趙小明 薛新宏 曹曉強 張會文 李軍 蘇立新 王振旺

·論著·

Ang-2及其受體Tie-2在骨肉瘤中的表達

趙小明 薛新宏 曹曉強 張會文 李軍 蘇立新 王振旺

目的 研究Ang-2及其受體Tie-2在骨肉瘤的表達情況。方法 選取唐山市第二醫(yī)院2009年1月至2011年1月手術切除的69例骨肉瘤標本做為病例組。另取12例正常骨組織標本做對照組。采用RT-PCR法檢測Ang-2及其受體Tie-2的表達水平。結果 骨肉瘤組Ang-2表達水平顯著高于對照組(P<0.05)；骨肉瘤組Ang-2mRNA表達與Tie-2mRNA表達正相關(r=0.447，P<0.01)。結論Ang-2及其受體Tie-2參與了骨肉瘤的血管生成及調控，在骨肉瘤的發(fā)展中起著重要的作用。

骨肉瘤；血管生成素-2；血管生成素-2受體

骨肉瘤發(fā)病率居惡性骨腫瘤首位，出現(xiàn)血運轉移較早。在很多人類惡性腫瘤的組織、體液、血液中發(fā)現(xiàn)Ang2表達水平均上調，與惡性腫瘤的血管密度呈正相關[1]。本研究對69例骨肉瘤患者、12例對照組和骨肉瘤細胞株MG63的表達情況，研究Ang-2和其受體Tie-2在骨肉瘤血管生成中的作用，以期為骨肉瘤發(fā)病機制研究、患者預后預測提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 病例采集唐山市第二醫(yī)院2009年1月至2011年1月臨床手術切除的69例骨肉瘤標本(OS組)。另取同期正常骨組織標本12例做對照(對照組)。Ang-2及其受體Tie-2的表達水平采用RT-PCR和Westernblot法檢，；分析OS患者、正常對照組以及MG63細胞株中Ang-2表達與Tie-2的相關性。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞復蘇及培養(yǎng):從液氮罐中取出安瓿并盡快解凍，放入盛有37℃水的搪瓷罐中約2～3min；取出安瓿于操作臺用吸管吸出細胞懸液，移入離心管中。小心吹打使細胞懸浮，并觀察細胞培養(yǎng)情況；采用低速離心處理，再重復用培養(yǎng)液漂洗、離心，最后置37℃溫箱培養(yǎng)，第2天更換1次培養(yǎng)液，再繼續(xù)觀察培養(yǎng)。從培養(yǎng)基選取一瓶生長良好的MG63細胞，進入傳代培養(yǎng)。先用Hank’s液洗1次；0.25%胰蛋白酶液消化液

需要從側方加入，使細胞浸沒在消化液中約1min左右；翻轉培養(yǎng)瓶觀察5～10min，細胞面如果出現(xiàn)了布紋孔狀現(xiàn)象，則倒出消化液，加入一些新配制的細胞培養(yǎng)液，用吸管小心吹打數(shù)次，使細胞均勻分散開，按1∶3分配傳代培養(yǎng)。

1.2.2RNA提取、RT-PCR及免疫蛋白印跡分析:RNA提取按Invitrogen公司的說明書利用Trizol進行RNA的提取，逆轉錄合成cDNA，然后應用PCR擴增及檢測，Westernblot法做免疫蛋白印跡分析

1.3 統(tǒng)計學分析 應用SPSS11.5統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料的檢驗采用χ2檢驗，計量資料采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1Ang-2mRNA的表達 人骨肉瘤細胞系MG63高表達Ang-2mRNA(0.37±0.05)。骨肉瘤患者中Ang-2陽性率為81.2%，對照組陽性率為16.7%，兩組Ang-2陽性率差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；骨肉瘤組Ang-2mRNA表達水平明顯高于對照組(0.35±0.12vs0.05±0.02，P<0.05)。見表1。

