張展，徐娜，李?lèi)?ài)萍，劉慧，王媛媛

(鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院,鄭州 450052)

MiR-34a對(duì)JAR細(xì)胞自噬影響的機(jī)制

張展，徐娜，李?lèi)?ài)萍，劉慧，王媛媛

(鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院,鄭州 450052)

目的 探討miR-34a對(duì)人胎盤(pán)絨毛癌細(xì)胞JAR細(xì)胞自噬影響的機(jī)制。方法 選取JAR細(xì)胞，隨機(jī)分為miR-34a 模擬物組(轉(zhuǎn)染miR-34a 模擬物)、NC組(轉(zhuǎn)染模擬物陰性對(duì)照)、miR-34a抑制物組(轉(zhuǎn)染miR-34a抑制物)、INC組(轉(zhuǎn)染抑制物陰性對(duì)照)、空白對(duì)照組(只加Lipofectamine 2000)、缺氧組(300 μmol/L氯化鈷處理)和正常組(未經(jīng)氯化鈷處理)。采用Real time PCR法檢測(cè)各組miR-34a及HMGB1 mRNA表達(dá)，Western blotting法檢測(cè)各組HMGB1和LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá),透射電鏡檢測(cè)各組細(xì)胞中自噬小體形成情況。結(jié)果 miR-34a模擬物組中HMGB1 mRNA和蛋白表達(dá)水平較NC組降低(P<0.05)，miR-34a抑制物組中HMGB1 mRNA和蛋白表達(dá)較INC組高(P<0.05)。缺氧組中HMGB1和LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)較正常組升高。缺氧處理后miR-34a模擬物組中 HMGB1和LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白的相對(duì)表達(dá)量較INC組降低(P<0.05)，miR-34a抑制物組中HMGB1和LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白的相對(duì)表達(dá)量較INC組升高(P<0.05)。透射電鏡結(jié)果顯示，缺氧組自噬小體的數(shù)量較正常組明顯增加(P<0.05)，缺氧處理后miR-34a模擬物組細(xì)胞中自噬小泡數(shù)量較NC組減少(P<0.05)，miR-34a抑制物組細(xì)胞中自噬小泡數(shù)量較INC組增加(P<0.05)。結(jié)論 miR-34a可能通過(guò)抑制HMGB1表達(dá)影響滋養(yǎng)細(xì)胞的自噬。

子癇前期；JAR細(xì)胞；自噬；微小RNA-34a

子癇前期(PE)是常見(jiàn)的妊娠期并發(fā)癥之一，嚴(yán)重危害母親和胎兒健康[1]。目前，關(guān)于PE的病因及發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。研究指出，絨毛膜外滋養(yǎng)細(xì)胞(EVTs)侵襲障礙導(dǎo)致PE的病理生理學(xué)改變[2]，而EVTs的侵襲能力又受到細(xì)胞自噬的影響。自噬是細(xì)胞回收胞質(zhì)成分的一種降解系統(tǒng)[3]，是維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的一種機(jī)制，在營(yíng)養(yǎng)缺乏、缺氧、應(yīng)激等條件下，通過(guò)胞質(zhì)內(nèi)成分的再利用給細(xì)胞補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)，并選擇性地降解受損的細(xì)胞器。目前人類(lèi)胎盤(pán)疾病中自噬的研究不多。Soo-Young等[4]研究發(fā)現(xiàn)，PE患者的胎盤(pán)組織中，自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ的表達(dá)水平升高，滋養(yǎng)細(xì)胞的過(guò)度自噬導(dǎo)致細(xì)胞功能受損致自噬性細(xì)胞死亡，影響滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲能力[5]。microRNA(miRNAs)是一類(lèi)長(zhǎng)度約22個(gè)核苷酸大小的內(nèi)源性非編碼小RNA，不完全互補(bǔ)地結(jié)合到靶mRNA的3'端非編碼區(qū)，通過(guò)抑制翻譯或裂解靶mRNA從而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后的基因表達(dá)。miRNAs的異常表達(dá)與人類(lèi)多種疾病相關(guān)，如癌癥、炎癥和心血管疾病[6]。研究發(fā)現(xiàn)，諸多miRNAs在胎盤(pán)發(fā)育中發(fā)揮重要作用，其中包括miR-34a。miR-34a屬于miRNA-34,位于染色體1p36。研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a在胎盤(pán)組織中表達(dá)下調(diào)，可抑制高遷移率族蛋白(HMGB1)mRNA表達(dá)及滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲[7]。然而，miR-34a不僅與細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)，還可調(diào)節(jié)細(xì)胞的自噬，但在PE中miR-34a與滋養(yǎng)細(xì)胞自噬的關(guān)系尚不清楚。HMGB1是一種非組蛋白染色體結(jié)合蛋白，具有致炎和核內(nèi)轉(zhuǎn)錄功能，亦是誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬的重要因子[8]。HMGB1在PE中表達(dá)升高，但與miR-34a和滋養(yǎng)細(xì)胞自噬的關(guān)系目前尚不清楚。2016年3月，我們觀察了miR-34a對(duì)HMGB1表達(dá)的影響及在滋養(yǎng)細(xì)胞自噬中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 選取鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院的人絨毛膜癌細(xì)胞系JAR細(xì)胞作為研究對(duì)象，其生物學(xué)行為與滋養(yǎng)細(xì)胞相似。主要試劑：RPMI1640 培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司，胎牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品，miR-34a 模擬物、miR-34a 抑制物及他們的陰性對(duì)照購(gòu)自上海吉瑪公司，Opti-MEM購(gòu)自GIBCO公司，Lipofectamine 2000購(gòu)自Invitrogen公司，TRolzon購(gòu)自北京康為生物科技有限公司，RIPA細(xì)胞裂解液購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，qPCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR Master Mix購(gòu)自日本東洋紡公司，PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。HMGB1兔抗人一抗購(gòu)自Abcam公司，微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)兔抗人一抗購(gòu)自CST公司，內(nèi)參β-actin 鼠抗人一抗購(gòu)自Abcam公司。

