莊伊洢,黃曉卿,葉笑然,陳玄

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電針抗下肢肌萎縮的頻率組合優(yōu)化及其機制的初步研究

莊伊洢,黃曉卿,葉笑然,陳玄

(福建省中醫(yī)藥研究院,福州 350003)

目的 篩選電針治療肌萎縮的優(yōu)化電脈沖參數(shù)并探討機理。方法 SD大鼠40只,制作下肢肌萎縮模型后隨機分為A組(模型組,不電針)、B組(波寬0.5 ms,頻率2 Hz)、C組(波寬200 ms,頻率2 Hz)、D組(波寬200 ms,頻率1/2/3 Hz)。電針足三里和承山穴,共4個療程。觀察坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(SFI)、腓腸肌濕重比(GW)、腓腸肌纖維橫截面積比(GC)、腓腸肌細胞直徑比(GD)和腓腸肌細胞凋亡指數(shù)(AI)的變化。結果 與A組比,C組和D組的SFI、GW、GC明顯增大,AI明顯減小(＜0.05);與B組比,C組、D組的AI明顯減小(＜0.05);與C組比,D組的AI明顯減小(＜0.05)。結論 以波寬200 ms,頻率1/2/3 Hz的電脈沖延緩肌萎縮為優(yōu)化電針參數(shù),其機制與抑制肌細胞凋亡有關。

針刺;電針;波寬;頻率;肌萎縮;細胞凋亡;大鼠

電針療法是通過電針儀實現(xiàn)的,電針儀以電針參數(shù)刺激為主[1-3]。電針參數(shù)中的頻率代表單位時間內(nèi)輸出的電脈沖個數(shù)。根據(jù)頻率組成的差異,目前通用各型電針儀的輸出波型有連續(xù)波、疏密波和斷續(xù)波3種[4-5]。連續(xù)波是指頻率為一固定值的脈沖串;疏密波是指兩頻率交替的脈沖串;斷續(xù)波是指固定頻率輸出強度斷續(xù)的脈沖串,“斷”時的強度為0[6]。這3種波型實質(zhì)上均屬于規(guī)則性脈沖串。在規(guī)則性頻率電刺激下,穴區(qū)下的神經(jīng)和組織會發(fā)生適應,適應后組織對刺激的應答力下降[7],容易引起針感的耐受;而頻率輸出值不固定的不規(guī)則頻率刺激較規(guī)則頻率的刺激保持應答時間更長[8]。

電刺激可以使肌肉節(jié)律性收縮,防止肌萎縮進程。肌萎縮不伴隨壞死的細胞體積減少,細胞凋亡亦呈現(xiàn)細胞體積減少,目前電針治療肌萎縮的機理不明。不規(guī)則的頻率刺激可以抵抗針感耐受,那么,是否也能夠同時提高電針抗肌萎縮的療效?通過探討電針抗肌萎縮過程與細胞凋亡的變化關系是否可以闡明電針治療肌萎縮的機理呢?本文通過變化的頻率組合電參數(shù)來開展電針抗肌萎縮的療效觀察,并初步探討相關機理。

1 材料與方法

1.1 模型及分組

40只雄性SD大鼠以坐骨神經(jīng)切斷法制作右側下肢肌萎縮模型[9],左側下肢假手術。造模后大鼠按隨機數(shù)字表法分為A組(模型組,不電針)、B組、C組、D組,每組10只。

1.2 電針

正常喂養(yǎng)4星期后,根據(jù)隨證取穴及近部取穴[6]的原則,電針大鼠患側足三里和承山穴。每日1次,每次30 min,5次1個療程,療程間隔2 d,共4個療程。B組以佳健牌CMNS6-1型電針儀為刺激源,波寬0.5 ms,頻率2 Hz;C組、D組以計算機控制式電針儀為刺激源,C組波寬200 ms,頻率2 Hz,D組波寬200 ms,頻率1/2/3 Hz(保證輸出頻率平均值為2 Hz),隨機交替,循環(huán)輸出。由小至大調(diào)節(jié)各組強度,以大鼠下肢肌肉在肉眼下輕微收縮、跳動,針柄明顯顫動為度。

