方漢軍，李鋒華，許 成，廉秋芳

·論著·

轉化生長因子β1基因沉默脂肪干細胞移植對鹽敏感性高血壓大鼠心肌纖維化和心肌細胞的影響研究

方漢軍1，李鋒華1，許 成1，廉秋芳2

目的 探討轉化生長因子β1(TGF-β1)基因沉默脂肪干細胞(ADSCs)移植對鹽敏感性高血壓大鼠心肌纖維化和心肌細胞凋亡的影響。方法 本實驗于2015年6月—2016年7月在陜西省醫(yī)學實驗動物中心實驗室完成。體外培養(yǎng)ADSCs，構建TGF-β1為靶向基因的mRNA和siRNA表達質粒，病毒轉染至ADSCs，取第三代ADSCs進行慢病毒轉染，轉染時分為空白組、對照組、TGF-β1-siRNA轉染組。采用Western blot法檢測基因轉染后第3天和第14天不同基因轉染組ADSCs TGF-β1蛋白表達情況。選取80只SPF級雄性Dahl鹽敏感大鼠構建鹽敏感性高血壓大鼠模型，采用隨機數(shù)字表法分為正鹽組、高鹽組、ADSCs組及TGF-β1基因沉默組，每組20只。正鹽組給予0.3%氯化鈉飲食；高鹽組給予8%氯化鈉飲食；ADSCs組予8%氯化鈉飲食6周后尾靜脈移植ADSCs，持續(xù)3 d；TGF-β1基因沉默組大鼠給予8%氯化鈉飲食6周后尾靜脈移植TGF-β1基因沉默ADSCs，持續(xù)3 d。細胞移植2周后，采用反轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)檢測4組大鼠心肌組織TGF-β1mRNA表達情況，采用Western blot法檢測4組大鼠心肌組織TGF-β1蛋白表達情況，采用超聲心動圖檢測4組大鼠左心室射血分數(shù)(LVEF)和縮短分數(shù)(FS)，并計算左心室質量指數(shù)(LVMI)，VG染色測算膠原容積積分，HE染色觀察心肌細胞形態(tài)，熒光顯微鏡下觀察心肌組織中CM-Dil標記的ADSCs分布情況，采用TUNEL法檢測4組大鼠心肌細胞凋亡情況。結果 (1)熒光顯微鏡下顯示，CM-Dil標記的ADSCs呈橘紅色，標記率為97%。(2)基因轉染后第3天和第14天空白組和對照組ADSCs TGF-β1蛋白相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而TGF-β1-siRNA轉染組ADSCs TGF-β1蛋白相對表達量低于空白組和對照組(P<0.05)。(3)細胞移植2周后，TGF-β1基因沉默組大鼠心肌組織TGF-β1mRNA、蛋白相對表達量低于正鹽組、高鹽組及ADSCs組，ADSCs組大鼠心肌組織TGF-β1mRNA、蛋白相對表達量低于正鹽組、高鹽組，高鹽組大鼠心肌組織TGF-β1mRNA、蛋白相對表達量高于正鹽組(P<0.05)。(4)細胞移植2周后，高鹽組和ADSCs組大鼠LVEF和FS低于正鹽組和TGF-β1基因沉默組，LVMI高于正鹽組和TGF-β1基因沉默組(P<0.05)；ADSCs組和TGF-β1基因沉默組大鼠LVEF和FS高于高鹽組，LVMI低于高鹽組(P<0.05)；正鹽組與TGF-β1基因沉默組大鼠LVEF、FS及LVMI比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。(5)細胞移植2周后，高鹽組、ADSCs組和TGF-β1基因沉默組大鼠膠原容積積分高于正鹽組，ADSCs組和TGF-β1基因沉默組大鼠膠原容積積分低于高鹽組，TGF-β1基因沉默組大鼠膠原容積積分低于ADSCs組(P<0.05)。(6)HE染色結果顯示，細胞移植2周后高鹽組大鼠心肌出現(xiàn)明顯纖維化且巨噬細胞浸潤明顯增多，ADSCs組大鼠心肌纖維化較輕，TGF-β1沉默組大鼠心臟纖維化最輕、巨噬細胞浸潤最少。(7)熒光顯微鏡下顯示，細胞移植2周后正鹽組和高鹽組大鼠心肌組織中未發(fā)現(xiàn)CM-Dil標記的ADSCs，TGF-β1基因沉默組大鼠心肌組織中CM-Dil標記的ADSCs多于ADSCs組(P<0.05)。(8)細胞移植2周后，正鹽組大鼠心肌細胞凋亡率為0，ADSCs組和TGF-β1基因沉默組大鼠心肌細胞凋亡率低于高鹽組，TGF-β1基因沉默組大鼠心肌細胞凋亡率低于ADSCs組(P<0.05)。結論 TGF-β1基因沉默ADSCs移植能有效減輕鹽敏感性高血壓大鼠心肌纖維化，減少心肌細胞凋亡。

