趙 娜，于佳禾，馬志剛，胡 生，查汪藝

(湖北理工學(xué)院 化學(xué)與化工學(xué)院，湖北 黃石 435003)

粒子瀝濾法制備多孔PLLA組織工程支架及降解性能研究

趙 娜，于佳禾，馬志剛，胡 生，查汪藝

(湖北理工學(xué)院 化學(xué)與化工學(xué)院，湖北 黃石 435003)

選用左旋聚乳酸(PLLA)為原料，CHCl3為溶劑，NaCl顆粒為致孔劑制備多孔PLLA支架。通過降解實(shí)驗(yàn)研究了降解過程中支架吸水率、失重率、降解液pH值、拉伸強(qiáng)度和斷裂伸長(zhǎng)率的變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：所制備的支架是互相貫通的多孔結(jié)構(gòu)；隨著降解時(shí)間的增加，支架吸水率和失重率呈現(xiàn)明顯上升趨勢(shì)，降解液pH變化量逐漸上升，斜率基本保持不變，支架的強(qiáng)度和斷裂伸長(zhǎng)率快速衰減，制備的PLLA組織工程支架具有良好的可降解性。

組織工程支架；左旋聚乳酸；多孔；降解

0 引言

組織工程學(xué)的核心是構(gòu)建一個(gè)用生物材料和體內(nèi)細(xì)胞組成的有活力的活體組織，起到對(duì)受損器官的重新建立，并使其恢復(fù)結(jié)構(gòu)功能和原本形態(tài)的作用[1-2]。

組織工程中的支架材料能夠?yàn)榧?xì)胞生長(zhǎng)提供依附，使細(xì)胞或組織的生長(zhǎng)更為便利。細(xì)胞的生長(zhǎng)需要足夠的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和能夠完成代謝的場(chǎng)所，所以組織工程支架需要有相互貫通的多孔結(jié)構(gòu)和適合的力學(xué)性能為細(xì)胞提供支撐和生長(zhǎng)的空間。支架材料在完成修復(fù)和替代體內(nèi)的組織或器官后要可降解，在降解過程中產(chǎn)生的降解產(chǎn)物對(duì)人體無大的影響，生物相容性高[1-3]。

組織工程支架的制備方法有纖維粘接法、溶劑澆鑄/粒子瀝濾法[4]、乳化/冷凍干燥法[5]、燒結(jié)微球法[6]、氣體發(fā)泡法[7]、3D 打印技術(shù)[8-9]、熔融沉積制造技術(shù)[10]等。

本研究選用溶劑澆鑄/粒子瀝濾法制備組織工程支架[4]，此方法簡(jiǎn)單、易操作，能夠制備出孔徑和孔隙率均可控的組織工程支架。該方法是用無機(jī)鹽粒子、冰晶粒、石蠟等不溶于有機(jī)溶劑的顆粒作為致孔劑制備多孔支架，能夠通過改變致孔劑的量調(diào)節(jié)孔隙率，改變致孔劑粒子的尺寸以改變孔隙大小[11]。其缺點(diǎn)是無法控制孔隙形狀，孔隙間的關(guān)聯(lián)性不高。

左旋聚乳酸(PLLA)是一種特殊的具有優(yōu)秀生物相容性和生物降解性的高分子材料，在體液中可以通過酯鍵水解實(shí)現(xiàn)降解，降解產(chǎn)物能被生物體吸收和代謝，最終產(chǎn)物為CO2和H2O。PLLA是被FDA批準(zhǔn)的可用于人體的可降解高分子材料，已被廣泛地應(yīng)用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，如藥物控制釋放系統(tǒng)、骨科內(nèi)固定裝置、細(xì)胞培養(yǎng)和醫(yī)療外科縫合線[12-13]等，是一種制備組織工程支架的理想材料。

本研究選用PLLA為原料，CHCl3為溶劑，NaCl顆粒為致孔劑制備多孔組織工程支架，并詳細(xì)研究其力學(xué)性能和降解性能，為PLLA組織工程支架的應(yīng)用提供部分?jǐn)?shù)據(jù)支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 基本原理

本實(shí)驗(yàn)采用的方法為Mikos等提出的溶劑澆鑄-粒子瀝濾法[4]，溶劑澆鑄與粒子瀝濾結(jié)合可制備出孔徑可控的聚合物支架。首先將PLLA溶于CHCl3中，混入一定量研磨好的NaCl顆粒，待CHCl3揮發(fā)后用水將支架內(nèi)的NaCl固體顆粒溶解出來，原先NaCl顆粒占據(jù)的位置就形成了無規(guī)則的孔隙，從而制備出多孔PLLA支架。

