王 伸， 鄧良偉， 徐 則 ， 王 霜， 姜奕圻， 鄭 丹

( 1．農(nóng)業(yè)部沼氣科學(xué)研究所， 成都 610041; 2．農(nóng)業(yè)部農(nóng)村可再生能源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 成都 610041)

豬場廢水厭氧消化液好氧處理過程酸化改進(jìn)及菌群結(jié)構(gòu)變化

王 伸1,2， 鄧良偉1,2， 徐 則1,2， 王 霜1,2， 姜奕圻1,2， 鄭 丹1,2

( 1．農(nóng)業(yè)部沼氣科學(xué)研究所， 成都 610041; 2．農(nóng)業(yè)部農(nóng)村可再生能源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 成都 610041)

豬場廢水厭氧消化液； SBR； pH值； 16SrRna； 厭氧氨氧化

1 試驗(yàn)材料和方法

1.1 污泥和污水

試驗(yàn)所用接種污泥來源于實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的好氧污泥(具有硝化、反硝化活性)和厭氧氨氧化污泥。試驗(yàn)進(jìn)水為四川邛崍某豬場廢水處理沼氣工程厭氧反應(yīng)器出水(厭氧消化液)，以及經(jīng)過固液分離但未經(jīng)過厭氧處理的固液分離出水，簡稱原水。

1.2 試驗(yàn)裝置

試驗(yàn)采用SBR工藝，實(shí)驗(yàn)裝置為直徑17 cm，高度33.8 cm的刻度塑料桶，總?cè)莘e6.0 L，有效容積為5.0 L。

1.3 試驗(yàn)方案

1.4 檢測項(xiàng)目及分析方法

1.5 微生物高通量測序分析

取適量污泥樣品，使用E.Z.N.A Soil DNA 試劑盒(Omega Bio-tek,Norcross,GA,U.S.)提取微生物總DNA。以16S rRNA V3～V4 區(qū)內(nèi)338F (5'-ACTCCT ACGGGAGGCAGCA-3')和806R (5'-GGACTAC HVGGGTWTCTAA T-3')為特征引物，采用20 L混合反應(yīng)體系，在GeneAmp 9700(ABI)型PCR 擴(kuò)增儀上完成目標(biāo)片段擴(kuò)增。反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性2 min，95℃變性30s，55℃退火30 s, 72℃延伸30 s，25個(gè)循環(huán)后,72℃延伸5 min，每個(gè)樣品重復(fù)3次。使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(Axygen,Union City,CA,U.S.)對PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收?；贗llumina Miseq PE300 平臺(tái)，委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成對PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的高通量測序，在多樣性評估的基礎(chǔ)上，采用Qiime 軟件進(jìn)行微生物分類學(xué)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 反應(yīng)器中混合液pH值變化

當(dāng)反應(yīng)器混合液pH值<6.5時(shí)，可以認(rèn)為是酸化。3個(gè)反應(yīng)器中混合液pH值變化列于圖1。從圖1中可以看出，試驗(yàn)期間只有CG組出現(xiàn)明顯酸化現(xiàn)象，從第49天起pH值開始下降，直至穩(wěn)定在5.8左右。兩種改進(jìn)策略AN組合RW組，只有AN組在第58～66天，出現(xiàn)短暫的酸化，其他時(shí)間都未出現(xiàn)酸化。在試驗(yàn)后期(第68天后)，pH值比較穩(wěn)定，AN組、RW組出水pH值平均值分別為7.7和7.7，說明兩種改進(jìn)策略能明顯抑制酸化。