高血壓；大鼠，近交Dahl；脂肪干細胞；轉化生長因子β1；基因沉默；心??；纖維化；細胞凋亡

據統(tǒng)計，目前我國約有3億高血壓患者，且高血壓發(fā)病率呈逐年升高趨勢、發(fā)病人群逐漸年輕化，其中50%以上高血壓屬于鹽敏感性高血壓。有研究結果顯示，鹽敏感性高血壓患者心腦血管疾病發(fā)病率遠高于鹽不敏感性高血壓患者[1]，盡管鹽敏感性高血壓的發(fā)病機制尚未完全明確，但有學者提出鹽敏感性高血壓可能會引起心肌纖維化[2-4]。

間充質干細胞是一類具有多向分化潛能的多能干細胞，近年來多項研究發(fā)現(xiàn)間充質干細胞可參與受損組織的修復[5-7]，尤其是心肌纖維化的修復[8]。脂肪干細胞(adipose-derived stromal cells，ADSCs)作為一種源于脂肪組織的間充質干細胞，近年來頗受醫(yī)學研究者的青睞。研究顯示，ADSCs可以修復心肌損傷，向心肌細胞分化[9-14]；此外，其還可以分泌多種生長因子[15-16]，其中轉化生長因子β1(TGF-β1)是目前發(fā)現(xiàn)的與心肌纖維化關系最密切的一種生長因子[17-18]。TGF-β1可以促進心肌組織中膠原基因表達和心肌成纖維細胞轉化，進而導致心肌細胞外基質(EMC)合成、沉積增多，最終導致心肌纖維化[19-22]。因此，移植分泌TGF-β1的ADSCs對鹽敏感性高血壓所致的心肌纖維化的治療效果有限?；谏鲜鲇^點推測，移植TGF-β1基因沉默的ADSCs治療心肌纖維化應有效。本研究通過探究TGF-β1基因沉默的ADSCs移植對鹽敏感性高血壓大鼠心肌纖維化和心肌細胞凋亡的影響，旨在為鹽敏感性高血壓的治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 本實驗于2015年6月—2016年7月在陜西省醫(yī)學實驗動物中心實驗室完成。80只SPF級雄性Dahl鹽敏感大鼠〔生產許可證號為SCXK(陜)2011-008，動物實驗許可證號為SYXK(陜)2010-002〕均由陜西省醫(yī)學實驗動物中心實驗室提供，日齡42～49 d，體質量150～160 g，飼養(yǎng)環(huán)境：室溫25 ℃，濕度50%～80%，自由飲水和覓食。

1.2 主要實驗材料及儀器 凍存原代ADSCs來源于陜西省醫(yī)學實驗動物中心實驗室；胰蛋白酶購自美國Sigma公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)由Hyclone提供；細胞培養(yǎng)箱購自Heraeus Sepatech公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清均購自Hyclone，Trizol試劑盒購自Invitrogen；BCA蛋白濃度測試試劑盒(增強型)、5×SDS蛋白上樣緩沖液、20×TBS緩沖液均購自南京建成生物工程研究所。本實驗細胞處理過程中使用的超凈工作臺由藝斯高(上海)貿易有限公司提供。TGF-β1一抗為兔抗人多克隆抗體，TGF-β1二抗為辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔多克隆抗體；GAPDH一抗為單克隆小鼠抗人抗體，GAPDH二抗為HRP標記的山羊抗小鼠多克隆抗體，所有抗體均購自艾康生物技術(杭州)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 體外培養(yǎng)ADSCs 將凍存原代ADSCs置于60 ℃恒溫水浴箱，30 s內快速復蘇。融化后將ADSCs迅疾轉入EP管中，加入DMEM培養(yǎng)基后重復小心吹打細胞使其均勻分布，隨后離心棄上清液。將復蘇后的細胞用DMEM完全培養(yǎng)基調整密度為1×106/ml。進行三代培養(yǎng)后采用胰蛋白酶溶液消化2～3 min，終止消化；離心棄上清重懸細胞。調整細胞密度為1×106/ml，培養(yǎng)7 d。離心去上清液洗滌，將人內皮祖細胞密度調整為8×105/ml，隨后向細胞懸液中加入5 μl CM-Dil進行細胞標記；置于培養(yǎng)箱中標記孵化25～30 min后離心棄上清PBS重懸細胞，重復標記兩次。熒光顯微鏡下觀察細胞標記情況，細胞呈鮮艷的橘紅色且顏色均勻為ADSCs標記成功。

