吳軍 尚瑞

·論著·

龍膽水提物對急性胰腺炎大鼠肝損傷的保護作用及機制研究

吳軍 尚瑞

目的 探討龍膽水提物對急性胰腺炎(AP)大鼠肝損傷的保護作用及機制。方法 SD大鼠40只隨機分為正常組(n=8)與模型組(n=32)，模型組采用經(jīng)十二指腸乳頭逆行膽胰管注射5%牛黃膽酸鈉方法制備AP大鼠模型，造模后大鼠分為4個亞組：模型對照組(n=8)、龍膽水提物12mg/kg組(n=8)、24mg/kg組(n=8)、48mg/kg組(n=8)，龍膽水提物低、中、高劑量組每天分別灌胃給予龍膽水提物12mg/kg,24mg/kg及48mg/kg,正常組和模型對照組給予等體積的0.9%氯化鈉溶液，連續(xù)給藥1周，1次/d。給藥結(jié)束后頸總動脈取血，分離血清，檢測血清ALT、AST、AMY、IL-6、TNF-α水平，大鼠脫頸椎處死后剪取肝右葉1/2,于4%中性甲醛固定,HE染色觀察肝臟結(jié)構(gòu)變化，westernblot檢測肝臟組織NF-κβ及I-κB表達水平。結(jié)果 與模型對照組比較，龍膽水提物24mg/kg及48mg/kg組血清ALT、AST、AMY水平及IL-6及TNF-α表達水平顯著降低(P<0.01)；肝組織NF-κβ蛋白表達水平顯著降低(P<0.01)，I-κB蛋白表達水平顯著升高(P<0.01)。結(jié)論 龍膽水提物能夠顯著改善AP導(dǎo)致的肝損傷。

龍膽水提物；急性胰腺炎；肝損傷；NF-κβ；I-κB

急性胰腺炎(AP)是臨床常見的急腹癥之一，根據(jù)患者病情,可分為輕癥胰腺炎和重癥胰腺炎，輕癥胰腺炎多數(shù)病程較輕，發(fā)病較緩，可自愈，急重癥胰腺炎(ASP)常伴有胰外臟器損傷，其特點為胰腺實質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)壞死、出血、發(fā)病急、進展快、死亡率高[1]。其中，以AP伴有肝功能不全或肝腎功能不全患者死亡率最高[2]。AP伴有肝損傷的主要表現(xiàn)在血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)及淀粉酶(AMY)水平升高[3]，此外，有研究發(fā)現(xiàn)白細胞介素6(IL-6)及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)表達水平與ASP伴有肝損傷的疾病進程具有相關(guān)性[4,5]。龍膽水提物的主要成分為龍膽苦苷，龍膽苦苷具有明顯的肝臟保護、抗炎、抗病原微生物、中樞興奮及健胃利膽等作用。多項研究表明，龍膽苦苷對各種急慢性肝損傷均有明顯的保護作用。本研究通過觀察龍膽水提物對AP并發(fā)肝損傷模型肝損傷大鼠相關(guān)指標的影響，探討龍膽水提物對AP大鼠肝損傷的保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級大鼠40只，雄性，體重250～300 g (武漢大學(xué)實驗動物中心提供)，許可證號：SCXK(鄂)2014-1254。

1.2 藥物 龍膽(批號：160307812)，購于康源藥業(yè)股份有限公司，由湖北中醫(yī)學(xué)院李明副教授鑒定為龍膽科植物龍膽正品(Gentianascabra Bunge)。

1.3 試劑及儀器 牛橫膽酸鈉(美國sigma公司，批號：160125)；ALT、AST、AMY、IL-6、TNF-α試劑盒均購自南京建成生物工程有限公司，批號分別為20160520、20160625、20160515、20160605、20160320;兔抗大鼠NF-κβ多克隆抗體、兔抗大鼠I-κB多克隆抗體及兔抗大鼠GAPDH多克隆抗體均購自美國sigma公司，批號分別為160302、160521、160425；KDC-220HR高速冷凍離心機(科大創(chuàng)新股份有限公司);多功能酶標儀(美國鉑金埃爾默有限公司);Forma -85℃冰箱(美國Thermo公司);靜脈微量注射泵(浙大醫(yī)學(xué)儀器廠)。