1.2 原料及儀器

1)原料：NaCl(分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；KH2PO3(分析純，天津市廣成化學(xué)試劑有限公司)；Na2HPO3·12H2O(分析純，西隴化工股份有限公司)；PLLA(重均分子量：26萬(wàn)～36萬(wàn))。

2)儀器：掃描電子顯微鏡(SU8000，Hitachi)；微機(jī)控制電子萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)(CMT413，深圳市新三思材料檢測(cè)有限公司)；精密pH計(jì)(PHS-W，上海般特儀器有限公司)；培養(yǎng)箱(PH030A，上海一恒科學(xué)儀器有限公司)。

1.3 支架的制備

稱取PLLA粉末50 g，稱取并研磨NaCl顆粒10 g，充分混合。加入CHCl3溶劑200 mL，充分?jǐn)嚢枋蛊淙芙庑纬烧吵硪后w。將液體倒入玻璃模具中，室溫晾置24 h使表面CHCl3完全揮發(fā)。將支架固體裁成1 cm寬的條狀，放入干燥箱內(nèi)1 d，在65 ℃下干燥去除殘留CHCl3溶劑。取出干燥后的支架，浸泡于蒸餾水中去除支架內(nèi)的NaCl顆粒，在此過程中每6 h換1次蒸餾水，持續(xù)24 h。再將支架進(jìn)行干燥完全去除支架內(nèi)的水分。

1.4 支架的染色觀察

將實(shí)驗(yàn)制備的支架樣品做好標(biāo)記，放入充滿染色劑的燒杯中，使樣品完全浸泡在染色劑中。將玻璃杯密封，使支架在溶液中浸泡24 h后，取出支架，室溫下干燥，將支架切開觀察支架中心是否被染色，以此來確定支架內(nèi)微孔的連通性。

1.5 支架的微觀形貌分析

用液氮冷卻支架樣品，淬斷，用掃描電鏡(SEM)觀察樣品淬斷面的微觀形貌。

1.6 支架的降解

將1.65 g KH2PO3和19.53 g Na2HPO3·12H2O溶解在1 000 mL水中配置成pH值為7.4的磷酸鹽緩沖溶液。

將制備好的組織工程支架裁剪成寬度為1 cm、長(zhǎng)度為8 cm左右的支架樣本36份，全部稱重(Wb)，分裝在12個(gè)降解瓶?jī)?nèi)，加入配置好的降解液，放入培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)箱溫度設(shè)置為70 ℃。每過24 h取出1個(gè)降解瓶，將支架樣品取出，擦干表面的水分，稱重(Ww)，再放入干燥箱內(nèi)干燥，完全干燥后再稱重(Wd)。

按公式(1)計(jì)算吸水率(Wm)：

Wm=(Ww-Wd)/Wb×100%

(1)

按公式(2)計(jì)算失重率(Wl)：

Wl=(Wb-Wd)/Wb×100%

(2)

1.7 拉伸強(qiáng)度的測(cè)定

用電子游標(biāo)卡尺測(cè)量樣品的寬度和厚度，用電子萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)測(cè)試支架材料的拉伸強(qiáng)度和斷裂伸長(zhǎng)率，平行測(cè)3次，3次數(shù)據(jù)進(jìn)行算術(shù)平均。實(shí)驗(yàn)拉伸速率均為 2.0 mm/min。

按公式(3)計(jì)算拉伸強(qiáng)度：

б=F/A0

(3)

其中б為拉伸強(qiáng)度(MPa)；A0為初始橫截面積(m2)；F為拉伸力(N)。

斷裂伸長(zhǎng)率的計(jì)算公式為：

ε=△L/L

(4)

其中△L=L-L0；L為樣品斷裂時(shí)的長(zhǎng)度；L0是原始長(zhǎng)度。

2 結(jié)果與討論

本研究用NaCl做致孔劑制備PLLA組織工程支架，研究支架的內(nèi)部形貌、力學(xué)性能和降解性能，探究降解時(shí)間對(duì)支架的影響。

2.1 多孔PLLA組織工程支架的表面形貌分析

通過溶劑澆鑄-粒子瀝濾法可以制備出具有一定厚度的多孔PLLA組織工程支架，PLLA多孔支架如圖1所示。將制備的多孔PLLA組織工程支架在染色劑下染色，染色后的支架內(nèi)部形貌如圖2所示，切開樣品，晾干后肉眼觀察支架內(nèi)部的染色情況。