1.2 miR-34a干預(yù)后JAR細(xì)胞HMGB1 mRNA及蛋白表達(dá)檢測(cè) 將細(xì)胞分為5組：miR-34a模擬物組(轉(zhuǎn)染miR-34a模擬物)、NC組(轉(zhuǎn)染模擬物陰性對(duì)照)、miR-34a抑制物組(轉(zhuǎn)染miR-34a抑制物)、INC組(轉(zhuǎn)染抑制物陰性對(duì)照)和空白對(duì)照組(只加Lipofectamine 2000)。轉(zhuǎn)染24 h后按照TRIzol的說(shuō)明書(shū)提取各組總RNA，提取過(guò)程在冰上操作以防RNA降解。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄并按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR說(shuō)明書(shū)進(jìn)行擴(kuò)增，Real time PCR所用引物：miR-34a 上游引物：5′-ATTGCGGTGGCAGTGTCTTAGCT-3′，下游引物：5′-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′，HMGB1上游引物5′-GAACATCCTGGCCTGTCCAT-3′，下游引物：5′-GCAAACCCACACTTCTTACCT-3′，miRNA和mRNA的內(nèi)參分別采用U6和β-actin,miRNA和mRNA表達(dá)量的改變倍數(shù)采用2-ΔΔCt計(jì)算。轉(zhuǎn)染48 h后使用索萊寶的RIPA細(xì)胞裂解液提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。采用5%的濃縮膠和15%的分離膠進(jìn)行電泳。蛋白上樣量為每孔20 μg。采用濕轉(zhuǎn)法將膠上的蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，HMGB1及β-actin轉(zhuǎn)膜1 h,5%脫脂奶粉室溫?fù)u床封閉1 h,封閉結(jié)束后將膜置于雜交袋內(nèi)，分別與各自的一抗，4 ℃孵育過(guò)夜。洗膜后，用熒光標(biāo)記的二抗，雜交袋內(nèi)室溫孵育2 h,洗膜，用ODYSSEY Clx檢測(cè)與成像系統(tǒng)進(jìn)行分析。計(jì)算目的條帶與內(nèi)參條帶的灰度值之比，即為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 缺氧干預(yù)后細(xì)胞中HMGB1、LC3蛋白表達(dá)及自噬小體數(shù)量檢測(cè) 將細(xì)胞分為兩組：缺氧組(300 μmol/L氯化鈷處理)和正常組(未經(jīng)氯化鈷處理)。采用Western blotting方法檢測(cè)各組細(xì)胞中HMGB1和LC3Ⅱ/Ⅰ的相對(duì)表達(dá)量；轉(zhuǎn)染后各組的細(xì)胞，去除培養(yǎng)基，PBS沖洗2～3次，刮下細(xì)胞，置于預(yù)冷的5%戊二醛固定液中4 ℃固定過(guò)夜。后經(jīng)1%鋨酸固定2 h、丙酮梯度脫水、環(huán)氧樹(shù)脂812浸透包埋，并制成70 nm超薄切片，經(jīng)枸櫞酸鉛和乙酸鈾電子染色，透射電鏡觀察并計(jì)數(shù)細(xì)胞自噬小體數(shù)量。

