劉立峰，潘玉濤，陳滌，李俠，劉養(yǎng)洲，普星宇，李增春

（同濟大學附屬東方醫(yī)院創(chuàng)傷骨科，上海 200120）

褪黑素通過下調(diào)細胞周期蛋白及其激酶的表達抑制人骨肉瘤MG?63細胞增殖

劉立峰，潘玉濤，陳滌，李俠，劉養(yǎng)洲，普星宇，李增春

（同濟大學附屬東方醫(yī)院創(chuàng)傷骨科，上海 200120）

目的 探討高濃度褪黑素抑制人骨肉瘤細胞系MG?63細胞增殖的潛在機制。方法 在體外培養(yǎng)的MG?63細胞中，外源性加入4 mmol/L濃度褪黑素，分別用Western blotting和實時PCR方法檢測高濃度褪黑素對細胞周期蛋白（cyclins）及其依賴性激酶（CDK）蛋白和mRNA水平表達的影響。結果 Western blotting和實時PCR檢測結果顯示，4 mmol/L濃度的褪黑素以時間依賴性方式顯著地下調(diào)了與細胞周期G1期進展有關的cyclin D1和CDK4蛋白和mRNA表達水平，與細胞周期G2/M期進展有關的cyclin B1和CDK1蛋白和mRNA表達水平，但與G1/S期轉(zhuǎn)變和S期進展有關的cyclin E、CDK2和cyclin A蛋白和mRNA表達水平?jīng)]有變化。結論 褪黑素以時間依賴性方式，通過誘導細胞周期停滯抑制骨肉瘤MG?63細胞增殖，這種抑制效應與cyclin D1和CDK4及cyclin B1和CDK1的表達下調(diào)有關。

褪黑素；骨肉瘤；細胞周期蛋白；細胞周期蛋白依賴性激酶

骨肉瘤是一種最常見的原發(fā)惡性骨腫瘤，好發(fā)于青少年的長骨干骺端，尤以股骨下段和脛骨上段多見，由間葉組織產(chǎn)生的骨樣組織和未分化的骨組織組成；骨肉瘤是12～18歲青少年中除白血病和淋巴瘤外，第3種最常見的腫瘤疾病［1］。據(jù)報道［1］，新輔助化療的引入使骨肉瘤的生存率得到了顯著提高，但不良反應的增加也越來越受到人們關注。因此，如果一種藥物既能具有抗腫瘤特性，又能減少化療藥物的副反應，將具有極好的應用前景。

褪黑素是一種主要由松果體合成分泌的激素，視網(wǎng)膜、胃腸道和骨髓也能合成［2］，對骨生長有影響的骨髓細胞也可以從頭合成褪黑素［3］。褪黑素已經(jīng)在許多腫瘤細胞中被發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤效應［4］，包括乳腺癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌、葡萄膜黑色素瘤、前列腺癌、腸癌和肝癌等。1個隨機對照的meta分析［5］指出，褪黑素作為一種輔助治療，可以明顯延緩腫瘤的進展、提高1年生存率和減緩放化療所引起的副反應。骨的代謝與體內(nèi)褪黑素水平密切相關［6］，研究［7］發(fā)現(xiàn)，高濃度褪黑素可顯著地抑制人骨肉瘤MG?63細胞的增殖，但其機制不明。

本研究的目的是檢測高濃度褪黑素抑制人骨肉瘤MG?63細胞增殖的潛在機制，為更好地應用褪黑素輔助治療骨肉瘤等疾病提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人類的骨肉瘤MG?63細胞系被培育在添加10%胎牛血清（HyClone公司）的DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司）中，在5%CO2和37℃的條件下培養(yǎng)，每隔1 d更換1次培養(yǎng)基。MG?63細胞以1×104/cm2的密度接種到培養(yǎng)皿中，24 h后用于后續(xù)實驗。褪黑素的母液用含有100%的DMSO（Sigma公司）制備，隨后根據(jù)待檢測的濃度用培養(yǎng)基做1個梯度稀釋；在最后檢測時，保證對照組和實驗組的培養(yǎng)基中含有相同濃度的0.2%DMSO和10%胎牛血清。褪黑素購自Sig?ma公司，β?actin和單克隆的細胞周期蛋白（cyclin A）、cyclin B1、cyclin D1、cyclin E、細胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin?dependent kinase，CDK）1、CDK2和CDK4抗體購自Cell Signaling Technology公司，實時PCR檢測試劑盒購自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 Western blotting：將MG?63細胞接種到10 cm培養(yǎng)皿上，24 h后培養(yǎng)基被換成含有4 mmol/L濃度褪黑素的培養(yǎng)基（對照組換成含有0.2%DMSO的培養(yǎng)基），再分別培養(yǎng)4 h、24 h和48 h。然后在4℃條件下用裂解液（含有150 mmol/L NaCl，1%NP?40，0.1%SDS，2 μg/mL抑肽酶，1 mmol/L PMSF）裂解細胞30 min，在4°C條件下，以12 000g離心上清液15 min。取50 μg總蛋白，利用12%SDS?PAGE電泳分離蛋白，在低溫、2 h、60 V或40 V的條件下將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上，在含有5%脫脂牛奶的封閉液中浸泡膜2 h。加入單克隆抗體（以1∶200或1∶500比例稀釋），4℃條件下過夜，檢測相關蛋白的表達情況，然后加入過氧化物酶抗小鼠或抗兔的IgG（以1∶6 000或1∶8 000比例稀釋），在室溫的條件下反應2 h。利用EC3成像系統(tǒng)（UVP公司）檢測特異性條帶表達，用Gel?Pro Analyzer 4.0軟件（Media Cybernetics公司）測量每個條帶的OD值，計算出每個樣本的目的蛋白和內(nèi)參蛋白的比率。