由圖2可以看出，支架內(nèi)部存在不規(guī)則的孔隙，這是由于NaCl顆粒被蒸餾水溶解之后所形成，且已經(jīng)均勻地染色，說明染色劑可以從支架表面進(jìn)入內(nèi)部，證明所制備的支架是三維貫通的多孔結(jié)構(gòu)[14]。支架斷面的掃描電鏡照片如圖3所示，從圖3中可以看出，支架內(nèi)部存在很多大小不一的孔洞，大孔洞內(nèi)壁還存在很多更小的孔洞，說明所制備的支架是三維多孔結(jié)構(gòu)。但是孔洞結(jié)構(gòu)在支架中分布不均勻，且孔徑差別較大，在將來的研究中需要調(diào)整實(shí)驗(yàn)條件，獲得孔洞結(jié)構(gòu)分布更均勻的支架。從圖3中還可以看到少量顆粒狀物質(zhì)，可能是未完全溶出的NaCl顆粒。

2.2 支架降解性能考察

將降解一定時(shí)間的樣品支架從降解瓶中取出，用濾紙輕輕擦去支架表面的降解液，分別稱取質(zhì)量，然后放入真空烘箱干燥24 h后取出，測(cè)其質(zhì)量并按照公式(1)計(jì)算吸水率，降解過程中平均吸水率的變化曲線如圖4所示。

由圖4可知，吸水率隨降解時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。這是由于隨著降解的進(jìn)行，PLLA分子鏈發(fā)生斷裂后降解為分子量更小的分子，降解過程是由PLLA中酯鍵的水解引起的，而酯鍵水解將產(chǎn)生羧基和羥基，造成降解產(chǎn)物的親水性增加，因而吸水率增加。隨著降解進(jìn)行，更多的酯鍵水解，降解產(chǎn)物會(huì)吸收越來越多的降解液，因而吸水率迅速增加。

測(cè)量降解前后樣品的質(zhì)量，按照公式(2)計(jì)算失重率，降解過程中平均失重率的變化曲線如圖5所示。

由圖5可知，失重率隨著降解過程的進(jìn)行迅速增大，這是由于支架中存在孔隙，使降解液很容易滲入，導(dǎo)致降解過程在支架內(nèi)部和表面同時(shí)進(jìn)行。當(dāng)降解較長(zhǎng)時(shí)間以后，降解產(chǎn)物分子量已很小，當(dāng)小到可以溶于水時(shí)，低分子量降解產(chǎn)物就會(huì)溶解進(jìn)入降解液中，支架就會(huì)出現(xiàn)質(zhì)量的降低。降解時(shí)間越長(zhǎng)，低分子量的降解產(chǎn)物含量越大，因而支架質(zhì)量越小，使得支架的失重率逐漸增加。

隨著降解的進(jìn)行，越來越多的酸性降解產(chǎn)物溶解在降解液中，會(huì)對(duì)降解液的pH值產(chǎn)生影響，可以通過測(cè)定降解前后降解液的pH值來考察降解液的pH值變化。將降解前降解液的pH值減去降解后降解液的pH值，可得降解液pH值的變化量，降解過程中降解液pH變化曲線如圖6所示。

由圖6可知，隨著降解時(shí)間的增加，降解前后降解液pH值的變化量越來越大。這是由于PLLA降解產(chǎn)生的小分子降解產(chǎn)物乳酸及其不同聚合度的低分子量聚乳酸溶解在降解液之中，使得降解液的pH值不斷下降。隨著降解時(shí)間延長(zhǎng)，降解產(chǎn)物中乳酸的含量逐漸增加，因而降解液的pH值逐漸下降。

由于實(shí)驗(yàn)時(shí)間限制，本次降解實(shí)驗(yàn)選擇在70 ℃進(jìn)行，這樣可以在較短時(shí)間內(nèi)觀察到樣品各種性能的變化。但是預(yù)計(jì)結(jié)果和在37 ℃進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的降解相比是不同的。因?yàn)樵谳^高溫度下短時(shí)間內(nèi)降解，低分子量的酸性降解產(chǎn)物可能沒有足夠的時(shí)間從材料內(nèi)部擴(kuò)散進(jìn)入降解液，從而導(dǎo)致降解液的酸性上升程度會(huì)低于在37 ℃進(jìn)行的長(zhǎng)時(shí)間降解。

將降解后的支架利用萬(wàn)能力學(xué)試驗(yàn)機(jī)進(jìn)行拉伸性能的測(cè)試，由于降解時(shí)間超過3 d的樣品十分脆弱，已無法進(jìn)行拉伸強(qiáng)度測(cè)試，所以本次實(shí)驗(yàn)只選取降解前3 d的樣品進(jìn)行拉伸強(qiáng)度的測(cè)定。

PLLA組織工程支架的原始拉伸力學(xué)性能曲線如圖7所示。從圖7中可以看出，支架的斷裂為脆性斷裂，表明PLLA組織工程支架是脆性材料，這是因?yàn)镻LLA材料本身屬于脆性材料，而且組織工程支架內(nèi)部充滿大小不同的孔隙，受力時(shí)，這些孔隙較薄弱，支架的斷裂容易從此處開始。

