徐加莉，左思儀，謝承佳，江凌，李霜，黃和，徐嫻

?

番茄紅素基因工程菌多酶調(diào)控研究進展

徐加莉1，左思儀1，謝承佳2，江凌3，李霜1，黃和4，徐嫻4

1 南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院材料化學(xué)工程國家重點實驗室，江蘇南京 211816 2 揚州工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院化學(xué)工程學(xué)院，江蘇揚州 225127 3 南京工業(yè)大學(xué)食品與輕工學(xué)院材料化學(xué)工程國家重點實驗室，江蘇南京 211816 4 南京工業(yè)大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京 211816

作為類異戊二烯化合物中四萜的代表性產(chǎn)品番茄紅素，在生物體中是典型的多酶參與催化的反應(yīng)產(chǎn)物，在2-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸鹽 (MEP) 和甲羥戊酸(MVA) 合成途徑中起著至關(guān)重要的作用。從番茄紅素在原核和真核中的多酶合成途徑出發(fā)，針對番茄紅素合成途徑的各種優(yōu)化策略，首先介紹了多酶合成中的常規(guī)調(diào)控方法，包括多基因共表達質(zhì)粒構(gòu)建、基因順序調(diào)控、啟動子與核糖體結(jié)合位點調(diào)控及基因敲除和替換等方法。之后介紹了一些新型的多酶調(diào)控方法，包括多片段組裝技術(shù)、人工支架自組裝方法等。最后重點介紹了這些多酶調(diào)控方法在番茄紅素合成中的應(yīng)用。這些多酶合成調(diào)控方法為構(gòu)建高產(chǎn)番茄紅素菌株提供了極大的啟發(fā)和研究基礎(chǔ)。

番茄紅素，多酶調(diào)控，支架，基因工程，多片段組裝

番茄紅素是一類C40的異戊二烯類化合物，其研究起始于1873年，由Hartsen首次分離得到番茄紅素的晶體。1910年，Willstaller和Escher首次確定番茄紅素分子式C40H56，分子量為536.85[1]，番茄紅素具有11個共扼雙鍵及2個非共扼雙鍵的非環(huán)狀平面多不飽和脂肪烴鏈，經(jīng)過環(huán)化后可形成β-胡蘿卜素[2]。作為自然界中被發(fā)現(xiàn)的最強抗氧化劑之一，番茄紅素具有預(yù)防心腦血管疾病、提高免疫力、延緩衰老等功效，在癌癥的防治方面效果顯著[3-4]，被廣泛應(yīng)用于食品、藥劑、保健品以及化妝品等行業(yè)中[5]。

目前已報道的番茄紅素生產(chǎn)方法有化學(xué)合成法、天然提取法和微生物發(fā)酵法[6]。化學(xué)合成法步驟繁瑣、存在毒副作用，制約了番茄紅素的規(guī)模化生產(chǎn)。從天然植物中提取番茄紅素可利用常規(guī)溶劑提取、超聲輔助提取、有機溶劑浸提、酶反應(yīng)、微波輻射萃取及超臨界CO2萃取等方法[7]。這些方法中以有機溶劑浸提法提取番茄紅素最為普遍，但這種方法提取效率低，工藝復(fù)雜且成本高。除此之外，天然提取法提取番茄紅素還易受番茄紅素產(chǎn)量及季節(jié)性變化的影響。

現(xiàn)階段隨著基因工程技術(shù)的迅速發(fā)展，以及代謝工程和合成生物學(xué)方法的引入，人們越來越關(guān)注利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)番茄紅素。迄今為止，已有噬夏孢歐文氏菌、草生歐文氏桿菌、卷枝毛霉、布氏須霉、產(chǎn)朊假絲酵母、三孢布拉氏霉菌、藻類和基因工程改造的酵母和細菌等微生物被應(yīng)用于番茄紅素的生產(chǎn)[6,8-9]。隨著番茄紅素合成途徑的闡明和相關(guān)酶基因的克隆，基因重組、基因敲除等技術(shù)手段被廣泛應(yīng)用于番茄紅素合成過程中關(guān)鍵酶的改造、調(diào)節(jié)和修飾，再結(jié)合番茄紅素代謝過程的調(diào)控，以此構(gòu)建的番茄紅素基因工程菌，生產(chǎn)番茄紅素的能力大大提升[10-12]。利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)番茄紅素安全無毒，并能解決番茄紅素產(chǎn)量和產(chǎn)率低、提取成本高等一系列問題，具有巨大的實用價值和開發(fā)前景，是未來的研究熱點[13]。

1 番茄紅素的生物合成途徑

番茄紅素屬于異戊二烯類化合物，在生物體中是一個多酶參與的復(fù)雜代謝產(chǎn)物，它有兩種合成途徑，分別是2-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸鹽 (MEP) 途徑和甲羥戊酸(MVA)途徑[14](圖1)。MEP途徑存在于原核生物中，由丙酮酸和甘油醛-3-磷酸經(jīng)催化生成1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸(DXP)，后轉(zhuǎn)化為MEP，再經(jīng)過一系列酶的催化，生成番茄紅素的合成前體異戊二烯焦磷酸 (IPP) 和二甲基丙烯焦磷酸酯(DMAPP)。MVA途徑存在于真核生物和植物的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，起始于乙酰輔酶A，生成乙酰乙酰輔酶A后再經(jīng)羥甲基戊二酸單酰輔酶A (HMG-COA) 生成MVA，之后再經(jīng)幾步激酶催化反應(yīng)生成IPP。在這兩種途徑中，直接前體IPP和DMAPP在法尼基焦磷酸合成酶的催化下生成法尼基焦磷酸 (FPP)，之后通過牻牛兒基二磷酸合成酶 (GGPS)、八氫番茄紅素合酶 (PSY) 和八氫番茄紅素脫氫酶 (PDS) 這3個關(guān)鍵酶合成番茄紅素，這3個酶分別由基因、和編碼。之后番茄紅素可以繼續(xù)進行環(huán)化、加氧和脫氫等修飾反應(yīng)形成多種結(jié)構(gòu)獨特的類胡蘿卜素及其衍生物。