圖1 不同反應(yīng)器曝氣結(jié)束時(shí)混合液pH值

2.2 SBR對COD的去除

圖2和圖3顯示了SBR對豬場廢水厭氧消化液COD去除效果。從圖2和圖3可知，在試驗(yàn)前期(低68 d前)，CG組和AN組進(jìn)水為厭氧消化液，其COD濃度為461 mg·L-1，COD去除率分別為7.09%和26.6%，波動(dòng)較大。添加原水的RW組，進(jìn)水COD為1806 mg·L-1，去除率為65.3%，隨著進(jìn)水COD升高，COD去除率也相應(yīng)升高。在第69～91 d期間，CG組和AN組進(jìn)水(厭氧消化液)COD濃度為621 mg·L-1，COD去除率分別為-13.2%和47.0%。添加原水的RW組，進(jìn)水COD為3761 mg·L-1，去除率為89.4%。通過和CG組對比發(fā)現(xiàn)，兩種酸化改進(jìn)策略都能提高COD去除率，AN組和RW組分別提高了60.2%和102.6%，其中添加原水組最明顯，但AN組出水COD濃度比較低。酸化后有機(jī)物的去除效果差的原因是異養(yǎng)細(xì)菌的最適生長pH值范圍為6.5～7.5。當(dāng)pH值在6.5以下時(shí)，異養(yǎng)細(xì)菌活性將受到抑制，在低pH值下微生物解體[18]，導(dǎo)致出水COD大于進(jìn)水COD，COD去除率為負(fù)值。添加原水后COD去除效率提高的原因是，厭氧消化液BOD5/COD 值0.26(見表1)，不易生化降解；添加原水后 BOD5/COD由0.26提高到0.32改善了可生化性，為后處理中好氧微生物的生長提供了易降解的有機(jī)碳源[19]，關(guān)鍵是pH值處于穩(wěn)定在7.7左右，有利于微生物生長代謝；對于AN組，同樣也是因?yàn)槲闯霈F(xiàn)酸化，系統(tǒng)處于有利于異養(yǎng)微生物生長的pH值之間。Bortone[20]等研究發(fā)現(xiàn)豬糞污水好氧生化處理出水中含有大約300 mg·L-1的難降解COD，說明AN組和RW組對COD已經(jīng)達(dá)到最大程度去除。