1.3 觀察指標

1.3.1 坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(SFI)

用拍照法[10]和墨水法[11]獲取足底圖形來檢測坐骨神經(jīng)功能。①足印長度(print length,PL),足印的最長距離,即從足跟到足尖。②足趾寬度(toe spread,TS),第1趾到第5趾連線距離。③中間足趾寬度(intermediary toe spread,IT),第2趾到第4趾連線距離,代入Bain公式檢測SFI。Bain公式為SFI=[109.5(eTS－nTS)/nTS－38.3(ePL－nPL)/nPL＋13.3(eIT－nIT)/nIT]－8.8(前綴e代表病損側,前綴n代表健側)。

SFI的范圍:SFI=0為正常,SFI＜0為不同程度的損傷。

1.3.2 肌濕重(GW)、肌纖維橫截面積(GC)、肌細胞直徑(GD)及細胞凋亡指數(shù)(AI)[10]

取各組大鼠雙下肢腓腸肌,稱量肌濕重。石蠟包埋處理后,分別對同一肌組織的2個蠟塊沿肌纖維橫、縱切面方向進行切片。橫切片HE染色,縱切片TUNEL染色。

每張切片隨機選擇5個不重復高倍視野(×40)在Image-Pro Plus圖像分析系統(tǒng)中處理。橫切片每個視野分別檢測腓腸肌纖維橫截面積及細胞直徑,縱切片每個視野計數(shù)陽性細胞核數(shù)和總細胞核數(shù),AI=陽性細胞核數(shù)/總細胞核數(shù);均求平均值。

1.4 統(tǒng)計學方法

GW、GC、GD均以患側與健側的測定值之比表示。各組的SFI、GW、GC、GD和患側AI均以均數(shù)±標準差表示;采用單因素方差分析進行統(tǒng)計。以＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

表1中,與A組比,拍照法獲得的C組、D組的SFI明顯增大(＜0.05)(圖1)。表2中,與A組比,C組、D組的GW、GC明顯增大(＜0.05);表2中,與A組比,C組、D組的患側AI明顯減小(＜0.05);與B組比,C組、D組的患側AI明顯減小(＜0.05);與C組比,D組患側AI明顯減小(＜0.05)(圖2、圖3)。

表1 電針足三里穴-承山穴對下肢肌萎縮大鼠下肢功能的影響 (±s)

表1 電針足三里穴-承山穴對下肢肌萎縮大鼠下肢功能的影響 (±s)

組別n坐骨神經(jīng)功能指數(shù)SFI 墨水法拍照法 A組10﹣67.48±12.55﹣73.45±9.25 B組10﹣61.64±15.34﹣64.98±9.53 C組10﹣55.52±11.89﹣56.57±9.641) D組10﹣64.52±13.17﹣57.96±9.311)

注:與A組比較1)＜0.05

表2 電針足三里穴-承山穴對下肢肌萎縮大鼠腓腸肌細胞細胞凋亡的影響 (±s)

表2 電針足三里穴-承山穴對下肢肌萎縮大鼠腓腸肌細胞細胞凋亡的影響 (±s)

組別n腓腸肌濕重比GW腓腸肌纖維橫截面積比GC腓腸肌細胞直徑比GD患側腓腸肌細胞凋亡指數(shù)AI(%) A組100.278±0.0740.450±0.1390.463±0.18720.21±1.13 B組100.305±0.0830.514±0.1720.527±0.21016.61±1.84 C組100.364±0.0781)0.658±0.2311)0.707±0.19511.27±2.121)2) D組100.374±0.0851)0.638±0.1101)0.710±0.2008.34±1.981)2)3)