2.2Ang-2蛋白的表達 人骨肉瘤細胞系MG63中Ang-2蛋白顯示高表達；對照組未檢測到表達；骨肉瘤患者中，Ang-2蛋白的陽性率和表達量明顯高于對照組(P<0.01)。見表1。

表1 Ang-2在骨肉瘤患者和對照組表達情況

注: 與對照組比較，*P<0.05

2.3 骨肉瘤中Ang-2與Tie-2表達的關系 在56例Ang-2mRNA陽性標本中，有49例Tie-2mRNA表達陽性；在13例Ang-2陰性標本中，有7例Tie-2mRNA表達陰性，對所得數(shù)據(jù)進行相關分析證實：Ang-2、Tie-2mRNA表達呈正相關(r=0.447，P<0.01)。見表2。

表2 骨肉瘤中Ang-2與Tie-2表達的關系 例(%)

3 討論

骨肉瘤是一種好發(fā)于青少年的惡性腫瘤，起源于間葉組織。它具有富含血管，腫瘤生長迅速、早期易發(fā)生血行轉移的特點，因此成為腫瘤血管方面研究的重要對象[2-5]。而腫瘤的生長、浸潤和轉移依賴于血管生成[6]，骨肉瘤目前治療是以擴大或根治性的截肢術為主要手段，術后輔以化療。盡管近年來手術治療方式和化療藥物應用已取得重大進展[7,8]，但骨肉瘤易發(fā)生多藥耐藥現(xiàn)象，其5 年生存率并沒有取得明顯提高[9]。因此，深入骨肉瘤分子機制研究，尋找新的治療靶點，已成為臨床亟待解決的問題。

骨肉瘤的分子機制復雜，尚有諸多機制不清楚。血管新生受多種因素調控，其中Ang-2 的表達與腫瘤進展、生長和侵襲、轉移有密切聯(lián)系[10,12]，在血管肉瘤、膠質瘤、胃癌、乳腺癌等研究中發(fā)現(xiàn)Ang-2高表達[13,14]，確立了Ang-2 在腫瘤發(fā)展和臨床結局中的預測價值。目前在對肺癌、腎癌等實體瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，Ang-2 可促進腫瘤細胞分泌VEGF，同樣VEGF也可以促進Ang-2的分泌，Ang-2與VEGF聯(lián)合作用可以使新生血管長度和增生范圍增大[15,16]。

本研究對69例骨肉瘤患者、人骨肉瘤細胞系MG63和12例對照組Ang-2 表達水平進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)骨肉瘤患者和人骨肉瘤細胞系MG63的Ang-2表達量明顯高于對照組，提示Ang-2表達與骨肉瘤密切相關；可能參與骨肉瘤患者腫瘤骨組織血管新生過程，Ang-2可能通過離斷血管外周細胞，使其呈稀薄、有漏洞的形態(tài)，阻止血管進一步分化成熟，促進腫瘤血管生成和腫瘤生長。

Tie-2是Ang-2的膜受體；其表達水平間接反應Ang-2作用方式。本研究結果顯示，Tie-2與Ang-2在骨肉瘤腫瘤骨組織中表達呈正相關，提示Tie-2與Ang-2可能協(xié)同參與了骨肉瘤血管生成過程。由于Ang-2即可由腫瘤細胞分泌，也可由內皮細胞產生，而腫瘤骨組織同時高表達Tie-2，提示腫瘤骨組織可能同時存有Ang-2/Tie-2的自分泌和旁分泌系統(tǒng)；其介導的跨膜信號轉導可能正是Ang-2誘導腫瘤性血管形成、參與骨肉瘤發(fā)病過程的重要途徑[17]，Tie-2是Ang-2的檢測將為骨肉瘤的發(fā)病機制研究、患者預后預測提供較好的理論依據(jù)。

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10.3969/j.issn.1002-7386.2017.08.037

063000 河北省唐山市第二醫(yī)院(趙小明、曹曉強、張會文、李軍、蘇立新、王振旺)；華北理工大學附屬醫(yī)院(薛新宏)

薛新宏，063000 華北理工大學附屬醫(yī)院；

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1002-7386(2017)08-1246-02

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