1.4 miR-34a干預(yù)JAR細(xì)胞后自噬小體數(shù)量檢測(cè) 將細(xì)胞分為miR-34a模擬物組、NC組、miR-34a抑制物組、INC組，轉(zhuǎn)染48 h后300 μmol/L氯化鈷處理2 h,誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生自噬。提取各組細(xì)胞總蛋白，采用Western blotting方法檢測(cè)各組細(xì)胞中HMGB1和LC3Ⅱ/Ⅰ的相對(duì)表達(dá)量，按照1.3中的透射電鏡方法檢測(cè)各自細(xì)胞中自噬小體的數(shù)量。

2 結(jié)果

2.1 miR-34a對(duì)JAR細(xì)胞HMGB1 mRNA及蛋白表達(dá)的影響 Real time PCR結(jié)果顯示，miR-34a模擬物組HMGB1的mRNA水平明顯下降，miR-34a抑制物組中HMGB1的mRNA水平顯著升高，與空白對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)；Western blotting結(jié)果表明，miR-34a模擬物組，HMGB1蛋白表達(dá)明顯低于空白對(duì)照組(P<0.05)；miR-34a抑制物組中HMGB1蛋白水平明顯高于空白對(duì)照組(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組細(xì)胞中miR-34a和HMGB1 mRNA表達(dá)比較(±s)

注：與NC組和空白對(duì)照組相比，*P<0.05；與INC組和空白對(duì)照組相比，△P<0.05。

2.2 缺氧對(duì)JAR細(xì)胞中HMGB1和LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達(dá)及細(xì)胞自噬的影響 與正常組相比，缺氧組中HMGB1和LC3Ⅱ/Ⅰ的相對(duì)表達(dá)量明顯升高，分別為1.20±0.10和1.06±0.08，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；缺氧組能觀察到明顯自噬小體，而正常組很難觀察到。

2.3 miR-34a對(duì)JAR細(xì)胞自噬的影響 miR-34a模擬物組中HMGB1蛋白表達(dá)水平為0.56±0.13，低于NC組的1.04±0.43(P<0.05)；自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ為0.48±0.02，明顯低于NC組的1.01±0.03(P<0.05)；miR-34a抑制物組中HMGB1蛋白表達(dá)水平明顯高于INC組(1.70±0.24 vs 0.82±0.17),LC3Ⅱ/LC3Ⅰ高于INC組(1.48±0.09 vs 0.99±0.06,P<0.05)。與NC組相比，miR-34a模擬物組中自噬小體數(shù)量明顯減少，與INC組相比，miR-34a抑制物組中自噬小體數(shù)量增多。

3 討論

miR-34a作為腫瘤抑制基因，在多種腫瘤發(fā)生發(fā)展中起作用，如子宮內(nèi)膜癌、前列腺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤和胎盤(pán)相關(guān)疾病等[9,10]。有報(bào)道顯示miR-34a在PE胎盤(pán)組織中表達(dá)降低[7]。miR-34a不僅與細(xì)胞侵襲和凋亡關(guān)系密切，亦與細(xì)胞自噬相關(guān)。自噬是細(xì)胞通過(guò)溶酶體途徑降解細(xì)胞內(nèi)成分的一種代謝過(guò)程，是細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激及其他環(huán)境刺激的適應(yīng)，有利于細(xì)胞生存[11]。在急性腎損傷、心血管疾病及前列腺癌中均發(fā)現(xiàn)miR-34a可抑制細(xì)胞自噬。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，缺氧處理后，細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白LC3表達(dá)水平升高，自噬小泡數(shù)量增加，說(shuō)明缺氧確實(shí)可誘導(dǎo)JAR細(xì)胞產(chǎn)生自噬，而轉(zhuǎn)染miR-34a模擬物并缺氧處理后，LC3表達(dá)水平降低，自噬小泡數(shù)量明顯減少，缺氧誘導(dǎo)的自噬受到抑制，而轉(zhuǎn)染miR-34a抑制物并缺氧處理后，LC3表達(dá)水平升高，自噬小泡數(shù)量增加，缺氧誘導(dǎo)的自噬進(jìn)一步增加，由此推測(cè)miR-34a可調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞的自噬。但miR-34a通過(guò)何種分子機(jī)制調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞自噬仍需進(jìn)一步探究。Liu等[12]曾報(bào)道，miR-34a通過(guò)下調(diào)HMGB1抑制視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞的自噬，增強(qiáng)了化療誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞的凋亡，因此推測(cè)，miR-34a可能通過(guò)調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞中HMGB1表達(dá)從而影響滋養(yǎng)細(xì)胞的自噬。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-34a模擬物后，HMGB1 mRNA水平和蛋白明顯降低，轉(zhuǎn)染miR-34a抑制物后則出現(xiàn)相反結(jié)果，推測(cè)HMGB1可能是miR-34a的靶基因。