1.2.2 實時PCR：將MG?63細胞接種到6 cm培養(yǎng)皿上，24 h后培養(yǎng)基被換成含有4 mmol/L濃度褪黑素的培養(yǎng)基（對照組換成含有0.2%DMSO的培養(yǎng)基），再分別培養(yǎng)4 h、24 h和48 h。用TRIzol試劑（Invitro?gen公司）將RNA從細胞中分離，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司）逆轉(zhuǎn)錄總RNA。用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒（TaKaRa公司）在ABI Prism 7900 HT儀器上進行實時定量PCR檢測；在20 μL總反應體系中，95℃、30 s預變性，在95℃、5 s和60℃、30 s條件下退火和延伸，循環(huán)40次。引物的序列如表1所示，β?actin作為內(nèi)參。通過分析溶解曲線保證結果的可靠性。根據(jù)2-△△CT方法，利用SDS 2.4軟件（ABI公司）分析計算實時定量PCR的結果。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學分析。采用雙因素方差分析評價褪黑素的劑量、暴露時間和二者之間的相互作用造成的不同是否有意義，采用Bon?ferroni檢驗進行兩兩比較。采用單因素方差分析評價各個處理組之間差異。所有的數(shù)據(jù)用至少3次獨立實驗的表示。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 高濃度褪黑素對cyclins及CDK蛋白表達水平的影響

在前期研究中，發(fā)現(xiàn)4～10 mmol/L褪黑素可以通過誘導人骨肉瘤MG?63細胞周期停滯而顯著抑制細胞增殖。流式細胞儀分析顯示，在細胞暴露于各種濃度的褪黑素24 h以后，與對照組細胞相比，4～10 mmol/L濃度的褪黑素顯著地增加了細胞周期中G0/G1期細胞的比例，且同時減少了S期和G2/M期細胞的比例（P均＜0.01）。為了檢測4～10 mmol/L濃度褪黑素誘導MG?63細胞周期停滯的機制，用West?ern blotting方法檢測了cyclins及其激酶蛋白表達情況。鑒于4 mmol/L、6 mmol/L、8 mmol/L和10 mmol/L濃度褪黑素在誘導MG?63細胞周期分布上無統(tǒng)計學差異（Bonferroni檢驗均P＞0.05），故本研究中僅檢測4 mmol/L濃度褪黑素對cyclins及其激酶表達的影響。

Western blotting檢測顯示，4 mmol/L濃度褪黑素以時間依賴性方式顯著地下調(diào)了與G1期進展有關的cyclin D1和CDK4的蛋白表達水平，與細胞周期G2/M期進展有關的cyclin B1和CDK1的蛋白表達水平，但與G1/S期轉(zhuǎn)變和S期進展有關的cyclin E、CDK2和cyclin A的蛋白表達水平?jīng)]有變化。見圖1。

表1 實時PCR引物序列Tab.1 Primer sequences used in real?time PCR

圖1 4 mmol/L濃度褪黑素對骨肉瘤MG?63細胞的cyclins及CDK蛋白表達水平的影響Fig.1 Effect of 4 mmol/L melatonin on the expressions of cyclins and cyclin?dependent kinases at protein levels in MG?63 cells

2.2 高濃度褪黑素對cyclins及其激酶mRNA表達水平的影響

為了進一步檢測4～10 mmol/L濃度褪黑素誘導MG?63細胞周期停滯的機制，用實時PCR方法檢測了cyclins及其激酶的mRNA水平表達情況。實時PCR分析顯示，4 mmol/L濃度的褪黑素以一種時間依賴性方式顯著地下調(diào)了與細胞周期G1期進展有關的cyclin D1和CDK4的mRNA表達水平，與細胞周期G2/M期進展有關的cyclin B1和CDK1的mRNA表達水平，與G1/S期轉(zhuǎn)變和S期進展有關的cyclin E、CDK2和cyclin A的mRNA表達水平?jīng)]有變化。見圖2。

3 討論

圖2 4 mmol/L濃度褪黑素對骨肉瘤MG?63細胞的cyclins及CDK mRNA水平表達的影響Fig.2 Effect of 4 mmol/L melatonin on the expressions of cyclins and cyclin?dependent kinases at mRNA levels in MG?63 cells