用公式(3)計(jì)算拉伸強(qiáng)度，降解過程中拉伸強(qiáng)度的變化如圖8所示。

由圖8可知，隨著降解時(shí)間的增加，支架的拉伸強(qiáng)度急劇下降，這是由于隨著降解時(shí)間的增加，PLLA分子量降低，且降解過程使支架表面和內(nèi)部出現(xiàn)更多的缺陷，導(dǎo)致樣品強(qiáng)度下降。

用公式(4)計(jì)算斷裂伸長(zhǎng)率，斷裂伸長(zhǎng)率可反映支架的韌性好壞，一般來說，斷裂伸長(zhǎng)率越高，材料韌性越好。降解過程中斷裂伸長(zhǎng)率的變化曲線如圖9所示。

由圖9可知，隨著降解時(shí)間的增加，支架的斷裂伸長(zhǎng)率急劇下降，說明支架韌性越來越低。這同樣是由降解過程中支架的分子量下降和缺陷的產(chǎn)生所造成。

綜合以上數(shù)據(jù)可知本實(shí)驗(yàn)所制備的多孔PLLA組織工程支架具有良好的可降解性，可以滿足組織工程支架的初步要求。

3 結(jié)論

本研究使用粒子瀝濾法制備多孔PLLA組織工程支架，對(duì)制備好的支架進(jìn)行表面形貌的觀察并進(jìn)行降解實(shí)驗(yàn)，考察了降解過程中樣品的吸水率、失重率、拉伸強(qiáng)度和降解液pH值的變化，得到的主要結(jié)論總結(jié)如下：

根據(jù)支架外貌和在顯微鏡下的觀察可以看出，支架內(nèi)部存在很多無規(guī)則的孔隙，這是NaCl顆粒溶解之后形成的，證明制備的支架為多孔結(jié)構(gòu)。從染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果中看出染色劑可以進(jìn)入支架內(nèi)部，證明支架的孔洞結(jié)構(gòu)是互相貫通的。

經(jīng)過12 d在70 ℃溫度下的降解實(shí)驗(yàn)，可以得到以下結(jié)論：

1)支架的吸水率隨降解時(shí)間的增加呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。

2)隨著降解時(shí)間的延長(zhǎng)，越來越多的低分子降解產(chǎn)物溶解進(jìn)入降解液，因此支架失重率呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，降解液的pH值不斷下降。

對(duì)降解不同時(shí)間的樣品進(jìn)行了力學(xué)性能測(cè)試，得到的主要結(jié)論如下：

1)隨著降解時(shí)間的增加，PLLA分子量變小，缺陷增多，因而拉伸強(qiáng)度急劇下降。

2)降解后材料變脆，支架的韌性呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)。

綜上所述，本研究制備的多孔PLLA組織工程支架孔洞互相貫通，具有良好的可降解性，可為PLLA組織工程支架更好的應(yīng)用提供部分?jǐn)?shù)據(jù)支持。

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(責(zé)任編輯 高 嵩)

Preparation of Porous PLLA Scaffolds Using Particle-leaching Method and Study on Degradation Properties

ZhaoNa,YuJiahe,MaZhigang,HuSheng,ZhaWangyi

(School of Chemistry and Chemical Engineering,Hubei Polytechnic University,Huangshi Hubei 435003)

In this paper,PolyL-lactic acid (PLLA) was chosen as the raw material,CHCl3as solvent,sodium chloride particles as pore forming agent to prepare porous PLLA scaffolds.The water absorption,weight loss rate,pH value,tensile strength and elongation at break of tissue engineering scaffold during degradation were studied by degradation experiments.The experimental results showed that the prepared scaffolds were interpenetrating porous structure,along with the increase in degradation time,both water absorption and weight loss rate showed a clear upward trend,which showed that the scaffold was obviously degraded in the degradation solution.The pH value of the degradation solution increased steadily and the gradient stayed the same.The strength and the breaking elongation of the scaffold rapidly decreased as the degradation process was carried out.The PLLA tissue engineering scaffolds had good biodegradability.

tissue engineering scaffold;PLLA;porous;degradation

2016-10-13

湖北省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：2012FFC020)；湖北理工學(xué)院校級(jí)科學(xué)研究項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：11yjz03R)；湖北省教育廳科研計(jì)劃指導(dǎo)性項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)；B20123004)。

趙娜，副教授，博士，研究方向：生物可降解醫(yī)用高分子材料。

10.3969/j.issn.2095-4565.2017.02.007

O631.2+2

A

2095-4565(2017)02-0028-05