李琴琴，趙英虎，高莉，侯倩倩，王芳，賈萬利，王英勇

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納米銀對小麥赤霉病菌的抑制

李琴琴1，趙英虎1，高莉1，侯倩倩1，王芳1，賈萬利1，王英勇2

1 中北大學化工與環(huán)境學院，山西太原 030051 2 中國科學院山西煤炭化學研究所煤轉化國家重點實驗室，山西太原 030001

采用化學還原法制備納米銀，以小麥赤霉病菌為受試菌株，研究納米銀對小麥赤霉病菌抗菌活性、對細胞內3種保護酶：超氧化物歧化酶 (SOD)、過氧化物酶 (POD)、過氧化氫酶 (CAT) 活性和對細胞滲透調節(jié)物質：丙二醛 (MDA)、可溶性蛋白、可溶性糖含量的影響。結果表明：納米銀能顯著抑制小麥赤霉病菌的生長，抑制作用隨著濃度的增加而不斷增大，10μg/mL的納米銀對病原菌的抑制率達90%以上，有效中濃度 (50) 為0.59 μg/mL。隨著納米銀處理時間 (2、4、6、8和10 h) 的增長，3種酶的活性均出現(xiàn)先增加后降低的變化。SOD、POD和CAT均在4 h出現(xiàn)最高值，10 h降至最低。納米銀使得菌體內丙二醛含量增加，可溶性蛋白和可溶性糖含量降低。納米銀破壞了病原真菌體內細胞的完整性，這可能是納米銀抑制病原菌生長的機理之一。

納米銀，小麥赤霉病菌，抗真菌活性，抑菌機理

小麥赤霉病，是由禾谷鐮孢菌引起的病害，主要發(fā)生在亞洲地區(qū)，是小麥生產的重要病害之一[1-2]。小麥感染赤霉病后，會產生單端孢霉烯真菌毒素，從而導致小麥減產以及品質下降，不適合人類和動物的食用[3-4]。中國作為世界小麥生產大國，小麥赤霉病發(fā)生頻率非常高，受小麥赤霉病的影響也很大[5]。納米銀是一種無機抗菌材料，有研究表明，納米銀對細菌、真菌及支原體等致病微生物的生長具有抑制作用，對某些病毒和原生動物也具有很強的殺傷力，同時不產生耐藥性，可以作為一種長效且安全性高的抑菌劑[6-9]。Mishra和Singh[10]研究了納米銀對小麥根腐病菌的抗真菌活性，結果表明納米銀能顯著抑制的菌絲生長。0.05 mg/mL的納米銀能明顯抑制菌絲生長，0.1 mg/mL的納米銀能完全抑制病原體。Muthuramalingam等[11]研究了膽汁鹽修飾的納米銀對炭疽病有很好的抑制效果。此外，納米銀還能夠抑制黃瓜和南瓜白粉病 菌[12]、番茄丁香假單胞菌[13]、草莓灰霉病菌[14]、黑曲霉、溫特曲霉[15]等病原菌。盡管大量的實驗表明，納米銀對細菌和真菌均具有顯著的抑制作用，但是納米銀對真菌具體的殺菌過程及機理還不是十分清楚。

生物體內3種重要的保護酶：超氧化物歧化酶 (SOD)、過氧化氫酶 (CAT) 和過氧化物酶 (POD)，可以防止體內活性氧的產生，清除超氧自由基、H2O2和過氧化物以及降低或抵制羥基自由基的生成等[16-18]。尹大川等[19]研究了木霉菌株T43及其抑菌活性物質對4種林木病原菌的3種保護酶 (CAT、POD、SOD) 活性的影響，結果發(fā)現(xiàn)，菌株T43發(fā)酵液乙酸乙酯提取物對病原菌3種保護酶活性均有不同程度的影響，可導致病原菌3種保護酶活性降低，尤其是SOD活性下降得最為顯著，從而破壞了細胞的完整性。

可溶性蛋白和可溶性糖作為肌體內的滲透調節(jié)物質，當肌體受到外界壓迫時，能夠降低這種傷害。研究表明，可溶性蛋白和可溶性糖的變化可以反映細胞內蛋白質的合成、變性及降解等[19]。丙二醛 (MDA) 含量變化可以反映膜結構的破壞程度，是反映細胞膜脂質過氧化程度的重要指標[16]。