HMGB1是一種非組蛋白的染色質(zhì)結(jié)合蛋白，表達(dá)于多種類(lèi)型細(xì)胞，并參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展。目前HMGB1在PE的研究中多與炎癥反應(yīng)有關(guān)[9]，但最近研究表明，HMGB1在調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬中有重要作用，HMGB1通過(guò)與自噬蛋白Beclin1結(jié)合，使Beclin1-Bcl2分離，繼而誘導(dǎo)自噬的發(fā)生[13]。在本實(shí)驗(yàn)中，JAR細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-34a模擬物后，HMGB1蛋白表達(dá)表達(dá)降低同時(shí)，細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ表達(dá)亦明顯降低，細(xì)胞中自噬小泡數(shù)量明顯減少，即細(xì)胞自噬水平降低，而轉(zhuǎn)染miR-34a抑制物后，HMGB1蛋白表達(dá)升高，LC3Ⅱ/Ⅰ表達(dá)升高，自噬小泡數(shù)量增加，細(xì)胞自噬水平亦升高。表明HMGB1表達(dá)與細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/Ⅰ表達(dá)一致，即HMGB1蛋白的升高或降低與滋養(yǎng)細(xì)胞自噬水平一致，推測(cè)HMGB1與JAR細(xì)胞自噬相關(guān)，結(jié)合前文HMGB1可能是miR-34a的靶基因，推測(cè)miR-34a可能通過(guò)調(diào)節(jié)HMGB1表達(dá)而影響滋養(yǎng)細(xì)胞的自噬。

研究[4]表明，自噬相關(guān)蛋白LC3在PE胎盤(pán)組織中表達(dá)升高，而B(niǎo)eclin1降低。Saito等[14]發(fā)現(xiàn)，缺氧誘導(dǎo)了滋養(yǎng)細(xì)胞自噬的活化，PE的氧化應(yīng)激增加使EVTs過(guò)度自噬，導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲失敗、胎盤(pán)血管重建障礙。本研究結(jié)果顯示，缺氧可誘導(dǎo)滋養(yǎng)細(xì)胞自噬，轉(zhuǎn)染miR-34a模擬物后缺氧誘導(dǎo)的JAR細(xì)胞自噬受抑，而轉(zhuǎn)染miR-34a抑制物后自噬水平升高。低表達(dá)的miR-34a可能通過(guò)上調(diào)HMGB1表達(dá)致滋養(yǎng)細(xì)胞自噬增加，而滋養(yǎng)細(xì)胞自噬過(guò)度激活致滋養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡，從而使其侵襲能力降低和胎盤(pán)血管形成障礙，進(jìn)而影響胎盤(pán)形成，參與PE的發(fā)生發(fā)展?？梢?jiàn)，自噬不足和過(guò)度自噬均將影響滋養(yǎng)細(xì)胞功能，從而參與PE的病理生理發(fā)展。

總之，本實(shí)驗(yàn)首次探究了miR-34a可能通過(guò)調(diào)節(jié)HMGB1表達(dá)影響滋養(yǎng)細(xì)胞自噬，參與PE的發(fā)病，但滋養(yǎng)細(xì)胞自噬在PE發(fā)病機(jī)制中的具體作用仍需進(jìn)一步研究。

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