢測分別以上述3種方法提取的總RNA為模板，使用Takara公司的PrimeScriptTM RT regeant Kit試劑盒，oligo dT primer和Random 6 mers為反轉錄引物，按說明書配制10 μL反應體系，37 ℃保溫15 min反轉錄成cDNA，85 ℃ 下5 s使反轉錄酶失活。再以獲得的cDNA為模板，根據已知的鐵皮石斛尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因序列（GenBank：KF711982.1）設計一對特異引物（上游引物：5′-TGATGGTCGTAGTCCGTAAT-3′，下游引物：5′-GGAACCCGTGCCAAACCAT-3′）進行RT-PCR擴增，目的片段大小179 bp。反應條件為94 ℃預變性4 min，（94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s）×30次，72 ℃ 5 min，擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2結果與分析

2.1不同方法提取的總RNA質量比較

2.1.1RNA的完整性

經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測表明，3種方法提取的總RNA均有較整齊、清楚的28S、18S、5S條帶，點樣孔附近無明顯亮斑，說明無蛋白質、糖類等雜質殘留，但電泳結果存在較大差異（圖1）。其中SDS法提取的總RNA雖有3條完整條帶，但RNA濃度較低，改良AB-LiCl法提取的總RNA條帶清晰，亮度高、無明顯拖帶降解現象，其28S、18S條帶與RNAiso Plus試劑盒法提取RNA的28S、18S條帶亮度相當，這表明該方法提取的RNA完整性很好。

2.1.2濃度與純度

D600 nm/D280 nm和D600 nm/D230 nm常用于分析提取的RNA純度，高純度的RNA溶液D600 nm/D280 nm應介于1.8～2.0之間，D600 nm/D230 nm應大于2.0[14]。由表1可見，SDS法提取的RNA D600 nm/D280 nm比值為1.83，但D600 nm/D230 nm 僅為1.62，說明可能有鹽離子等雜質存在。改良 AB-LiCl法和RNAiso Plus試劑盒法提取的RNA D600 nm/D280 nm比值分別為1.96和2.02，D600 nm/D230 nm分別為2.03和1.92，表明所提RNA純度高，蛋白質、酚類、糖類等雜質去除效果較好。改良AB-LiCl法和RNAiso Plus試劑盒法提取的RNA濃度均超過500 mg/L，遠遠大于SDS法的 97.4 mg/L。

2.2RT-PCR擴增結果

的目的片段，與預期結果相符。其中，改良AB-LiCl法擴增的條帶亮度最高，SDS法條帶亮度最弱，可見改良AB-LiCl法提取的總RNA產物能滿足基因克隆、表達等后續(xù)分子生物學研究。

3討論

獲取純度高、濃度大、完整性好的RNA是進行基因克隆、基因表達分析、轉錄組測序等分子生物學操作的前提[14，17，20]。近年來，有關植物RNA的提取方法有很多報道，但不同植物內含物組分及含量有很大差別，導致相關方法不能通用。鐵皮石斛中富含多糖、多酚、生物堿等次生代謝產物，因多糖與RNA間的理化性質很相似，不易分開，在去除多糖的同時容易將大量RNA同時去除，影響后續(xù)試驗。而多酚物質易氧化為醌，與RNA發(fā)生不可逆的結合，進行抽提時同樣會帶走部分RNA，因此，從富含多糖、多酚的鐵皮石斛中提取高質量RNA的關鍵在于有效去除多糖和多酚等次生代謝物質[21]。

對于多糖物質的去除方法主要有高鹽沉淀法、低濃度乙醇沉淀法、LiCl沉淀法、KAc沉淀法等[16]。本研究中，改良AB-LiCl法使用AB作為裂解提取液的效果優(yōu)于SDS法。AB作為強變性劑，能夠有效除去蛋白質等雜質，使用較高濃度的LiCl進行沉淀過夜，能有效去除多糖，同時提取液中加入的PVP也能和多糖結合，去除部分多糖。

RNA提取時去除酚類化合物主要包括加入強還原劑與加入絡合物2種途徑[16]。在提取緩沖液中加入的強還原劑有巰基乙醇、二硫蘇糖醇或半胱氨酸等，其中巰基乙醇使用最廣泛。本試驗中改良AB-LiCl法使用的β-巰基乙醇的濃度提高至4%，同時，加入的絡合物PVP有很強的結合多酚化合物的能力，可以減少酚類物質的影響。

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