因此，本試驗利用化學還原法制備納米銀，研究納米銀對小麥赤霉病菌的抗菌活性以及對菌體內SOD、POD、CAT三種酶活性和對丙二醛、可溶性蛋白、可溶性糖含量的影響，以此來探討納米銀的抑菌機理，為納米銀抑菌應用提供理論依據(jù)，為解決病原真菌入侵性感染和防治植物真菌病害提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試菌株：小麥赤霉病菌，由中北大學微生物實驗室提供。

1.2 納米銀的制備

首先將10 mL、0.02 mol/L硝酸銀 (AgNO3) 溶液和10 mL、3%聚乙烯吡咯烷酮 (PVP) 溶液混合，然后將該混合液攪拌2 h (室溫)，最后在攪拌的同時，逐滴滴加10 mL、0.01%硼氫化鈉 (NaBH4) 溶液，制備納米銀溶膠。納米銀溶膠經過離心、去離子水和無水乙醇洗滌數(shù)遍、真空干燥得到納米銀粉末。在NaBH4溶液的滴加過程中，反應溶液逐漸變?yōu)榱咙S色，說明納米銀的形成[20]。采用紫外可見分光光度計表征納米銀溶液的UV-vis吸收光譜，進一步利用透射電子顯微鏡 (TEM) 表征納米銀的粒徑。

1.3 納米銀的抗菌活性

利用生長速率法[21]測定納米銀的抑菌活性。具體方法如下：用馬鈴薯葡萄糖(PDA)培養(yǎng)基將納米銀稀釋成終濃度為10、5、2.5、1.25 μg/mL。取培養(yǎng)5 d的5 mm直徑的菌餅，將其輕放于含上述已配制好的不同濃度納米銀的培養(yǎng)基平板中 (有菌絲的一面朝下)。以不添加任何物質的PDA平板作為空白對照，放入28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每個處理重復3次。3 d后用十字交叉法測量病原菌的直徑，計算菌絲生長抑制率、納米銀濃度的毒力回歸方程以及50。

1.4 供試菌的處理

用打孔器取培養(yǎng)5 d、直徑5 mm的菌餅，接種到PDA液體培養(yǎng)基中，靜置培養(yǎng)8 d，將菌絲體用蒸餾水洗滌3次，用吸水紙吸干，準確稱取菌絲0.5 g，分別放入20 mL、10 μg/mL納米銀溶液浸泡2、4、6、8、10 h，過濾菌絲體，用蒸餾水洗滌3次[22]。實驗重復3次，測定納米銀對小麥赤霉病菌保護酶活性、MDA含量、可溶性蛋白含量和可溶性糖含量的影響，其中用DDS-11A型電導儀測定電導率，實驗以蒸餾水作為對照。

1.5 酶活性測定

SOD酶液制備：往已處理過的菌絲體中加入5 mL、0.05 mol/L磷酸緩沖液 (pH 7.8，含有1% PVP，0.5 mmol/L巰基乙醇和0.1 mmol/LEDTA)，冰浴研磨，于4 ℃、10 000 r/min冷凍離心15 min，得到上清液，置于4 ℃冰箱保存。SOD酶活性采用氮藍四唑法[23]測定。

POD和CAT酶液的制備：往已處理過的菌絲體中加入5 mL、0.05 mol/L的磷酸緩沖液 (pH 7.0，含0.1 mmol/LEDTA)，冰浴研磨，4 ℃、10 000 r/min冷凍離心15 min，得到上清液，置于4 ℃冰箱保存。POD酶活性利用愈創(chuàng)木酚法[23]測定。CAT酶活性采用紫外吸收法[24]測定。

1.6 丙二醛 (MDA) 含量的測定

采用硫代巴比妥酸比色法測定小麥赤霉病菌中MDA含量[23]。

1.7 可溶性蛋白含量的測定

可溶性蛋白提?。涸? g已處理過的菌絲體中加10 mL蒸餾水研磨，所得勻漿于12 000 r/min離心15 min，得上清液，定容至10 mL，得粗提液。可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍G-250法測定[23]。

1.8 可溶性糖含量的測定

可溶性糖提?。涸? g已處理過的菌絲體中加入10 mL蒸餾水，沸水浴20 min，冷卻過濾定容至25 mL容量瓶中，得粗提液?？扇苄蕴呛坎捎幂焱壬y定[23]。

1.9 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 22.0和OriginProPorable 8.5軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結果與分析

2.1 納米銀的制備與表征

利用化學還原法制備納米銀，納米銀溶液顏色呈亮黃色。納米銀在400 nm左右出現(xiàn)了很強的吸收峰 (圖1A)，這是典型的10?20 nm納米銀的紫外特征吸收峰[25-26]。進一步通過TEM表征，納米銀為類似球形、粒徑為5?30 nm的顆粒 (圖1B)。