1.3.2 基因轉染 構建TGF-β1為靶向基因的mRNA和siRNA表達質粒，pLenti X1 Puro-shTGFβ-1-eGFP，以綠色熒光蛋白(GFP)為報告基因。取5×106個第三代ADSCs接種于10 cm培養(yǎng)皿中，于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，轉染24 h前離心去舊培養(yǎng)液，再向細胞中加入5 ml DMEM完全培養(yǎng)液。將ADSCs分為空白組(未經處理的ADSCs)、對照組(轉染對照慢病毒的ADSCs)、TGF-β1siRNA轉染組(轉染TGF-β1siRNA慢病毒的ADSCs)。制備DNA-Lipofectamine 2000復合物。在對照組和TGF-β1siRNA轉染組細胞中分別滴加對照慢病毒和DNA-Lipofectamine 2000復合物，于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)液。48 h后收集并洗滌細胞繼續(xù)培養(yǎng)，采用Western blot法檢測4組ADSCs基因轉染后第3天、第14天TGF-β1蛋白表達情況。

1.3.3 分組及干預方法 采用隨機數(shù)字表法將80只鹽敏感性高血壓大鼠分為正鹽組、高鹽組、ADSCs組及TGF-β1基因沉默組，每組20只。正鹽組大鼠給予0.3%氯化鈉飲食；高鹽組大鼠給予8%氯化鈉飲食； ADSCs組大鼠給予8%氯化鈉飲食6周后尾靜脈移植CM-Dil標記的ADSCs 3×106個/L，持續(xù)3 d；TGF-β1基因沉默組大鼠給予8%氯化鈉飲食6周后尾靜脈移植CM-Dil標記的TGF-β1基因沉默的ADSCs 3×106個/L，持續(xù)3 d。

1.4 反轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)法檢測TGF-β1mRNA表達情況 細胞移植2周后分別從4組選取5只大鼠進行處死，取高鹽組、ADSCs組及TGF-β1基因沉默組心肌損傷組織，取正鹽組大鼠同一部位心肌組織。采用RT-PCR法檢測心肌組織TGF-β1mRNA相對表達量。通過Oligo 7.36 Demo軟件設計引物，F(xiàn)ABP-5上游引物：5′-GCTAATGGTGGACCGCAAC-3′，下游引物：5′-CAGTGAGCACTGAAGCGA-3′，擴增片段212 bp；內參GAPDH上游引物：5′-GTGCTGAGTATGTCGTGGA-3′，下游引物：5′-CACAGTCTTCTGAGTGGCA-3′，擴增片段121 bp。提取細胞RNA并反轉錄為cDNA，以GAPDH基因作為內參，檢測目的基因TGF-β1mRNA的相對表達量。

1.5 Western blot法檢測TGF-β1蛋白表達情況 細胞移植2周后分別從4組選取5只大鼠處死，取高鹽組、ADSCs組及TGF-β1基因沉默組大鼠心肌損傷組織，取正鹽組大鼠同一部位心肌組織。根據BCA試劑盒(購自北京益德益華生物有限公司)說明書提取、測定心肌組織蛋白含量，具體如下：將細胞裂解并稀釋至相同的蛋白濃度，100 ℃煮沸5 min使蛋白變性。每組取蛋白40 μg，10%SDS-PAGE凝膠電泳(70 V，30 min；100 V，90 min)；轉膜(200 mA，3 h)至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜；5%脫脂牛奶室溫封閉2 h(或4 ℃過夜)；一抗1∶500室溫孵育2 h(或4 ℃過夜)；TBS洗滌3次，PBS洗滌1次；之后進行蛋白免疫印跡反應，拍照記錄后采用軟件分析圖像，測定4組大鼠心肌組織TGF-β1蛋白相對表達量。