褪黑素可以在許多生物調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮作用，如生物周期節(jié)律、睡眠、衰老、生殖、骨生理和腫瘤的生長等；其抗腫瘤機制復雜而廣泛，主要包括：調(diào)節(jié)雌激素信號轉(zhuǎn)導通路，調(diào)節(jié)生長因子的分泌和釋放，干擾鈣調(diào)蛋白和微管蛋白的功能，增加細胞間縫隙連接，促進細胞凋亡，影響細胞周期，影響細胞代謝和免疫調(diào)節(jié)作用等［8］。越來越多的證據(jù)顯示，褪黑素水平的下降與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和惡化密切相關。

褪黑素還可以緩解化療藥物導致的無力、口腔炎、神經(jīng)毒性和心臟毒性等不良反應。骨肉瘤的發(fā)生與褪黑素水平的減少之間的相關性研究［1?2，6，9］表明，體內(nèi)褪黑素水平的下降可能是引起骨肉瘤發(fā)生和發(fā)展的原因之一。研究［7］發(fā)現(xiàn)，雖然1 nmol/L～2 mmol/L濃度的褪黑素不能有效地抑制骨肉瘤MG?63細胞的增殖，但是4～10 mmol/L濃度的褪黑素可以通過誘導細胞周期停滯顯著地抑制MG?63細胞增殖，為應用褪黑素輔助治療骨肉瘤開辟了新的道路。本研究進一步闡明了高濃度（4 mmol/L）褪黑素抑制MG?63細胞增殖與細胞周期蛋白及其激酶的表達下調(diào)有關。

通過誘導細胞周期停滯抑制腫瘤細胞增殖一直是近年腫瘤學研究的熱點。許多研究［10?13］也指出，一些因子抑制骨肉瘤等細胞生長的效應主要是通過下調(diào)cyclin D1等的表達誘導細胞周期停滯實現(xiàn)的。本研究也證實高濃度褪黑素能以時間依賴性方式顯著地下調(diào)與細胞周期G1期進展有關的cy?clin D1蛋白和mRNA表達水平［7］。近年來，關于信號傳導通路在骨肉瘤病因?qū)W中的作用不斷得到闡明［14］，比較熱門的有Notch信號通路（骨肉瘤侵襲的啟動因素）、Wnt/β?catenin（影響成骨細胞分化，與原發(fā)性及繼發(fā)性骨腫瘤均有密切聯(lián)系）、MAPK信號通路（與骨肉瘤的增殖和侵襲密切相關）、Fas途徑（在骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移中起重要作用）。因此，深入研究這些途徑對骨肉瘤的診斷、治療和預后評估方面具有重要的潛在價值。骨肉瘤轉(zhuǎn)移過程中某些分子生物學的改變可能和化療抵抗有關，針對這些分子生物學改變進行治療有可能提高治療骨肉瘤的療效。褪黑素通過下調(diào)cyclin D1等的表達誘導細胞周期停滯是否與上述途徑有關，還是有其他途徑參與了這個過程，目前還不清楚，同樣值得進一步研究證實。

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Melatonin Inhibits the Proliferation of Human MG?63 Osteosarcoma Cells via Downregulation of Cyclins and CDKs

LIU Lifeng，PAN Yutao，CHEN Di，LI Xia，LIU Yangzhou，PU Xingyu，LI Zengchun
（Department of Trauma Orthopaedics，Shanghai East Hospital，Tongji University School of Medicine，Shanghai 200120，China）

Objective To investigate the potential mechanism that melatonin at higher concentrations inhibits the proliferation of human MG?63 osteosarcoma cells，so as to provide a certain experimental basis for the better application of melatonin in the treatment of diseases in Department of Orthopedics.Methods MG?63 cells cultured in vitro were treated with melatonin at a concentration of 4 mmol/L.Western blotting and real?time PCR method were used to analyze the effect of melatonin on the expression of cyclins and CDKs at protein and mRNA levels，respectively.Results Western blotting and real?time PCR analyses showed that melatonin’s inhibitory effect was possibly through the downregulation of cyclin D1 and CDK4 that related to the G1phase，and downregulation of cyclin B1 and CDK1 that related to the G2/M phase.However，there was no obvious dif?ference of cyclin E，CDK2，and cyclin A，which were related to G1/S transition and S phase.Conclusion Melatonin may significantly inhibit hu?man osteosarcoma cell proliferation by inducing cell cycle arrest in a time?dependent manner，which is related to the downregulation of cyclin D1，CDK4，cyclin B1 and CDK1.

melatonin；osteosarcoma；cyclins；cyclin?dependent kinase

R816.8

A

0258-4646（2017）02-0131-05

10.12007/j.issn.0258?4646.2017.02.008

上海市浦東新區(qū)衛(wèi)生系統(tǒng)優(yōu)秀青年醫(yī)學人才培養(yǎng)（PWRq2013?15）；上海市衛(wèi)生局面上項目（20134212）；同濟大學青年優(yōu)秀人才培養(yǎng)行動計劃（1507219028）

劉立峰（1978-），男，講師，博士.

李增春，E-mail：drlizc@163.com

2016-07-25

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