2.2 納米銀的抑菌活性

納米銀對小麥赤霉病菌的抑制效果見表1。結果表明，納米銀能抑制病原真菌的生長，抑制率隨著濃度的增加而增大。其中，10 μg/mL的納米銀對小麥赤霉病菌抑制率高達93.9%，說明病原真菌對納米銀的敏感性很強。對各處理間的不同濃度進行方差分析和Duncan檢驗，結果表明，病原真菌的各處理間差異達到極顯著水平 (<0.01)。

納米銀對病原真菌的毒力回歸方程為=1.256+5.289 2，50為0.59 μg/mL，2為0.975 5?？梢?，納米銀對小麥赤霉病菌的抑制作用比較強。病原真菌的毒力回歸方程的相關系數(shù)2大于0.9，說明其曲線與實際擬合程度相當好。

2.3 納米銀對菌體內保護酶活性的影響

2.3.1 納米銀處理時間對超氧化物歧化酶 (SOD)活性的影響：隨著納米銀處理時間的延長，SOD酶活出現(xiàn)先升高后下降的變化趨勢。SOD酶活從2 h開始迅速上升，4 h的酶活達到最大，是對照組的5.20倍，隨著時間的推移，活性開始下降，10 h的酶活最低，為對照組的63.12% (圖2)。方差分析表明，SOD酶活性對納米銀相對敏感，隨著處理時間的不同，受納米銀的影響存在著顯著性差異。

圖1 納米銀粒子的UV-vis吸收光譜圖 (A) 及TEM圖 (B)

Values in each column with different lowercase letter are significantly different in inhibition rate (<0.05), values in each column with different capital letter are extremely significantly different in inhibition rate (<0.01).

圖2 納米銀處理時間對SOD活性的影響

2.3.2 納米銀處理時間對過氧化物酶 (POD) 活性的影響：POD對照組活性與SOD對照組表現(xiàn)出相似的變化情況，隨著處理時間的增加不斷升高。處理組的POD活性隨著時間的延長同樣呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，在4 h達到最大值，為對照組的1.05倍，與SOD活性最高值出現(xiàn)在4 h相同，在10 h達到最小值，為對照組的14.85% (圖3)。2、4、6、8、10 h各處理組POD活性相比差異顯著。

2.3.3 納米銀處理時間對過氧化氫酶 (CAT) 活性的影響：對照組CAT酶活在試驗時間內，呈上升趨勢，納米銀對小麥赤霉病菌的CAT酶活性出現(xiàn)先升高后下降的變化，與SOD、POD活性呈現(xiàn)出相似的變化趨勢，4 h的CAT酶活出現(xiàn)最大值，處理組的CAT活性一直低于對照組 (圖4)。與其他處理時間的活性相比差異顯著。

圖3 納米銀處理時間對POD活性的影響

圖4 納米銀處理時間對CAT活性的影響

2.4 納米銀對菌體內MDA含量的影響

處理組MDA含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在6 h時，迅速上升至最高值1.40 nmol/g，為對照組的2.41倍，6 h后開始出現(xiàn)下降趨勢，10 h降至最低，為對照組的1.05倍。對照組在2?10 h，呈現(xiàn)平緩的上升趨勢，10 h出現(xiàn)最大值，但始終低于處理組 (圖5)。

圖5 納米銀處理時間對MDA含量的影響

2.5 納米銀對菌體內電導率的影響

隨著處理時間的推移，納米銀處理后的小麥赤霉病菌溶液的導電率2?6 h之內呈現(xiàn)上升趨勢，6 h出現(xiàn)最大值，為對照組的1.09倍，6 h之后，導電率開始下降，10 h出現(xiàn)最小值，為對照組的98.89%。細胞膜一旦受到破壞，膜透性就會增大，從而使細胞內的電解質外滲。上述結果說明，經納米銀處理后，小麥赤霉病菌的細胞膜受到破壞，隨著處理時間的增長，菌體膜的完整性喪失，電解質出現(xiàn)外滲，電導率最終出現(xiàn)下降的現(xiàn)象 (圖6)。

2.6 納米銀對菌體內可溶性蛋白含量的影響

納米銀處理組和對照組的可溶性蛋白含量均呈現(xiàn)降低的趨勢。處理組蛋白含量隨著時間的延長不斷降低，在10 h出現(xiàn)最低值，為1.27 mg/g，是對照組的56.69%。對照組蛋白含量在開始時也出現(xiàn)降低的情況，但始終高于處理組，且降低速率低于處理組 (圖7)。