圖1 生物體中番茄紅素的合成途徑

2 多酶調(diào)控技術(shù)與方法

2.1 多酶合成體系常規(guī)調(diào)控方法

多酶體系指催化機體內(nèi)的一些連續(xù)反應(yīng)的酶互相聯(lián)系在一起，形成的反應(yīng)鏈體系。類似于番茄紅素這種萜類大分子，合成路線長，涉及代謝途徑眾多，因此許多原始番茄紅素產(chǎn)生菌并不是理想的生產(chǎn)宿主，目前研究主要是以傳統(tǒng)基因工程手段對番茄紅素合成途徑中的關(guān)鍵酶進行鑒定和過表達，并優(yōu)化MEP或者MVA途徑，增加前體途徑的供給和限速酶的表達量，這主要通過體外構(gòu)建多基因共表達質(zhì)粒導(dǎo)入到表達宿主中進行關(guān)鍵基因的異源表達來實現(xiàn)?，F(xiàn)在有很多成熟的表達系統(tǒng)用于基因的過表達，例如大腸桿菌和酵母[15]。但是在這些微生物體內(nèi)引入多個基因甚至整條或者多條代謝途徑的過程中，難以保持各步代謝流量的平衡，中間有毒代謝物質(zhì)的大量積累會嚴重影響宿主細胞的生長，導(dǎo)致代謝流量失衡，從而影響產(chǎn)物產(chǎn)量。因此在共表達質(zhì)?；A(chǔ)上對多基因表達進行多層次的控制是必要的，主要策略包括基因順序調(diào)控及上游調(diào)控元件優(yōu)化。基因順序的調(diào)控方式運用在多基因表達產(chǎn)物中很常見，通過改變關(guān)鍵基因的順序影響基因表達量，能夠提高表達蛋白的催化效率，增加產(chǎn)物單位產(chǎn)量。上游調(diào)控元件的優(yōu)化包括啟動子和核糖體結(jié)合位點 (RBS) 調(diào)控。啟動子在代謝工程中所起的作用非常重要，不同系統(tǒng)中采用的啟動子完全不同，啟動子強弱影響基因的轉(zhuǎn)錄水平，從而影響到蛋白的表達。對于共表達質(zhì)粒，一般策略是使用強啟動子(如 T7、T5和Trc等)替換原載體上的弱啟動子，增強基因的轉(zhuǎn)錄，同時將基因的表達置于嚴密控制的條件下，從而提高目標產(chǎn)物的產(chǎn)量。從翻譯水平方面，目的基因上游的核糖體結(jié)合位點可以影響翻譯的起始水平和翻譯速率，改變或調(diào)整RBS序列通常也是對多基因表達調(diào)控比較有效的方法。

除了通過過表達代謝途徑中關(guān)鍵基因外，增加最終產(chǎn)物的另一種方式是阻斷競爭性分支途徑，類異戊二烯化合物番茄紅素的合成會受到宿主內(nèi)源代謝途徑的干擾，除了合成途徑下游的FPP、牻牛兒基牻牛兒基二磷酸(GGPP) 存在分支代謝外，還有相應(yīng)的其他代謝途徑如胞質(zhì)乙酰CoA的合成途徑，會與番茄紅素競爭合成前體。阻斷分支途徑的方法一般是基因的敲除或替換。在敲除或替換基因的方法中，λ-Red重組技術(shù)是近年來應(yīng)用較廣的DNA同源重組技術(shù)，該技術(shù)可以簡單、快速地對任意大小的DNA分子進行插入、敲除和突變等多種修飾，堿基突變率很小。此外基因編輯方法——CRISPR/Cas9技術(shù)也應(yīng)用到了類異戊二烯的代謝途徑改造中，CRISPR/Cas9技術(shù)是一種由向?qū)NA引導(dǎo)Cas9蛋白對靶序列DNA進行切割的技術(shù)手段，該系統(tǒng)以接近100%的編輯效率對基因進行插入、敲除和替換，可引入多種類型的基因修飾，方便快捷。與傳統(tǒng)基因敲除技術(shù)相比，CRISPR/Cas9技術(shù)在具有完整的錯配修復(fù)系統(tǒng)的細胞中有較高編輯效率，有利于細胞基因組穩(wěn)定遺傳。

2.2 多酶合成體系調(diào)控技術(shù)的新策略

上述內(nèi)容已經(jīng)介紹了在轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平、阻斷競爭性分支代謝途徑等層面對多酶合成進行調(diào)控的方法，隨著生物技術(shù)的進步，一些新的調(diào)控策略應(yīng)運而生。

2.2.1 多片段組裝技術(shù)

以番茄紅素為代表的復(fù)雜天然產(chǎn)物都是多酶參與的順序合成產(chǎn)物，前一個酶催化反應(yīng)的產(chǎn)物(中間產(chǎn)物) 是下一歩酶催化反應(yīng)的底物，但在細胞工廠中，這些酶分子之間的距離很難控制，通常情況下處于游離狀態(tài)，從而制約了其催化效率。通過Linker將兩個或多個蛋白連接起來的融合蛋白技術(shù)[16]可以很好地解決這類問題。在構(gòu)建基因工程菌的過程中，多個片段的連接是非常重要的，Linker在其中起到了關(guān)鍵作用，這關(guān)系到基因片段的高效連接，以及融合蛋白中的不同蛋白是否能夠分別形成正確的空間結(jié)構(gòu)、發(fā)揮各自的生物學(xué)活性。

目前新興起來的Gibson Assembly?組裝方法是另一種簡單的等溫一步拼接法，由Gibson[17]開發(fā)，對于多片段組裝，只需要對待克隆的DNA片段 (包括載體) 進行PCR擴增，片段兩端添加15 bp到30 bp的同源臂。之后在Gibson Assembly的孵育體系中，依靠同源臂之間的重疊序列退火，即可按正確的順序進行拼接，形成完整的雙鏈DNA分子，實現(xiàn)無痕拼接。該方法能直接使用PCR片段，不需要回收步驟，并且可以同時快速處理多個片段，因此在多片段組裝中廣泛使用。

隨著多片段組裝技術(shù)的進步，婁春波等[18]開發(fā)出了一種新型的DNA片段組裝技術(shù)Oligo-linker mediated assembly (OLMA) 方法，此方法引入多個寡核苷酸雙鏈片段作為linker，依靠這樣的短片段，可以將DNA片段按照預(yù)先設(shè)計好的順序進行組裝，該技術(shù)在模塊化組裝多個片段以及額外添加調(diào)控元件如RBS及啟動子片段方面頗具成效。