1.6 左心室射血分數(shù)(LVEF)、縮短分數(shù)(FS)、左心室質量指數(shù)(LVMI)檢測方法 細胞移植2周后分別從4組選取5只小鼠，麻醉后采用脫毛膏去除左胸口毛發(fā)，使用醫(yī)用膠條將大鼠四肢固定在導電塊(分別用導電膠涂抹導電塊處)上，胸部涂抹耦合劑進行超聲檢測。提取大鼠超聲存儲參數(shù)，并采用Vevo770高分辨超聲成像系統(tǒng)檢測LVEF和FS。稱重處死大鼠后迅速打開胸腔，分離大鼠左心室，計算LVMI。剝離高鹽組、ADSCs組及TGF-β1基因沉默組大鼠心肌損傷組織及正鹽組大鼠同部位心肌組織，分別將其作出3份組織切片，其中1份石蠟切片用于測算膠原容積積分，1份冰凍組織切片用于HE染色，1份冰凍組織切片用于觀察大鼠心肌組織中ADSCs分布情況。

1.7 VG染色測算膠原容積積分 將HE染色后的切片進行常規(guī)脫蠟至水，按VG染色試劑盒(福州邁新)說明書中的具體步驟進行操作。在計算機圖像分析系統(tǒng)中隨機取每張切片的8個視野(×200倍)，計算每張切片8個視野的膠原容積積分，取6張切片膠原容積積分的平均值。

1.8 HE染色 將由低濃度到高濃度的乙醇作為脫水劑，逐漸脫去組織切片中的水分。再將組織塊置于既溶于乙醇又溶于石蠟的二甲苯中透明，以二甲苯替換出組織塊中的乙醇，隨后進行浸蠟包埋。將包埋好的蠟塊固定于切片機上，切成5～8 μm厚薄片。將薄片燙平，再貼到載玻片上，45 ℃恒溫烘干。脫蠟后采用HE染色法染色。染色后的切片經純乙醇脫水，再經二甲苯透明。將已透明的切片滴上加拿大樹膠，蓋上蓋玻片封固。待樹膠干燥后，熒光顯微鏡下觀察4組大鼠心肌細胞形態(tài)。

1.9 移植后心肌組織中ADSCs分布情況 將冰凍組織切片進行4′，6-二脒基-2苯基吲哚染色。干燥后，顯微鏡下隨機選取每張切片的3個視野進行拍照記錄，假設每張照片的總亮度為1，每張照片選取一個光亮度點，采用ACDsee 5.0軟件確定其坐標。在圖像中隨機選取8個視野，計數(shù)每個視野中CM-Dil標記的ADSCs數(shù)。

1.10 TUNEL法檢測心肌細胞凋亡情況 細胞移植2周后分別從4組選取5只大鼠進行處死，取高鹽組、ADSCs組及TGF-β1基因沉默組大鼠心肌損傷組織，取正鹽組大鼠同一部位心肌組織。每只大鼠心肌組織切片共計數(shù)5個，石蠟切片常規(guī)脫蠟至水；滴加1滴復合消化液(蛋白酶K與胃蛋白酶)，25 ℃孵化20 min；洗滌后滴加TUNEL標記反應混合液50 μl，在濕盒中37 ℃孵育1 h；滴加POD2轉化液50 μl，濕盒37 ℃孵育30 min；PBS沖洗3次，DAB顯色；HE復染，顯微鏡下顯示棕黃色細胞核的細胞為凋亡細胞，計數(shù)凋亡細胞數(shù)量并計算細胞凋亡率。

2 結果

2.1ADSCs形態(tài) 成功分離出的ADSCs經體外傳代培養(yǎng)72h后呈梭形，胞質可見明顯突起，多角形等雜細胞消失，細胞呈成纖維細胞樣，胞質豐富，核大，平行排列或漩渦狀生長，漩渦中心細胞多層分布，細胞形態(tài)符合ADSCs一般生物學特性，見圖1A。熒光顯微鏡下經CM-Dil標記的ADSCs可呈橘紅色，標記成功率為97%，見圖1B。