2.7 納米銀對菌體內可溶性糖含量的影響

納米銀各處理組和對照組的可溶性糖含量及可溶性蛋白含量呈現(xiàn)同樣的降低現(xiàn)象。處理組糖含量隨著時間的增加不斷降低，6 h到10 h下降緩慢，在10 h出現(xiàn)最低值，為0.40 mg/g，是對照組的92%。對照組在整個實驗過程中與處理組趨勢接近，但含量始終高于處理組 (圖8)。

圖6 納米銀處理時間對電導率含量的影響

圖7 納米銀處理時間對蛋白含量的影響

圖8 納米銀處理時間對糖含量的影響

3 討論

納米銀能顯著抑制小麥赤霉病菌的生長，50為0.59 μg/mL。納米銀的抑制作用與其濃度成正比，隨著濃度的增大而增大。10 μg/mL納米銀的抑菌率達到93.9%。Zhao等[27]合成了一種新型的10-Hydroxycanthin-6-one抗菌劑，表明其對小麥赤霉病菌有很強的抑制活性，50 μg/mL的10-Hydroxycanthin-6-one酯類衍生物7s (10-hydroxycanthin-6-one R=CH3CH3) 化合物能完全抑制病原菌的生長，10-meoxycanthin-6-one、10-Hydroxycanthin-6-one 酯類衍生物7s (10-Hydroxycanthin-6-one R=CH3) 和7t (10- Hydroxycanthin-6-one R=CH3CH2) 化合物的最小抑菌濃度在3.91 μg/mL到31.25 μg/mL之間。陸云等[28]研究了4種殺菌劑 (氟環(huán)唑、己唑醇、甲基硫菌靈和南寧霉素毒立) 對小麥赤霉病菌的抑制作用，發(fā)現(xiàn)氟環(huán)唑和己唑醇對病原真菌的抑制效果最好，其50分別是0.201 5 μg/mL和0.235 6 μg/mL；其次是甲基硫菌靈，50是5.115 7 μg/mL；南寧霉素毒力最弱，其50是389.313 24 μg/mL。因此，納米銀較一些殺菌劑有相當或更好的抑菌效果，有望成為一種新型納米殺菌劑。

納米銀處理小麥赤霉病菌2?10 h，菌體內SOD、POD和CAT的活性隨著處理時間的延長均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在4 h達到最高值。結果表明，納米銀在抑菌過程中，影響了菌體內3種酶的活性。原因可能是隨著脅迫程度的增強，氧自由基不斷積累，為了適應環(huán)境，增強本身對脅迫的抵御能力，菌體的酶促系統(tǒng)中SOD、POD、CAT等活性也會相應發(fā)生變化，這是正常生理性抗逆反應。然而菌體細胞在抵御過程中受到了破壞，所以酶的活性出現(xiàn)下降，細胞瀕臨死亡，從而造成菌體的生長受到抑制。通過研究納米銀對3種保護酶活性的影響，得出破壞病原菌的膜保護系統(tǒng)是納米銀抑菌的機制之一。

有研究認為，正常情況下細胞中SOD、POD和CAT 3種保護酶協(xié)調一致，可以防止過多自由基造成的細胞毒害，一旦細胞內自由基所處動態(tài)平衡被破壞，細胞就有可能受到損傷[18]。當細胞受到外界刺激時，SOD能夠嵌入到線粒體基質中，防止細胞中產生過量的活性氧[29]。CAT能夠防止體內過多H2O2的產生，降低細胞發(fā)生氧化的可能性。POD能催化其他物質的同時，將H2O2還原為H2O。SOD、POD和CAT作為生物體內重要的抗氧化酶類，能夠降低對細胞膜起損傷作用的活性氧自由基，防止細胞受到破 壞[30-31]。由此可知，當病原真菌受到納米銀的刺激時，會產生一系列的防御反應，當細胞內活性氧的生成能力超過其清除能力，導致3種保護酶的活性出現(xiàn)暫時升高的現(xiàn)象，但因活性氧自由基的不斷增多，導致細胞受到破壞，進一步抑制菌體的生長，使3種酶的活力開始逐漸下降。高櫞等[32]研究了月腺大戟根總黃酮對尖孢鐮刀菌3種酶活性的影響，發(fā)現(xiàn)了同樣的變化趨勢。魏立強等[33]研究了旱芹粗提物對棉花枯萎病菌保護酶活性的影響，結果表明，隨著納米銀處理時間的增加，菌體內的SOD、POD和CAT活性同樣出現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢。因此，病原真菌體內3種保護酶系統(tǒng)的活性被破壞，損害活性氧自由基清除系統(tǒng)，導致細胞膜系統(tǒng)的完整性嚴重損傷，從而使菌體受到一定程度的破壞。