2.2.2 支架介導(dǎo)的多酶組裝技術(shù)

近年來隨著生物技術(shù)與材料科學(xué)的快速發(fā)展，新一批的多酶組裝方法隨之產(chǎn)生，這就是支架介導(dǎo)的多酶組裝方法。這些方法是通過人工合成的支架固定催化反應(yīng)中的酶，在縮短酶與酶的空間距離，以及實現(xiàn)底物通道效應(yīng)的基礎(chǔ)上，還可通過調(diào)整支架對酶結(jié)合數(shù)量進行精確控制，從而平衡整體代謝流量[19]。人工合成支架的構(gòu)建形式包括蛋白支架、RNA支架及DNA支架等。

蛋白支架通常是相互作用的蛋白對，或是蛋白質(zhì)多聚物，生物體中存在著許多具備自組裝性質(zhì)的蛋白，因此可以按照實驗設(shè)計所需合理地將這些蛋白組裝起來，構(gòu)建蛋白支架。在人類基因組中，RNA也占據(jù)了很大的份額，高達90%的基因組會被轉(zhuǎn)錄成RNA，在生物活動中起著重要作用。近年來，RNA也被應(yīng)用于胞內(nèi)組裝多酶，合成RNA支架與RNA配基Aptamer結(jié)合使用，其中RNA配基Aptamer是一種能與RNA結(jié)合的適配體蛋白，通過適配體蛋白與目標蛋白或目標酶結(jié)合，將多酶體系中的不同酶定位至RNA上，實現(xiàn)酶與酶之間空間距離的縮減。DNA支架的構(gòu)建形式不同于其他兩種支架，是將目的蛋白與鋅指蛋白融合表達，以鋅指蛋白的鋅指結(jié)構(gòu)為結(jié)合域特異性識別DNA支架上堿基序列并與之結(jié)合，實現(xiàn)目的蛋白按照底物-產(chǎn)物的催化順序在支架上的“自組裝” (圖2)。相較于蛋白支架和RNA支架，DNA支架不會存在錯誤折疊、容易聚集及降解等問題。DNA支架可以通過堿基互補配對實現(xiàn)精準控制，因此可被廣泛應(yīng)用于固定化、自組裝目的蛋白等方面。

圖2 DNA支架的構(gòu)建模式

3 多酶調(diào)控技術(shù)在番茄紅素合成中的應(yīng)用

3.1 常規(guī)方法構(gòu)建番茄紅素工程菌

在利用共表達質(zhì)粒異源表達番茄紅素關(guān)鍵基因的方法中，番茄紅素合成基因、和大多來源于噬夏孢歐文氏菌、草生歐文氏桿菌和泛菌屬等微生物，將這3個基因構(gòu)建共表達質(zhì)粒后導(dǎo)入到酵母或者大腸桿菌中表達生產(chǎn)番茄紅素。如Yoon等[20]分別從成團泛菌和鳳梨泛菌兩株菌中擴增出番茄紅素合成的關(guān)鍵基因、和，整合到質(zhì)粒pTrc99A上并導(dǎo)入到大腸桿菌中。在2YT培養(yǎng)基中，無IPTG誘導(dǎo)劑情況下，攜帶來源于基因的菌株番茄紅素的產(chǎn)量為27 mg/L。加入0.1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)劑時，攜帶來源于基因的菌株，番茄紅素的產(chǎn)量是12 mg/L，是攜帶基因的2倍多。Jin等[21]將來源于耐輻射奇異球菌R12的、、基因克隆至表達載體pET22b上，獲得重組質(zhì)粒pET-EBI，導(dǎo)入大腸桿菌后番茄紅素的產(chǎn)量為49 mg/g DCW，發(fā)酵液中產(chǎn)量為417 mg/L。劉天罡等[22]從中擴增出、和基因，構(gòu)建了6個質(zhì)粒和3個菌株，其中菌株L3獲得的番茄紅素最高產(chǎn)量為1 440 mg/L。Miura等[23]在產(chǎn)朊假絲酵母中導(dǎo)入了外源的、、基因，獲得重組菌株的番茄紅素產(chǎn)量達到758 μg/g DCW。Matth?us等[24]將的、和解脂耶氏酵母的TEF1啟動子、終止子控制元件插入質(zhì)粒pUCBM21，轉(zhuǎn)入到解脂耶氏酵母中產(chǎn)生了16 mg/g DCW的番茄紅素。Araya-Garay等[25]將來源于的、、基因插入到質(zhì)粒pGAPZB中，構(gòu)建了表達番茄紅素合成過程中3個關(guān)鍵酶質(zhì)粒pGAPZB-EBI，將此質(zhì)粒導(dǎo)入畢赤酵母X33后番茄紅素的產(chǎn)量為1 141 μg/g DCW。Bhataya等[26]也以畢赤酵母X33作為宿主，從不同細菌中擴增出番茄紅素的關(guān)鍵基因構(gòu)建到pGAPZB質(zhì)粒上，所構(gòu)建的酵母工程菌在甲醇等有機物條件下高密度培養(yǎng)，菌體番茄紅素產(chǎn)量達4.6 mg/g DCW，發(fā)酵液中番茄紅素產(chǎn)量達73.9 mg/L。Sun等[27]從三孢布拉霉中克隆出β-類胡蘿卜素合成途徑中的關(guān)鍵基因和基因，兩者分別表達異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶和牻牛兒基二磷酸合成酶，在大腸桿菌中異源表達后，β-類胡蘿卜素的產(chǎn)量由0.5 mg/g DCW上升到0.95 mg/g DCW。以上例子都說明，通過基因工程技術(shù)構(gòu)建多順反子表達番茄紅素合成基因，使得原本不產(chǎn)生色素的大腸桿菌、酵母等菌株產(chǎn)生色素，從而生產(chǎn)發(fā)酵得到番茄紅素，利用不同來源的番茄紅素合成基因構(gòu)建的基因工程菌及其產(chǎn)量總結(jié)見 表1。

表1 重組大腸桿菌和酵母生產(chǎn)番茄紅素能力的比較

Table 1 Comparison of lycopene production capacity between recombinant Escherichia coli and yeast