圖2 進(jìn)出水 COD 濃度

圖3 進(jìn)出水COD 去除率

2.3 SBR對氮的去除

2.3.1 氨氮濃度和氨氮轉(zhuǎn)化率

表1 運(yùn)行穩(wěn)定時(shí)(第69～91天)進(jìn)出水主要污染物濃度和污染物去除率

2.3.2 氨氮轉(zhuǎn)化產(chǎn)物和TIN去除率

圖4 進(jìn)出水濃度

圖5 進(jìn)出水-N去除率

2.4 微生物菌群結(jié)構(gòu)的變化

利用Miseq 高通量測序平臺(tái)對對照組和改進(jìn)組污泥中微生物多樣性進(jìn)行了分析。高達(dá)99.69%以上的覆蓋率表明，測序結(jié)果能真實(shí)反映樣品中的菌群分布情況。CG組，AN組和RW組得到相同的24523條有效序列，平均長度為分別為443，441和441 bp，其中片段長度在421～460 bp之間旳序列占總序列數(shù)的99.89%，在97%的相似水平上可聚類產(chǎn)生458，502和440個(gè)OTU。從稀釋度曲線可看出(圖5)，4組樣品的曲線均趨于平坦，樣品的測序數(shù)據(jù)量有效，可反映樣本真實(shí)的微生物群落結(jié)構(gòu)。不同反應(yīng)器中樣品在97%相似性上的維恩圖如圖8所示，顯示了不同樣品的OTU數(shù)目組成相似性及重疊情況。其中，有370個(gè)OTU為3組樣品所共有，占各組總數(shù)的73.7%以上。不同樣品的細(xì)菌群落多樣性指數(shù)如表2所示。表中Chao和ACE表征菌群的豐富度，數(shù)值越大，表示樣品中群落結(jié)構(gòu)越豐富。Shannon和Simpson指數(shù)常用來估算樣本中微生物的多樣性，Shannon值越大，說明群落多樣性越高，而Simpson指數(shù)值越大，說明群落多樣性越低，均一性越差。表2中數(shù)據(jù)可看出，改進(jìn)AN組增加了反應(yīng)器中細(xì)菌群落的豐富度和多樣性，同時(shí)也增加了細(xì)菌群落的均一性；而改進(jìn)RW組也增加了反應(yīng)器中細(xì)菌群落的豐富度和多樣性，同時(shí)也增加了細(xì)菌群落的均一性，但效果不明顯。對測序樣品得到的序列進(jìn)行比對分析，3組樣品在生物分類學(xué)門的水平上進(jìn)行分類，均檢測到12個(gè)門，且3者門的組成類別相同，但所占比例不同，占總比例的96.1%以上。由圖8可知變形菌門 (Proteobacteria) 和擬桿菌門(Bacteroidetes)為3組反應(yīng)器共有的優(yōu)勢菌門。改進(jìn)組使變形菌門 (Proteobacteria) 和擬桿菌門(Bacteroidetes)豐度顯著減少，而豐度有所減小。圖8顯示，Proteobacteria( 變形菌門) 是各污泥樣品中最豐富的門，CG,AN和RW分別占37.1%，35.1%和32.4%，改進(jìn)組AN和RW組豐度分別下降2.0%和4.7%。其中，變形菌門是細(xì)菌中最大的一個(gè)門，包含多種代謝種類的細(xì)菌，變形菌門細(xì)菌根據(jù)rRNA序列被分為五類，分別以希臘字母分別以希臘字母α，β，γ，δ和ε命名，β變形菌和γ變形菌以有機(jī)物為碳源，以呼吸和發(fā)酵代謝方式進(jìn)行兼性異養(yǎng)生長，去除廢水中有機(jī)物主要參與者[27-28]；δ變形菌包括嚴(yán)格厭氧的一些種類，同樣也具有降解COD功能。另外，α-，β-和γ這3類變形菌包含了常見的氨氧化細(xì)菌(AOB)，亞硝酸氧化細(xì)菌(NOB)以及反硝化細(xì)菌種屬[29]，是廢水處理系統(tǒng)中含氮污染物去除的主要參與者。筆者實(shí)驗(yàn)中這3類細(xì)菌的大量出現(xiàn)，推測與本反應(yīng)器中氮素的去除相關(guān)。CG,AN,和RW組第二主要門是擬桿菌門(Bacteroidetes)，分別占29.2%,24.5%和20.8%。擬桿菌門細(xì)菌是反應(yīng)器中的另一類優(yōu)勢菌。擬桿菌是化能有機(jī)營養(yǎng)細(xì)菌，代謝碳水化合物，能夠?qū)?fù)雜的有機(jī)物如：纖維素、淀粉等水解為單糖，再降解為乳糖、乙酸、甲酸等；將蛋白質(zhì)水解為氨基酸和有機(jī)酸等；將脂類水解為低級的脂肪酸[30]。筆者研究中檢測到在擬桿菌門具有一定的優(yōu)勢，可能在有機(jī)物的去除中發(fā)揮了作用。