注：A為ADSCs傳代培養(yǎng)72h后形態(tài)，B為CM-Dil標記的ADSCs形態(tài)

圖1 顯微鏡下ADSCs形態(tài)(×200)

Figure1ADSCsMorphologyundermicroscope

2.2 不同基因轉染組轉染ADSCs基因后TGF-β1蛋白表達情況 基因轉染后第3天和第14天3組ADSCsTGF-β1蛋白相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；其中空白組和對照組ADSCsTGF-β1蛋白相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；而TGF-β1siRNA轉染組ADSCsTGF-β1蛋白相對表達量低于空白組和對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表1、圖2)。

Table 1 Comparison of relative expression quantity of TGF-β1protein in different gene transfection groups after gene transfection of ADSCs

組別第3天第14天空白組5868±2256137±383對照組5739±2015803±240TGF?β1siRNA轉染組2669±074ab2912±162abF值31112045P值<001<001

注：與空白組比較，aP<0.05；與對照組比較，bP<0.05

圖2 不同基因轉染組轉染ADSCs基因后TGF-β1蛋白電泳結果

Figure 2 Electrophoretic results of TGF-β1protein in different gene transfection groups after gene transfection of ADSCs

2.3 4組大鼠心肌組織TGF-β1mRNA、蛋白相對表達量比較 4組大鼠心肌組織TGF-β1mRNA、蛋白相對表達量比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；其中TGF-β1基因沉默組大鼠心肌組織TGF-β1mRNA、蛋白相對表達量低于正鹽組、高鹽組及ADSCs組，ADSCs組大鼠心肌組織TGF-β1mRNA、蛋白相對表達量低于正鹽組、高鹽組，高鹽組大鼠心肌組織TGF-β1mRNA、蛋白相對表達量高于正鹽組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表2、圖3～4)。

2.4 4組大鼠LVEF、FS及LVMI比較 4組大鼠LVEF、FS及LVMI比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；其中高鹽組和ADSCs組大鼠LVEF和FS低于正鹽組和TGF-β1基因沉默組，LVMI高于正鹽組和TGF-β1基因沉默組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；ADSCs組和TGF-β1基因沉默組大鼠LVEF和FS高于高鹽組，LVMI低于高鹽組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；正鹽組與TGF-β1基因沉默組大鼠LVEF、FS及LVMI比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，見表3)。

Table2ComparisonofrelativeexpressionquantityofTGF-β1mRNAandTGF-β1proteinofmyocardialtissueamongthefourgroups

組別只數(shù)TGF?β1mRNA相對表達量TGF?β1蛋白相對表達量正鹽組5179±010027±002高鹽組5289±023a055±004aADSCs組5171±009ab025±003abTGF?β1基因沉默組5132±009abc016±001abcF值1147618950P值<001<001

注：TGF-β1=轉化生長因子β1；與正常組比較，aP<0.05；與ADSCs組比較，bP<0.05；與ADSCs組比較，cP<0.05

注：TGF-β1=轉化生長因子β1

圖3 4組大鼠心肌組織TGF-β1mRNA表達情況

Figure 3 TGF-β1mRNA expression of myocardial tissue of the four groups

圖4 4組大鼠心肌組織TGF-β1蛋白電泳結果

Figure 4 Electrophoretic results of TGF-β1protein of myocardial tissue the four groups

表3 4組大鼠LVEF、FS及LVMI比較(±s)

注：LVEF=左心室射血分數(shù)，F(xiàn)S=縮短分數(shù)，LVMI=左心室質量指數(shù)；與正鹽組比較，aP<0.05；與高鹽組比較，bP<0.05；與ADSCs組比較，cP<0.05