Gene sourcesRecombinant strainsLycopene productionFermentation typeReferences (mg/L)(mg/g) Pantoea agglomeransE. coli60–Shake-flask fermentation[20] Pantoea ananatisE. coli35–Shake-flask fermentation[20] Pantoea agglomeransE. coli1 35032.0Fed-batch fermentation[28] Erwinia herbicolaE. coli–7.6Shake-flask fermentation[10] Erwinia herbicolaE. coli10222.0Shake-flask fermentation[12] Pantoea agglomeransE. coli1 050–Shake-flask fermentation[29] Erwinia herbicolaE. coli7833.4Shake-flask fermentation[30] Deinococcus wulumiqiensis R12E. coli1 288157.1Fed-batch fermentation[31] Pantoea agglomeransE. coli3 52050.6Fed-batch fermentation[32] Pantoea ananatisE. coli1 44032.1Fed-batch fermentation[22] Erwinia uredovoraCandida utilis–0.8Shake-flask fermentation[23] Erwinia uredovoraPichia pastoris–1.1Shake-flask fermentation[25] Pantoea ananatisYarrowia lipolytica–16.0Fed-batch fermentation[24] Erwinia uredovoraSaccharomyces cerevisiae–3.3Shake-flask fermentation[33] Different bacterial speciesPichia pastoris X33744.6Fed-batch fermentation[26]

多酶合成體系中多基因表達的協(xié)同作用非常必要，因此基因順序的調(diào)控在番茄紅素合成體系中也至關(guān)重要。Jin等[31]構(gòu)建了24個含有番茄紅素合成關(guān)鍵基因順序不同的重組質(zhì)粒，討論基因順序?qū)Ψ鸭t素合成的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因順序的不同對番茄紅素的合成具有很大的影響，篩選獲得的最高產(chǎn)菌株IEB11，其番茄紅素的產(chǎn)量是菌株EBI11的2倍多。Zhang等[18]構(gòu)建了11個番茄紅素合成基因順序不同的菌株，其中菌株BIE的番茄紅素產(chǎn)量是菌株EIB的 3倍，證明了基因順序?qū)Ψ鸭t素的合成有較大影響。Xie等[34]在釀酒酵母中異源表達合成β-胡蘿卜素，通過對上下游及FPP競爭途徑的順序調(diào)控，以預(yù)定的順序排列萜類化合物生物合成過程中的關(guān)鍵代謝節(jié)點的基因，由此發(fā)酵液中類胡蘿卜素的產(chǎn)量為1 156 mg/L (20.79 mg/g DCW)。Ye等[35]通過改變基因的順序構(gòu)造了10個高效的多順反子的質(zhì)粒，通過蛋白電泳分析得出其中酶活最高的是質(zhì)粒pET-P-B。

啟動子的置換是調(diào)控多基因表達體系的常見手段，啟動子的強度對目的基因在工程菌中的表達發(fā)揮了重大作用，由此影響整個代謝流。翁志明等[11]將基因的天然啟動子置換為T5啟動子，導(dǎo)致重組大腸桿菌中番茄紅素的產(chǎn)量提高了103%。Bahieldin等[33]在釀酒酵母中外源表達來自歐文氏菌的、、三個關(guān)鍵基因，并在此之前加入了葡萄糖阻遏型啟動子ADH2，重組菌株番茄紅素產(chǎn)量達到了3.3 mg/g DCW，遠遠高于異源表達同樣3個基因的其余菌株。Suh等[36]用強啟動子T5調(diào)控MEP途徑中的關(guān)鍵基因、和后，類胡蘿卜素產(chǎn)量比對照提高了4.5倍。Zhao等[14]采用6個不同強度的人工啟動子調(diào)控元件對大腸桿菌MEP途徑中的7個基因進行調(diào)控，最終使β-胡蘿卜素產(chǎn)量提高3.5倍，并提出替換強啟動子對于獲得目的產(chǎn)物的最大代謝流量來說并不一定是最優(yōu)的。這些例子說明，不同啟動子對于產(chǎn)物的合成是具有顯著影響的，但并不表示使用強啟動子就能獲得最高的酶活和最大的產(chǎn)物產(chǎn)量，因此在后期研究中，往往需要考察不同啟動子及宿主的適配性，從而選擇出最優(yōu)的啟動子。

對RBS序列進行優(yōu)化能夠提高蛋白的表達量，將此方法應(yīng)用到番茄紅素多酶合成調(diào)控中，能夠有效地提高番茄紅素的產(chǎn)量，如Kang等[37]從基因組中擴增出、、和基因，由此構(gòu)建質(zhì)粒pAC-LYCO4，在質(zhì)粒pAC-LYCO4基礎(chǔ)上使用強RBS序列調(diào)控，經(jīng)調(diào)控優(yōu)化后番茄紅素的產(chǎn)量是未調(diào)控的3倍。Wang等[38]采用“多重自動基因組改造技術(shù)” (Multiplex automated genome engineering, MAGE)，定向改造大腸桿菌中番茄紅素合成過程中的20個基因的RBS序列，最終篩選得到高產(chǎn)菌株，番茄紅素產(chǎn)量提高了5倍。Jin等[21]在基因和之前插入了兩種不同的RBS調(diào)控序列，導(dǎo)入大腸桿菌經(jīng)優(yōu)化后番茄紅素的最高產(chǎn)量為88 mg/g DCW，比未插入RBS調(diào)控序列重組菌的番茄紅素產(chǎn)量提高了2倍。Ye等[35]在一個高效的多順反子質(zhì)粒上構(gòu)建多級酶聯(lián)反應(yīng)，通過改變RBS序列及其與起始密碼子之間的序列aligned spacing (AS)，在最佳RBS及AS序列條件下，質(zhì)粒pET-B-SD2-AS1-P所表達酶的酶活比原始質(zhì)粒高4 U/mg。戴冠蘋等[39]通過RBS文庫對MEP合成途徑中關(guān)鍵基因、和進行調(diào)控，使β-胡蘿卜素產(chǎn)量相對于出發(fā)菌株提高了35%，并且發(fā)現(xiàn)通過RBS調(diào)控，可調(diào)控范圍較廣，這種調(diào)控方法從某種程度上比使用多個固定強度調(diào)控元件更有利于類胡蘿卜素的生產(chǎn)，同時也為基因表達的精確調(diào)控提供一種新的思路。