注:與A組比較1)＜0.05;與B組比較2)＜0.05;與C組比較3)＜0.05;健側腓腸肌細胞凋亡指數(shù)AI(%)≈0

圖1 大鼠電針4個療程后拍照法獲得的足底圖形(左側為健側足底,右側為患側足底)

A組(健側) B組(健側) C組(健側) D組(健側) A組(患側) B組(患側) C組(患側) D組(患側)

A組(健側) B組(健側) C組(健側) D組(健側) A組(患側) B組(患側) C組(患側) D組(患側)

3 討論

電針療法是延緩肌萎縮及僵硬的有效辦法[12-13]。通用各型電針儀的輸出波寬為0.2～0.5 ms,屬于短脈沖波寬。研究表明[10]電脈沖100 ms和200 ms的寬波較0.5 ms的短波寬防治肌萎縮效果較好。本文選取200 ms寬波作為電針參數(shù)。

已知通用各型電針儀輸出頻率參數(shù)均屬于規(guī)則性頻率,故易發(fā)生適應反應。針對骨骼肌萎縮的疾病,不規(guī)則性的頻率刺激可以使萎縮的肌肉產(chǎn)生不同節(jié)律的收縮,達到延緩萎縮的目的[8,14]。而臨床電針治療中針感常伴有減弱甚至消失[15],這與規(guī)則性頻率促使神經(jīng)發(fā)生適應,造成局部對刺激的效應降低有關。有學者[16]采用多種頻率交替且不規(guī)則的電針刺激身體不同體區(qū)的穴位,結果顯示不規(guī)則頻率能明顯延長電針針感的持續(xù)時間。表1、表2結果顯示,與C組比,D組的肌組織學和肌細胞凋亡指數(shù)的改善都更顯著,說明D組的療效優(yōu)于C組,表明采用200 ms波寬并且脈沖頻率為低頻不規(guī)則的電針刺激療效優(yōu)于200 ms波寬,其原因可能與上述針感的持續(xù)時間延長相似。

SFI稱為坐骨神經(jīng)功能指數(shù),可以反應大鼠下肢的整體功能,是公認的評定坐骨神經(jīng)功能損傷和康復的指標,其獲取方法常用拍照法[10]和墨水法[11]。1993年,我國學者沈寧江采用墨水法測量Bain公式中的SFI,該法在國內(nèi)被大量引用。具體操作是制作60 cm× 10 cm×10 cm的長方形通道,內(nèi)底鋪上匹配的白紙,用墨水涂抹大鼠的雙腳掌,令大鼠自行走過通道,白紙面上會留下足印,顯示出足底各足趾間距等參數(shù)。但是該法獲得的足底印圖形往往因步行中拖帶造成足底印跡變形(如足印拖長)或因著色墨水不夠而出現(xiàn)足趾或足跡的缺失,這些問題使得墨水法測得的足底印跡數(shù)據(jù)參數(shù)難以完整(圖4)。本文引用了2000年建立的拍照法獲得大鼠的足底圖形,避免了墨水法的不足[17]。表1結果可見,墨水法測的各組SFI結果沒有統(tǒng)計學意義;拍照法測的SFI中,與A組比,B組的SFI無顯著性差異;C組、D組的SFI明顯增大。說明采用200 ms波寬及200 ms波寬并且頻率為低頻不規(guī)則的電針都可以更好地改善下肢神經(jīng)損傷的步行功能。

圖4 墨水法測SFI的大鼠足印圖(×4)