2.5 4組大鼠膠原容積積分比較 正鹽組大鼠膠原容積積分為(0.149±0.047)分，高鹽組為(0.260±0.026)分，ADSCs組為(0.187±0.035)分，TGF-β1基因沉默組為(0.157±0.051)分。4組大鼠膠原容積積分比較，差異有統(tǒng)計學意義(F=7.62，P<0.01)；其中高鹽組、ADSCs組和TGF-β1基因沉默組大鼠膠原容積積分高于正鹽組，ADSCs組和TGF-β1基因沉默組大鼠膠原容積積分低于高鹽組，TGF-β1基因沉默組大鼠膠原容積積分低于ADSCs組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.6 4組大鼠心肌細胞形態(tài) 正鹽組大鼠心肌細胞排列有序，心肌間質無炎性細胞浸潤及纖維化瘢痕形成(見圖5A)；高鹽組大鼠心肌纖維化明顯，巨噬細胞浸潤明顯增多(見圖5B)；與高鹽組相比，ADSCs組大鼠心肌組織盡管有較多巨噬細胞浸潤，但心肌細胞排列較有序且無纖維化瘢痕形成，心肌纖維化程度較輕(見圖5C)；TGF-β1基因沉默組大鼠心臟纖維化程度最輕，巨噬細胞浸潤最少，與正鹽組大鼠表現(xiàn)相似(見圖5D)。

注：A為正鹽組，B為高鹽組，C為ADSCs組，D為TGF-β1基因沉默組

圖5 4組大鼠心肌細胞形態(tài)(HE染色，×200)

Figure 5 Myocardial cells morphology of the four groups

2.7 4組大鼠CM-Dil標記的ADSCs比較 正鹽組和高鹽組大鼠心肌組織中未發(fā)現(xiàn)CM-Dil標記的ADSCs，ADSCs組大鼠心肌組織中CM-Dil標記的ADSCs為(19.64±2.14)個，TGF-β1基因沉默組為(33.24±3.19)個。TGF-β1基因沉默組大鼠心肌組織中CM-Dil標記的ADSCs多于ADSCs組，差異有統(tǒng)計學意義(t=7.92，P<0.05，見圖6)。

2.8 4組大鼠心肌細胞凋亡率比較 正鹽組大鼠心肌細胞凋亡率為0，高鹽組大鼠心肌細胞凋亡率為(29.24±6.03)%，ADSCs組大鼠心肌細胞凋亡率為(14.27±2.61)%，TGF-β1基因沉默組大鼠心肌細胞凋亡率為(5.59±0.73)%。高鹽組、ADSCs組和TGF-β1基因沉默組大鼠心肌細胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計學意義(F=49.12，P<0.01)；其中ADSCs組和TGF-β1基因沉默組大鼠心肌細胞凋亡率低于高鹽組，TGF-β1基因沉默組大鼠心肌細胞凋亡率低于ADSCs組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見圖7)。

注：A為正鹽組，B為高鹽組，C為ADSCs組，D為TGF-β1基因沉默組

圖6 4組大鼠心肌組織中CM-Dil標記的ADSCs(4′，6-二脒基-2苯基吲哚染色，×200)

Figure 6 CM-Dil marked ADSCs of myocardial tissue of the four groups

注：A為正鹽組，B為高鹽組，C為ADSCs組，D為TGF-β1基因沉默組

圖7 4組大鼠心肌細胞凋亡情況(HE染色，×200)

Figure 7 Apoptosis of myocardial cell of the four groups

3 討論

心肌纖維化是諸多心血管疾病的終末期典型癥狀，其能導致心力衰竭、心律失常等，可嚴重威脅患者的生命安全。有臨床研究表明，鹽敏感性高血壓可能導致大鼠心肌纖維化、心功能明顯下降及心肌細胞凋亡增加[23]。心肌纖維化是鹽敏感性高血壓的重要伴隨癥狀，纖維化心肌常伴隨心肌組織炎性反應，而炎性反應被認為是心肌纖維化的始發(fā)環(huán)節(jié)和加劇原因[24-26]。

本研究結果顯示，基因轉染后第3天和第14天空白組和對照組ADSCs TGF-β1蛋白相對表達量間無差異，但TGF-β1siRNA轉染組ADSCs TGF-β1蛋白相對表達量低于空白組和對照組，提示基因轉染后ADSCs TGF-β1表達水平明顯降低，且其低表達水平可持續(xù)14 d。本研究移植TGF-β1基因沉默的ADSCs后，于心肌損傷組織中觀察到較多CM-Dil標記的ADSCs，且TGF-β1基因沉默組大鼠心肌組織TGF-β1mRNA、蛋白相對表達量低于正鹽組、高鹽組及ADSCs組，ADSCs組大鼠心肌組織TGF-β1mRNA、蛋白相對表達量低于正鹽組、高鹽組，高鹽組大鼠心肌組織TGF-β1mRNA、蛋白相對表達量高于正鹽組。提示ADSCs可以靶向性地向鹽敏感性高血壓大鼠心肌損傷部位遷移募集，且成功移植TGF-β1基因沉默的ADSCs。