在萜類物質(zhì)的合成過程中，IPP轉(zhuǎn)化為DMAPP是限速步驟，通過對此環(huán)節(jié)關(guān)鍵基因的過表達，可以顯著提高番茄紅素的產(chǎn)量，如Zhu[22,40]在質(zhì)粒pFZ110的基礎(chǔ)上插入片段，由此獲得菌株L3的番茄紅素產(chǎn)量是原菌株L2的2倍。Zhao等[14]過表達MEP途徑中限速步驟中的、和基因，使得番茄紅素產(chǎn)量從0.89 mg/g DCW提高到5.39 mg/g DCW。

在利用λ-Red重組技術(shù)阻斷番茄紅素合成途徑中的中間產(chǎn)物流向分支途徑的方法中，翁志明等[11]利用λ-Red重組技術(shù)敲除谷氨酸脫氫酶編碼基因、丙酮酸脫氫酶基因、甲醛脫氫酶編碼基因，阻斷了丙酮酸分解支路，增加了MEP途徑中起始物丙酮酸的積累，并提高了NADPH供給，促進了產(chǎn)物番茄紅素的合成，產(chǎn)物產(chǎn)量提高了103%。Lu等[41]利用λ-Red重組技術(shù)將基因的啟動子用文庫中的啟動子和信使RNA替換掉，通過測定β-半乳糖苷酶的產(chǎn)量確定了最強啟動子，之后將此啟動子應(yīng)用到番茄紅素的合成之中。Sun等[32]敲除了β-胡蘿卜素生產(chǎn)菌中的玉米黃素糖基轉(zhuǎn)移酶() 和番茄紅素環(huán)化酶基因()，阻斷了β-胡蘿卜素的合成，敲除后番茄紅素產(chǎn)量達到50.6 mg/g DCW。Zhou等[10]將中心碳代謝途徑中葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因 () 進行敲除后，番茄紅素的產(chǎn)量提高了130%。

最新的基因編輯方法CRISPR/Cas9技術(shù)也已被應(yīng)用于番茄紅素及其相關(guān)產(chǎn)物合成途徑的優(yōu)化中，如Li等[42]將來源于菌株的番茄紅素和β-類胡蘿卜素合成關(guān)鍵基因、、、整合到大腸桿菌染色體上，通過CRISPR/Cas9技術(shù)對MEP途徑、產(chǎn)物合成途徑以及中心碳代謝途徑中的33處進行優(yōu)化來改變代謝通路，獲得了100多個突變體，最終獲得了能產(chǎn)生2 g/L β-類胡蘿卜素的高產(chǎn)菌株。EauClaire等[43]應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)從斯氏泛菌DC413菌株中擴增出、、、和基因，導(dǎo)入到釀酒酵母中，作為過表達番茄紅素合成基因的另一途徑。Ronda等[44]通過CRISPR/Cas9技術(shù)將β-胡蘿卜素合成的相關(guān)3條途徑的基因精確而高效地整合到釀酒酵母基因組上的相應(yīng)位點，超過84%的都是正確克隆。Tadas等[45]應(yīng)用此技術(shù)以一步轉(zhuǎn)化的方法對基因組上5個不同的位點同時進行編輯，成功構(gòu)建了MVA高產(chǎn)菌株，相較于野生型釀酒酵母，高產(chǎn)菌株的產(chǎn)量提升了41倍。這些相關(guān)研究的最新進展表明這項高效的多重基因組編輯技術(shù)的應(yīng)用漸趨成熟，在功能基因組學(xué)和代謝工程中具有極大的應(yīng)用潛力。

3.2 多酶調(diào)控新技術(shù)在番茄紅素合成體系中的應(yīng)用

多片段組裝技術(shù)在番茄紅素多酶體系中常用于酶與酶的連接及調(diào)控元件的引入，Linker序列的設(shè)計和選擇十分重要。Arai等[46]在兩個不同功能的蛋白結(jié)構(gòu)域之間插入了不同類型和不同長度的linker序列，研究結(jié)果表明隨著linker長度的增加，會形成更多的螺旋，這些螺旋linker會控制兩個結(jié)構(gòu)域之間的距離并且能夠減小兩者之間的干擾。Heider等[47]在構(gòu)建重組質(zhì)粒時，使用Gibson assembly方法將MEP途徑中的多個基因，2個操縱子片段和RBS調(diào)控片段同時組裝到質(zhì)粒上，方便快捷。Zhang等[18]運用獨特的OLMA方法 (Oligo-linker mediated assembly method)，將番茄紅素合成途徑中的4個基因和不同強度的RBS調(diào)控片段，以及不同的基因順序進行DNA模塊化組裝，無需測序即可一步構(gòu)建至載體上。

而一些由支架介導(dǎo)的多酶調(diào)控技術(shù)也應(yīng)用到番茄紅素合成途徑中，主要是增加MVA途徑中MVA的產(chǎn)量：Dueber等[48]設(shè)計了一個蛋白支架，利用支架與目標蛋白相結(jié)合的能力，將MVA途徑中的3個關(guān)鍵酶硫解酶 (AtoB)、HMG-CoA合成酶 (HMGS)和HMG-CoA還原酶 (HMGR) 按一定的比例組裝固定在蛋白支架上，形成了可控的代謝途徑，成功將番茄紅素合成前體甲羥戊酸的產(chǎn)量提高了77倍，并減少了宿主的代謝負荷。Conrado等[49]利用DNA支架，在大腸桿菌中進行了甲羥戊酸的途徑優(yōu)化。從酶的配比、酶結(jié)合序列之間的堿基數(shù)等方面進行研究，將MVA途徑中的3種關(guān)鍵酶AtoB、HMGS和HMGR進行順序調(diào)控，并通過改變支架堿基序列從而調(diào)整代謝途徑中酶的化學(xué)計量數(shù)比 (圖3)，最終MVA的產(chǎn)量達到1.7 g/L，比無支架體系提高了3–5倍，解決了酶和代謝物的簡單擴散和隨機碰撞導(dǎo)致的低效率問題。目前，利用支架應(yīng)用在番茄紅素、β-胡蘿卜素等類胡蘿卜素產(chǎn)物合成體系中的研究還鮮見報道。