圖6 各反應(yīng)器出水 -N 濃度變化

圖7 各反應(yīng)器出水 -N濃度變化

圖8 各反應(yīng)器出水 NOx--N 濃度變化

圖9 3個(gè)反應(yīng)器的TIN去除率

表2 微生物豐度和多樣性情況

圖10 3個(gè)樣品稀釋曲線圖

圖11 3個(gè)反應(yīng)器各菌群的Venn圖

圖12顯示的是4個(gè)樣品在屬的水平上主要菌群的分布情況。和CG組相比，AN組豐度下降最明顯的3個(gè)組分別是Nitrosomonas，從7.95%下降到4.25%；OPB35_soil_group_norank從6.44%下降到3.19%；Ferruginibacter從2.90%下降到0.81%；增加最明顯的三個(gè)組分別是：OPB56_norank從0.71%上升到3.67%；Deltaproteobacteria_unclassified從0.11%上升到3.11%；Candidate_division_WS6_norank從0.95%上升到2.84%。和CG組相比，RW組豐度下降最明顯的三個(gè)組分別是Bacteroidetes_vadinHA17_norank從8.46%下降到1.16%；Nitrosomonas從7.95%下降到0.79%；BD1-7_clade從4.33%下降到1.16%；增加最明顯的3個(gè)組分別是：Candidate_division_WS6_norank從0.95%上升到9.35%；OPB56_norank從0.71%上升到6.90%；Sterolibacterium從0.16%上升到2.82%；筆者就3個(gè)反應(yīng)器出現(xiàn)最主要的幾個(gè)屬水平的細(xì)菌進(jìn)行分析；在CG組，AN組和RW都發(fā)現(xiàn)好氧異養(yǎng)菌(如Saprospiraceae[31], Chitinophagaceae_uncultured[32]) ，和缺氧異養(yǎng)菌(如Bacteroidetes_vadinHA17_norank[33])和脫氮菌(如 Thermomonas[34], Comamonadaceae[35])出現(xiàn)富集，這些細(xì)菌以硝酸鹽為電子受體來降解COD；同時(shí)也富集了屬于疣微菌門(Verrucomicrobia)的OPB35_soil_group_norank, Verrucomicrobia是好氧甲烷氧化菌，有助于減少溫室氣體甲烷的排放[36]；在AN組和RW組中也富集了，有助于降解高分子化合物水解和酸化細(xì)菌(如Candidate_division_WS6_norank(AN =2.84%， RW=9.35%)[37-38]和Saccharibacteria_norank. (AN =2.18%， RW=5.19%[39])，但RW組富集程度高于AN組，可能原因是RW組進(jìn)水含有大量的高分子化合物，更有利于水解和酸化細(xì)菌富集。

圖12 3個(gè)反應(yīng)器各菌群在門屬水平上的相對豐度

圖13 3個(gè)反應(yīng)器各菌群在屬水平上的相對豐度

3 結(jié)論

(2) 接種厭氧氨氧化污泥(AN組)和厭氧消化液中添加豬場廢水原水(RW組)對COD去除率分別提高60.2%和102.6%，總無機(jī)氮(TIN)去除率分別為提高了11.1%和73.3%，其中RW組效果最明顯。

(3) 接種厭氧氨氧化污泥(AN組)和對照(CG)組的AOB相對豐度大于NOB，出現(xiàn)亞硝酸積累；RW組富集的AOB相對豐度小于NOB，沒出現(xiàn)亞硝酸積累，出水中硝酸鹽以硝酸鹽形式存在。

(4) 接種厭氧氨氧化污泥(AN組)富集的厭氧氨氧化細(xì)菌低于高效自養(yǎng)脫氮需求。

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Improvement in Acidification during Aerobic Treatment of Digested Swine Wastewater and Its Microbial Community Variation /

WANG Shen1,2， DENG Liang-wei1,2， XU Ze1,2， WANG Shuang1,2， JIANG Yi-qi1,2， ZHENG Dan1,2/

( 1.Biogas Institute of Ministry of Agriculture，Chengdu 610041，China; 2. Laboratory of Development and Application of Rural Renewable Energy，Ministry of Agriculture，Chengdu 610041，China)

Digested swine wastewater； SBR； pH； 16S rRNA； Anammox

2017-01-05

項(xiàng)目來源： 國家自然科學(xué)基金(31572450)； 國家生豬技術(shù)產(chǎn)業(yè)體系(CARS-36-10B)

王 伸(1990-)，男，安徽亳州人，在讀碩士，研究方向?yàn)檗r(nóng)村廢棄物處理技術(shù)，E-mail：ws55185366@163.com

鄧良偉，E-mail：dengliangwei@caas.cn

S216.4; X703

A

1000-1166(2017)02-0015-09