李謙等[23]研究結果顯示，高鹽飲食可促使鹽敏感性高血壓大鼠心臟射血功能、心肌收縮能力及左心室發(fā)育發(fā)生異常；此外，鹽敏感性高血壓大鼠心肌纖維化嚴重、膠原沉積增加。本研究結果顯示，細胞移植2周后，高鹽組和ADSCs組大鼠LVEF和FS低于正鹽組和TGF-β1基因沉默組，LVMI高于正鹽組和TGF-β1基因沉默組；ADSCs組和TGF-β1基因沉默組大鼠LVEF和FS高于高鹽組，LVMI低于高鹽組；TGF-β1基因沉默組大鼠LVEF和FS高于ADSCs組，LVMI低于ADSCs組；高鹽組、ADSCs組和TGF-β1基因沉默組大鼠膠原容積積分高于正鹽組，ADSCs組和TGF-β1基因沉默組大鼠膠原容積積分低于高鹽組，TGF-β1基因沉默組大鼠膠原容積積分低于ADSCs組；正鹽組大鼠心肌細胞凋亡率為0，ADSCs組和TGF-β1基因沉默組大鼠心肌細胞凋亡率低于高鹽組，TGF-β1基因沉默組大鼠心肌細胞凋亡率低于ADSCs組。提示細胞移植2周后TGF-β1基因沉默ADSCs移植可以有效緩解鹽敏感性高血壓大鼠心肌纖維化、減少心肌細胞凋亡，與諸多研究顯示ADSCs移植能明顯改善心功能、降低心肌損傷相一致[27-30]。有研究顯示，ADSCs移植可有效抑制炎性細胞增殖[31]，降低促炎性細胞合成[32]。本研究HE染色結果顯示，高鹽組大鼠心肌出現(xiàn)明顯纖維化且巨噬細胞浸潤明顯增多，ADSCs組大鼠心肌纖維化較輕，TGF-β1沉默組大鼠心臟纖維化最輕、巨噬細胞浸潤最少，分析原因可能與TGF-β1基因沉默ADSCs移植后心肌纖維化減輕有關，但具體原因有待進一步探討。

綜上所述，基因沉默TGF-β1ADSCs移植能有效減輕鹽敏感性高血壓大鼠心肌纖維化、減少心肌細胞凋亡。

作者貢獻： 方漢軍進行實驗實施、資料收集整理、撰寫論文初稿、成文并對文章負責； 李鋒華、許成輔助實驗實施、 資料收集整理、實驗評估；廉秋芳進行實驗設計、質量控制及審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：謝武英)

Impact of Transplantation of TGF-β1Gene Silencing Adipose-derived Stromal Cells on Myocardial Fibrosis and Apoptosis of Salt-sensitive Hypertensive Rats

FANGHan-jun1，LIFeng-hua1，XUCheng1，LIANQiu-fang2

1.DepartmentofLargeVascularSurgery，XianyangHospitalofYan′anUniversity，Xianyang712000，China2.DepartmentofCardiovascularMedicine，XianyangHospitalofYan′anUniversity，Xianyang712000，ChinaCorrespondingauthor：LIANQiu-fang，E-mail：liupeitjyd@163.com

Objective To investigate the impact of transplantation of TGF-β1gene silencing adipose-derived stromal cells(ADSCs)on myocardial fibrosis and apoptosis of salt-sensitive hypertensive rats.Methods This experiment was completed in the Central Laboratory for Medical Experimental Animals of Shaanxi Province from June 2015 to July 2016.ADSCs was cultured in vitro，mRNA and siRNA expressed plasmids with TGF-β1targeted gene were constructed and infected by virus；the third-generation ADSCs were infected by slow virus and divided into blank group，control group and experiment group(with TGF-β1-siRNA transfection).Western blot method was used to detect the protein expression of TGF-β1of the above three groups after 3 and 14 days of gene transfection.A total of 80 SPF male Dahl salt-sensitive rats were selected to prepare the salt-sensitive hypertensive rats model，and they were divided into A group，B group，C group and D group according to random number table，each of 20 rats.Rats of A group