除此之外，這些支架體系也應(yīng)用于一些其他的典型多酶合成體系中：Mingardon等[50]將來源于解纖維素梭菌中的各種纖維素酶 (CelA/E/F/G/M) 和來源于新美鞭菌的纖維素酶 (CelA/D) 組裝在蛋白支架上，體外高效降解纖維素的活力是未組裝的游離酶系統(tǒng)的2.6倍，實驗數(shù)據(jù)表明蛋白支架能夠有效提高酶的催化效率。Rahman等[51]在正烷烴的生產(chǎn)中引入了DNA支架，在考察了脂酰-ACP還原酶 (AARs) 和醛脫甲?；趸?(ADOs) 兩個酶的配比后，在兩種酶數(shù)量以3∶1比例結(jié)合到DNA支架上時，產(chǎn)生正烷烴44 mg/L，與對照相比，提高了8.8倍。Funabashi等[52]將丙酮酸磷酸雙激酶 (PPDK) 和熒光素酶 (Fluc) 分別連接到鋅指蛋白上，考察了DNA支架上鋅指蛋白結(jié)合序列分別間隔0、10、20和30 bp的堿基數(shù)目對ATP循環(huán)的影響，結(jié)果證實當間隔為10 bp時效果最好。在此情況下，兩個酶在支架上的空間距離較近，由于鄰近效應(yīng)提高了ATP從PPKD到Fluc的擴散效率。Lee等[53]在大腸桿菌中將L-蘇氨酸合成途徑中的關(guān)鍵酶采用DNA支架進行固定，考察了鋅指蛋白結(jié)合區(qū)之間的距離和酶的化學(xué)計量配比對催化效率的影響，在最終優(yōu)化過的支架體系中，酶反應(yīng)的速率顯著提高，L-蘇氨酸的生產(chǎn)時間減少了50%，并且支架的引入減少了有毒中間代謝物的積累，提高了宿主細胞生長的速率。Liu等[54]首次將DNA支架運用到枯草芽孢桿菌生產(chǎn)乙酰氨基葡糖體系中，產(chǎn)物的產(chǎn)量由原先的1.83 g/L提升至4.55 g/L。哈佛大學(xué)的Delebecque等[55]選用PP7、MS2兩種錨定蛋白分別與氫化酶、鐵氧還蛋白融合，以RNA支架為載體催化質(zhì)子還原成氫分子，結(jié)果氫分子的輸出量相比改造前分別提高了11倍和48倍，酶的催化效率顯著提高。

以上研究表明，支架介導(dǎo)的調(diào)控技術(shù)在一些多酶合成體系中的應(yīng)用得到了較好的效果，雖然在番茄紅素等類胡蘿卜素的合成中還鮮有應(yīng)用，但這些研究對類似于番茄紅素多酶合成途徑的調(diào)控具有一定的借鑒意義，為類似的多酶合成體系中多基因表達協(xié)同作用機制奠定了研究基礎(chǔ)?；谥Ъ軜?gòu)建的優(yōu)點，蛋白、DNA等支架的構(gòu)建模式可作為一個平臺技術(shù)應(yīng)用到多酶催化大分子化合物的模塊化合成的精確調(diào)控之中，為解決多酶催化合成復(fù)雜大分子化合物中的共性問題提供參考及示范，為其他生物基化工產(chǎn)品代謝途徑的構(gòu)建及優(yōu)化提供強而有力的基礎(chǔ)。

4 總結(jié)

目前在針對番茄紅素等多酶催化復(fù)雜生物大分子合成途徑的常規(guī)改造方法中，一方面是通過替換合成途徑中關(guān)鍵酶調(diào)控元件，增強酶的活力及產(chǎn)物合成途徑；另一方面是通過基因敲除技術(shù)，降低支路合成效率，削弱代謝支流，確保番茄紅素合成途徑中有足夠的前體和能量供應(yīng)。但這些傳統(tǒng)的基因工程及代謝調(diào)控技術(shù)往往需要引入多基因表達甚至整套的代謝途徑，從而忽略了“底物通道”在多酶合成體系中不可或缺的作用，導(dǎo)致細胞中游離酶之間距離較遠，制約了酶的催化效率。在研究多酶調(diào)控的新策略后，多酶自組裝、人工支架的構(gòu)建等新興方法為提高這類生物大分子的產(chǎn)量以及多酶合成的效率提供了新的研究技術(shù)手段，極大地提升了整個多酶合成體系的能動性和精確性。將多酶自組裝、人工支架等方法引入到以番茄紅素為代表的烯萜類大分子的合成之中，可建立起多酶合成調(diào)控的新方法，以實現(xiàn)催化體系中目的蛋白順次線性化的自組裝，提高多酶的催化效率。同時為闡明番茄紅素多酶合成體系中多基因表達協(xié)同作用機制奠定理論研究基礎(chǔ)，也對其他多酶催化復(fù)雜大分子化合物的高效快速合成具有一定的指導(dǎo)借鑒作用。

REFERENCES

[1] Shi J, Mazza G, Le Maguer M. Lycopene from tomatoes//Functional Foods: Biochemical and Processing Aspects, Volume 2. Boca Raton: CRC Press, 2002: 135–167.

[2] Nguyen ML, Schwartz SJ. Lycopene: chemical and biological properties. Food Technol, 1999, 53(2): 38–45.

[3] Kong KW, Khoo HE, Prasad KN, et al. Revealing the power of the natural red pigment lycopene. Molecules, 2010, 15(2): 959–987.

[4] Aggarwal BB, Shishodia S. Molecular targets of dietary agents for prevention and therapy of cancer. Biochem Pharmacol, 2006, 71(10): 1397–1421.

[5] Moise AR, Al-Babili S, Wurtzel ET. Mechanistic aspects of carotenoid biosynthesis. Chem Rev, 2014, 114(1): 164–193.

[6] Liu XJ, Liu RS, Li HM, et al. Lycopene production from synthetic medium byNRRL 2895 (+) and 2896 (-) in a stirred-tank fermenter. Bioprocess Biosyst Eng, 2012, 35(5): 739–749.

[7] Liao YQ, Xie YQ, Huang B. Production methods of lycopene. Subtrop Agric Res, 2007, 3(1): 64–68 (in Chinese). 廖益強, 謝擁群, 黃彪. 番茄紅素的生產(chǎn)方法. 亞熱帶農(nóng)業(yè)研究, 2007, 3(1): 64–68.