腓腸肌濕重比(GW)、腓腸肌纖維橫截面積比(GC)、腓腸肌細胞直徑比(GD)以及細胞凋亡指數(shù)(AI)是肌肉組織細胞學的經(jīng)典指標,可以反應電針治療肌萎縮的療效。表2中可見,與A組比,B組GW、GC和GD均無明顯增大;C組和D組GW、GD明顯增大,說明C組和D組療效優(yōu)于B組,表明200 ms波寬及200 ms波寬并且 頻率為低頻不規(guī)則的電針刺激都可以提高肌萎縮的組織學的療效。各組AI均為患側測量值,與A組比,B組AI無明顯減小;C組和D組AI明顯減小,表明200 ms波寬能抑制肌細胞凋亡。與C組比,D組AI明顯減小,表明加寬波并加上電針頻率的變化可以更進一步提高電針抑制肌細胞凋亡的效果。表2中A組行自左而右看,GW、GC和GD均小于1,其AI值約20%,這表明肌組織萎縮明顯且伴隨發(fā)生了肌細胞凋亡。B組、C組、D組AI值均小于17%,即小于A組?？梢?電針治療后會造成肌萎縮組織學變化的減輕伴隨細胞凋亡的減輕。表2中各組GW、GD和AI列自上而下看,與B組比,C組GW、GD明顯增大,AI明顯減小,說明C組療效好于B組,這表明200 ms波寬的療效優(yōu)于0.5 ms。與C組比,D組GC和AI改善都更顯著,這表明采用200 ms波寬并且頻率為低頻不規(guī)則的電針刺激的療效優(yōu)于200 ms波寬。電針治療的效應一方面使肌萎縮組織學變化的減輕,另一方面使伴隨的細胞凋亡程度減輕。各組患側AI結果表示,寬波電針組的療效優(yōu)于常規(guī)電針,而寬波變頻電針的療效優(yōu)于寬波電針的療效?？梢?細胞凋亡參與肌萎縮,也參與電針延緩肌萎縮的過程。

綜上所述,電脈沖參數(shù)中以寬波且低頻變化頻率的電針參數(shù)具有更好的延緩肌萎縮的效果,并能夠抑制細胞凋亡,該效果明顯優(yōu)于常規(guī)電針儀的電脈沖。本研究暫不能明確肌萎縮與細胞凋亡的先后關系;研究結果提示有可能通過阻斷凋亡的信號通路,達到延緩肌萎縮的療效。

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A Preliminary Study of the Optimal Frequency Combination and Mechanism of Electroacupuncture Treatment for Lower Limb Myatrophy

350003,

Objective To sift out the optimized electric pulse parameters for electroacupuncture treatment for lower limb myatrophy and explore the mechanism of its treatment. Method A model of lower limb myatrophy was made in 40 SD rats. The rats were then randomized to groups A (model group without electroacupuncture), B (a pulse duration of 0.5 ms and a frequency of 2 Hz), C (a pulse duration of 200 ms and a frequency of 2 Hz) and D (a pulse duration of 200 ms and a frequency of 1/2/3 Hz). Points Zusanli(ST36) and Chengshan(BL57) were given electroacupuncture for four courses of treatment. The sciatic function index (SFI), gastrocnemius muscle wet weight ratio (GW), gastrocnemius muscle fiber cross-sectional area ratio (GC), gastrocnemius muscle cell diameter ratio (GD) and gastrocnemius muscle cell apoptosis index (AI) were determined. Result SFI, GW and GC increased significantly and AI decreased significantly in groups C and D compared with group A (＜0.05). AI decreased significantly in groups C and D compared with group B (＜0.05). AI decreased significantly in groups D compared with group C (＜0.05). Conclusion A pulse duration of 200 ms and a frequency of 1/2/3 Hz are the optimized electric pulse parameters for electroacupuncture delaying myatrophy. Its mechanism is related to inhibiting myocyte apoptosis.

Acupuncture; Electroacupuncture; Pulsewidth; Frequency; Myatrophy; Apoptosis; Rats

1005-0957(2017)04-0473-05

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2017.04.0473

2016-11-20

國家自然科學基金面上項目(81373733);福建省屬公益類科研院所基本科研專項(2015R1035-4)

莊伊洢(1988—),女,實習研究員,碩士,Email:zyy.roy@hotmail.com

陳玄(1979—),女,助理研究員,碩士,Email:chenxuanfz@aliyun.com