0.3% NaCl diet，rats of B group received 8% NaCl diet，rats of C group received caudal vein transplantation of ADSCs after 6 weeks of 8% NaCl diet for 3 days，while rats of D group received caudal vein transplantation of TGF-β1gene silencing ADSCs after 6 weeks of 8% NaCl diet for 3 days.After 2 weeks of transplantation，T-PCR was used to detect the mRNA expression of TGF-β1of myocardial tissue，Western Blot method was used to detect the protein expression of TGF-β1of myocardial tissue，ultrasonic cardiogram was used to detect the LVEF and FS，meanwhile LVMI was calculated，VG staining method was used to observe and calculate the collagen volume fraction，HE staining method was used to observe the myocardial cell morphology，CM-Dil marked ADSCs in myocardial tissue was observed by fluorescence microscope，and TUNEL method was used to detect the apoptosis of myocardial cells.Results (1)Fluorescence microscope found that，CM-Dil marked ADSCs were red，and the marking percentage was 97%.(2)No statistically significant differences of relative expression quantity of TGF-β1protein of ADSCs was found between blank group and control after 3 or 14 days of gene transfection(P>0.05)，while relative expression quantity of TGF-β1protein of ADSCs of experiment group was statistically significantly lower than that of blank group and control group，respectively(P<0.05).(3)After 2 weeks of transplantation，relative expression quantity of TGF-β1mRNA and TGF-β1protein of myocardial tissue of D group was statistically significantly lower than that of A group，B group and C group，respectively，relative expression quantity of TGF-β1mRNA and TGF-β1protein of myocardial tissue of C group was statistically significantly lower than that of A group and B group，respectively，while relative expression quantity of TGF-β1mRNA and TGF-β1protein of myocardial tissue of B group was statistically significantly higher than that of A group(P<0.05).(4)After 2 weeks of transplantation，LVEF and FS of B group and C group were statistically significantly lower than those of A group and D group，while LVMI of B group and C group was statistically significantly higher than that of A group and D group，respectively(P<0.05)；LVEF and FS of C group were statistically significantly higher than those of B group，while LVMI of C group was statistically significantly lower than that of control group(P<0.05)；no statistically significant differences of LVEF，F(xiàn)S or LVMI was found between A group and D group(P>0.05).After 2 weeks of transplantation，collagen volume fraction of B group，C group and D group was statistically significantly higher than that of A group，respectively，while collagen volume fraction of C group and D group was statistically significantly lower than that of B group，respectively，collagen volume fraction of D group was statistically significantly lower than that of C group(P<0.05).(6)After 2 weeks of transplantation，HE staining results showed that，myocardial tissue of B group occurred obvious fibrosis and microphages infiltration，myocardial tissue of C group occurred mild fibrosis，while myocardial tissue of C group occurred a little fibrosis and microphages infiltration.(7)After 2 weeks of transplantation，no CM-Dil marked ADSCs of A group or B group was found by fluorescence microscope，while CM-Dil marked ADSCs of D group was statistically significantly more than that of C group(P<0.05).(8)After 2 weeks of transplantation，myocardial cell apoptosis rate of A group was 0，myocardial cell apoptosis rate of C group and D group was statistically significantly lower than that of B group，while myocardial cell apoptosis rate of D group was statistically significantly lower than that of C group(P<0.05).Conclusion Transplantation of TGF-β1gene silencing ADSCs can effectively relive the myocardial fibrosis and reduce the myocardial cell apoptosis of salt-sensitive hypertensive rats.

Hypertension；Rats，inbred Dahl；Adipose derived stem cells；Transforming growth factor beta1；Gene silencing；Myocardium；Fibrosis；Apoptosis

國家自然科學基金資助項目(81660079)：鈉鉀對Dahl鹽敏感大鼠腎髓質PHD2/HIF-1α通路的影響及機制研究；陜西省自然科學基礎研究計劃項目(2016JM8123)：鈉鉀對Dahl大鼠腎髓質HIF輔氨酰羥化酶2的影響及機制研究

廉秋芳，E-mail：liupeitjyd@163.com

R 544.1

A

10.3969/j.issn.1008-5971.2017.02.015

2016-11-06；

2017-02-15)

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1.712000陜西省咸陽市，延安大學咸陽醫(yī)院心臟大血管外科

2.712000陜西省咸陽市，延安大學咸陽醫(yī)院心血管內科