[8] Alper H, Miyaoku K, Stephanopoulos G. Construction of lycopene-overproducing.strains by combining systematic and combinatorial gene knockout targets. Nat Biotechnol, 2005, 23(5): 612–616.

[9] Hohmann HP, Pasamontes L, Tessier M, et al. Fermentative carotenoid production: US, 6124113. 2000-09-26.

[10] Zhou Y, Nambou K, Wei LJ, et al. Lycopene production in recombinant strains ofis improved by knockout of the central carbon metabolism gene coding for glucose-6-phosphate dehydrogenase. Biotechnol Lett, 2013, 35(12): 2137–2145.

[11] Weng ZM, Wang Y, Liu JZ. Overproduction of lycopene by metabolic engineering. Bioprocess, 2012, 2(2): 51–57 (in Chinese). 翁志明, 王玥, 劉建忠. 代謝工程大腸桿菌過量生產(chǎn)番茄紅素. 生物過程, 2012, 2(2): 51–57.

[12] Yoon SH, Lee YM, Kim JE, et al. Enhanced lycopene production inengineered to synthesize isopentenyl diphosphate and dimethylallyl diphosphate from mevalonate. Biotechnol Bioeng, 2006, 94(6): 1025–1032.

[13] Wu JL, Wu QP, Zhang JM, et al. Advances on microbial biosynthesis and fermentation production of lycopene. Food Sci, 2013, 34(19): 336–340 (in Chinese). 吳軍林, 吳清平, 張菊梅, 等. 番茄紅素的微生物合成及發(fā)酵生產(chǎn)研究進展. 食品科學(xué), 2013, 34(19): 336–340.

[14] Zhao J, Li QY, Sun T, et al. Engineering central metabolic modules offor improving beta-carotene production. Metab Eng, 2013, 17: 42–50.

[15] Jiang TY, Li LX, Ma CQ, et al. Strategies for regulating multiple genes in microbial cell factories. Chin J Biotech, 2010, 26(10): 1419–1425 (in Chinese).姜天翼, 李理想, 馬翠卿, 等. 微生物細胞工廠中多基因表達的控制策略. 生物工程學(xué)報, 2010, 26(10): 1419–1425.

[16] Gustavsson M, Lehti? J, Denman S, et al. Stable linker peptides for a cellulose-binding domain-lipase fusion protein expressed in. Protein Eng, 2001, 14(9): 711–715.

[17] Gibson DG, Young L, Chuang RY, et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods, 2009, 6(5): 343–345.

[18] Zhang SS, Zhao XJ, Tao Y, et al. A novel approach for metabolic pathway optimization: oligo-linker mediated assembly (OLMA) method. J Biol Eng, 2015, 9: 23.

[19] Zhang YHP. Substrate channeling and enzyme complexes for biotechnological applications. Biotechnol Adv, 2011, 29(6): 715–725.

[20] Yoon SH, Kim JE, Lee SH, et al. Engineering the lycopene synthetic pathway in.by comparison of the carotenoid genes ofand. Appl Microbiol Biotechnol, 2007, 74(1): 131–139.

[21] Jin WY, Xu X, Jiang L, et al. Putative carotenoid genes expressed under the regulation of Shine-Dalgarno regions infor efficient lycopene production. Biotechnol Lett, 2015, 37(11): 2303–2310.

[22] Zhu FY, Lu L, Fu S, et al. Targeted engineering and scale up of lycopene overproduction in. Proc Biochem, 2015, 50(3): 341–346.

[23] Miura Y, Kondo K, Shimada H, et al. Production of lycopene by the food yeast,that does not naturally synthesize carotenoid. Biotechnol Bioeng, 1998, 58(2/3): 306–308.

[24] Matth?us F, Ketelhot M, Gatter M, et al. Production of lycopene in the non-carotenoid-producing yeast. Appl Environ Microbiol, 2014, 80(5): 1660–1669.

[25] Araya-Garay JM, Feijoo-Siota L, Rosa-dos-Santos F, et al. Construction of newX-33 strains for production of lycopene and β-carotene. Appl Microbiol Biotechnol, 2012, 93(6): 2483–2492.

[26] Bhataya A, Schmidt-Dannert C, Lee PC. Metabolic engineering ofX-33 for lycopene production. Proc Biochem, 2009, 44(10): 1095–1102.

[27] Sun J, Sun XX, Tang PW, et al. Molecular cloning and functional expression of two key carotene synthetic genes derived fromintofor increased β-carotene production. Biotechnol Lett, 2012, 34(11): 2077–2082.

[28] Kim YS, Lee JH, Kim NH, et al. Increase of lycopene production by supplementing auxiliary carbon sources in metabolically engineered. Appl Microbiol Biotechnol, 2011, 90(2): 489–497.

[29] Zhang TC, Nakajima M. Increase of the lycopene production in the recombinant strains ofby supplementing with fructose//Advances in Applied Biotechnology. Berlin Heidelberg: Springer, 2015: 29–35.

[30] Chen YY, Shen HJ, Cui YY, et al. Chromosomal evolution offor the efficient production of lycopene. BMC Biotechnol, 2013, 13: 6.

[31] Xu X, Jin WY, Jiang L, et al. A high-throughput screening method for identifying lycopene-overproducing.strain based on an antioxidant capacity assay. Biochem Eng J, 2016, 112: 277–284.

[32] Sun T, Miao LT, Li QY, et al. Production of lycopene by metabolically-engineered. Biotechnol Lett, 2014, 36(7): 1515–1522.

[33] Bahieldin A, Gadalla NO, Al-Garni SM, et al. Efficient production of lycopene inby expression of syntheticgenes from a plasmid harboring thepromoter. Plasmid, 2014, 72: 18–28.

[34] Xie WP, Ye LD, Lv XM, et al. Sequential control of biosynthetic pathways for balanced utilization of metabolic intermediates in. Metab Eng, 2015, 28: 8–18.

[35] Ye Q, Cao H, Yan M, et al. Construction and co-expression of a polycistronic plasmid encoding carbonyl reductase and glucose dehydrogenase for production of ethyl ()-4-chloro-3-hydroxybutanoate. Bioresour Technol, 2010, 101(17): 6761–6767.

[36] Suh W, Cheng Q. High isoprenoid fluxas a host for carotenoids production. Microbial Metabolic Engineering: Methods and Protocols. New York: Springer, 2012: 49–62.