小麥赤霉病菌經納米銀處理后，病原菌的可溶性蛋白和糖含量降低，病原菌MDA含量和電導率出現(xiàn)先升高后下降的趨勢。計紅芳等[34]研究絨白乳菇發(fā)酵液提取物對楊樹葉枯病菌MDA含量的影響，發(fā)現(xiàn)同樣的變化趨勢。隨著納米銀處理時間的增加，小麥赤霉病菌細胞膜受到破壞，蛋白質的結構出現(xiàn)水解和變性，膜結構的破壞，使得MDA不斷積累，從而出現(xiàn)升高趨勢，電導率由于電解質外滲，同樣出現(xiàn)升高的現(xiàn)象。電導率升高，表明菌絲體浸出液壓力增加，可能是浸出液中存在滲漏的內含物，而滲漏是由于菌絲細胞膜透性遭到了破壞。隨著菌體脂質過氧化程度的加劇，細胞膜的完整性喪失，進一步使得MDA和電導率出現(xiàn)下降趨勢。納米銀可以顯著抑制病原菌的活性，說明該物質可以嚴重破壞病原菌的抗氧化系統(tǒng)，使得蛋白質和糖類水解，進而使細胞膜系統(tǒng)受到損傷，細胞滲透性加強，最終導致細胞死亡。通過研究納米銀對小麥赤霉病菌保護酶活性的影響，為納米銀抗真菌機理以及抑菌應用提供理論依據(jù)，為防治植物真菌病害提供參考。為了進一步了解納米銀對真菌的抑菌機理，仍需要進行分子水平上的研究。

4 結論

納米銀能顯著抑制小麥赤霉病菌的生長，抑制作用隨著濃度的增加而不斷增大，10 μg/mL的納米銀對病原菌的抑制率達90%以上，50為0.59 μg/mL。

隨著納米銀處理時間的增長，3種酶的活性均出現(xiàn)先增加后降低的變化。SOD、POD、CAT均在4 h出現(xiàn)最高值，10 h降至最低。納米銀提高菌體內丙二醛含量，降低可溶性蛋白和可溶性糖含量。

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(本文責編 陳宏宇)

Inhibition ofby silver nanoparticles

Qinqin Li1, Yinghu Zhao1, Li Gao1, QianqianHou1, Fang Wang1, WanliJia1, and YingyongWang2

1,,030051,,State Key Laboratory of Coal ConversionInstitute of Coal ChemistryChinese Academy of SciencesTaiyuanShanxiChina

Silver nanoparticles were prepared by chemical reduction.was used as the test strain. To study the inhibition ofby silver nanoparticles, we studied the activities of protective enzymes superoxide dismutase (SOD), peroxidase (POD) and catalase (CAT), and the contents of osmotic adjustment substances soluble protein, soluble sugar and malonaldehyde (MDA) in. Silver nanoparticles inhibitedand the inhibitory effect was increased with the concentration of silver nanoparticles. The inhibition rate of 10 μg/mL silver nanoparticles was more than 90% and50was 0.59 μg/mL. When the treating time prolonged (2, 4, 6, 8 and 10 h), the activity of SOD, CAT and POD increased firstly and then declined. SOD, POD and CAT reached the maximum at 4 hours, and decreased to minimum at 10 hours. Silver nanoparticles also increased the MDA content and reduced the soluble sugar and protein contents in pathogens. These results indicated that cell integrity was destroyed in the presence of silver. This may be one of the inhibiting mechanisms of silver nanoparticles on the growth of.

silver nanoparticles,, antifungal activity, inhibiting mechanism

Supported by: Shanxi Provincial Projects for Science and Technology Development (No. 20140311008-7), the Foundation of Shanxi Province Key Laboratory of Functional Nanocomposites, North University of China (No. NFCM201603), Research for Shanxi Natural Science Foundation (Nos. 2012021027-3, 2014021027-3)

山西省科技攻關項目 (No. 20140311008-7)，納米功能復合材料山西省重點實驗室開放基金項目 (No. NFCM201603)，山西省青年科技研究基金 (Nos. 2012021027-3, 2014021027-3) 資助。

October 10, 2016; Accepted:November 30, 2016

Li Gao. Tel: +86-351-3922297; E-mail: gaoli@nuc.edu.cn

網絡出版時間：2017-02-13

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20170213.1455.003.html