[37] Kang MJ, Yoon SH, Lee YM, et al. Enhancement of lycopene production inby optimization of the lycopene synthetic pathway. J Microbiol Biotechnol, 2005, 15(4): 880–886.

[38] Wang HH, Isaacs FJ, Carr PA, et al. Programming cells by multiplex genome engineering and accelerated evolution. Nature, 2009, 460(7257): 894–898.

[39] Dai GP, Sun T, Miao LT, et al. Modulating expression of key genes within β-carotene synthetic pathway in recombinantwith RBS library to improve β-carotene production. Chin J Biotech, 2014, 30(8): 1193?1203 (in Chinese). 戴冠蘋, 孫濤, 苗良田, 等. RBS文庫調(diào)控重組大腸桿菌β-胡蘿卜素合成途徑關(guān)鍵基因提高β-胡蘿卜素合成能力. 生物工程學(xué)報, 2014, 30(8): 1193?1203.

[40] Zhu FY, Zhong XF, Hu MZ, et al.reconstitution of mevalonate pathway and targeted engineering of farnesene overproduction in. Biotechnol Bioeng, 2014, 111(7): 1396–1405.

[41] Lu J, Tang JL, Liu Y, et al. Combinatorial modulation ofandgene expression for improved alternative glucose utilization. Appl Microbiol Biotechnol, 2012, 93(6): 2455–2462.

[42] Li YF, Lin ZQ, Huang C, et al. Metabolic engineering ofusing CRISPR-Cas9 meditated genome editing. Metab Eng, 2015, 31: 13–21.

[43] EauClaire SF, Zhang JZ, Rivera CG, et al. Combinatorial metabolic pathway assembly in the yeast genome with RNA-guided Cas9. J Indust Microbiol Biotechnol, 2016, 43(7): 1001–1015.

[44] Ronda C, Maury J, Jako?iūnas T, et al. CrEdit: CRISPR mediated multi-loci gene integration in. Microb Cell Fact, 2015, 14: 97.

[45] Jako?iūnas T, Bonde I, Herrg?rd M, et al. Multiplex metabolic pathway engineering using CRISPR/Cas9 in. Metab Eng, 2015, 28: 213–222.

[46] Arai R, Ueda H, Kitayama A, et al. Design of the linkers which effectively separate domains of a bifunctional fusion protein. Protein Eng, 2001, 14(8): 529–532.

[47] Heider SA, Wolf N, Hofemeier A, et al. Optimization of the IPP precursor supply for the production of lycopene, decaprenoxanthin and astaxanthin by. Front Bioeng Biotechnol, 2014, 2: 28.

[48] Dueber JE, Wu GC, Malmirchegini GR, et al. Synthetic protein scaffolds provide modular control over metabolic flux. Nat Biotechnol, 2009, 27(8): 753–759.

[49] Conrado RJ, Wu GC, Boock JT, et al. DNA-guided assembly of biosynthetic pathways promotes improved catalytic efficiency. Nucleic Acids Res, 2012, 40(4): 1879–1889.

[50] Mingardon F, Chanal A, López-Contreras AM, et al. Incorporation of fungal cellulases in bacterial minicellulosomes yields viable, synergistically acting cellulolytic complexes. Appl Environ Microbiol, 2007, 73(12): 3822–3832.

[51] Rahman Z, Sung BH, Yi JY, et al. Enhanced production of-alkanes inby spatial organization of biosynthetic pathway enzymes. J Biotechnol, 2014, 192(Part A): 187–191.

[52] Funabashi H, Yanagi S, Suzuki S, et al. Assembly of zinc finger motif-fused enzymes on a dsDNA scaffold for catalyzing consecutive reactions with a proximity effect. Biotechnol Lett, 2015, 37(1): 109–114.

[53] Lee JH, Jung SC, Bui LM, et al. Improved production of L-threonine inby use of a DNA scaffold system. Appl Environ Microbiol, 2013, 79(3): 774–782.

[54] Liu YF, Zhu YQ, Ma WL, et al. Spatial modulation of key pathway enzymes by DNA-guided scaffold system and respiration chain engineering for improved-acetylglucosamine production by. Metab Eng, 2014, 24: 61–69.

[55] Delebecque CJ, Lindner AB, Silver PA, et al. Organization of intracellular reactions with rationally designed RNA assemblies. Science, 2011, 333(6041): 470–474.

(本文責(zé)編 郝麗芳)

Research progress in multi-enzyme regulation of genetically engineered bacteria producing lycopene

Jiali Xu1, Siyi Zuo1, Chengjia Xie2, Ling Jiang3, Shuang Li1, He Huang4, and Xian Xu4

1,,,211816,,2,,225127,,3,,,211816,,College of PharmacyNanjing Tech UniversityNanjingJiangsuChina

Lycopene plays a crucial role in the biosynthesis pathway of 2-methyl-derythritol-4-phosphate (MEP) and mevalonic acid (MVA). It is a representative product of isoprenoid family, and a typical product of multi-enzyme catalytic reaction in organism. In this paper, we first introduced the general regulation methods in multi-enzyme synthesis reaction, including the construction of multi gene co-expression plasmid, gene order regulation, promoter and ribosome binding site regulation, gene knockout and replacement, aiming at the optimization strategies of multi-enzyme catalytic reaction in lycopene synthesis pathway. Meanwhile, we introduced several new regulation methods in multi-enzyme reaction, including multi-fragment assembly technology, artificial scaffold self-assembly methods and so on. At last, we summarized the application of these multi-enzyme regulation methods in lycopene synthesis. These methods provide a great inspiration and research foundation for the construction of lycopene-producing strains with high yield.

lycopene, multi-enzyme regulation, scaffold, genetic engineering, multi-fragment assembly

Supported by:National Natural Science Foundation of China (No. 21406111), Natural Science Foundation of Jiangsu Province, China (No. BK20130917), College Students' Innovation and Experimental Open Fund (No. 2016DC365).

國家自然科學(xué)基金(No. 21406111)，江蘇省自然科學(xué)基金(No. BK20130917)，大學(xué)生創(chuàng)新與實驗開放基金(No. 2016DC365)資助。

August 30, 2016; Accepted:November 15, 2016

Xian Xu. Tel: +86-25-58139942; E-mail: xuxian@njtech.edu.cn