1.4 方法

1.4.1 龍膽水提物制備:稱取龍膽2 kg，加10倍體積水浸泡12 h后回流提取3次，每次2.5 h，提取液靜止12 h后合并上清液，濃縮至8 g/ml,4℃冷藏保存,使用前稀釋至所需濃度，并于室溫放置2 h。

1.4.2 AP大鼠模型制備:40只SD大鼠隨機分為2組：正常組(n=8)和模型組(n=32)，模型組大鼠禁食不禁水12h后，10%水合氯醛(0.35g/kg)腹腔麻醉大鼠后固定，沿上腹正中線切口，暴露十二指腸及胰膽管，動脈夾夾閉近肝門處胰膽管，24號套管針經(jīng)十二指腸乳頭對側(cè)穿刺胰膽管，動脈夾固定針頭后，微量注射泵連接針頭，以0.1ml/min速度注射5%牛磺膽酸鈉(0.1ml/100g),注射完5min后,松開動脈夾,還納十二指腸，關(guān)腹,最后皮下注射0.9%氯化鈉溶液。

1.4.3 分組及給藥:取模型大鼠32只分為4組，每組8只。分別為模型對照組(n=8)，龍膽水提物低、中、高劑量組，龍膽水提物低、中、高劑量組每天分別灌胃給予龍膽水提物12mg/kg、24mg/kg及48mg/kg,正常組和模型對照組給予等體積的0.9%氯化鈉溶液,連續(xù)給藥1周，1次/d。

1.4.4 樣品收集與處理:于給藥結(jié)束后頸總動脈取血，4℃,3 000r/min離心分離血清，試劑盒檢測ALT、AST、AMY水平，酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)檢測血清IL-6、TNF-α水平,脫頸椎處死后剪取肝右葉1/2,于4%中性甲醛固定,用于HE染色,另外1/2用于westernblot檢測肝臟組織NF-κβ及I-κB表達水平。所有操作均按試劑盒說明進行。

2 結(jié)果

2.1AP大鼠血清ALT、AST、AMY水平變化 與正常組比較，模型對照組ALT、AST、AMY水平顯著升高(P<0.01)，與模型對照組比較，龍膽水提物12 mg/kg、24 mg/kg及48 mg/kg組ALT、AST水平顯著降低(P<0.05)；龍膽水提物24 mg/kg及48 mg/kg組AMY水平顯著降低(P<0.01)，提示低、中、高劑量龍膽水提物均能改善AP大鼠血清ALT和AST水平，中、高劑量組龍膽水提物能改善AP大鼠血清AMY水平。見表1。

組別ALTASTAMY正常組89.12±15.3197.62±19.011055.21±103.27模型對照組281.42±36.71*334.17±44.85*3948.43±297.65*龍膽水提物12mg/kg組221.34±27.65#279±34.69#3411.90±243.00龍膽水提物24mg/kg組174.69±23.47△205.25±31.47△2365.42±189.32△龍膽水提物48mg/kg組137.22±19.63△167.33±45.16△1769.51±137.94△

注: 與正常組比較，*P<0.01;與模型對照組比較,#P<0.05,△P<0.01

2.2AP大鼠血清IL-6及TNF-α表達水平變化 與正常組比較，模型對照組IL-6及TNF-α表達水平顯著升高(P<0.01)，與模型對照組比較，龍膽水提物12mg/kg、24mg/kg及48mg/kg組IL-6及TNF-α表達水平顯著降低(P<0.05)；提示低、中、高劑量龍膽水提物均能改善急性胰腺炎大鼠血清IL-6及TNF-α表達水平。見表2。

組別IL-6(pg/ml)TNF-α(ng/ml)正常組101.32±15.171.22±0.14模型對照組316.29±42.76*3.05±0.72*龍膽水提物12mg/kg組247.35±32.65#2.18±0.69#龍膽水提物24mg/kg組209.04±25.74△1.92±0.57△龍膽水提物48mg/kg組182.49±21.06△1.55±0.39△

注: 與正常組比較，*P<0.01;與模型對照組比較,#P<0.05,△P<0.01

2.3 5組大鼠肝組織病理變化 正常組大鼠肝組織可見結(jié)構(gòu)正常，細胞排列整齊，無空泡、出血、壞死及滲出浸潤；模型對照組可見大量空泡，細胞排列紊亂，邊界模糊不清，可見多數(shù)壞死細胞，充血及滲出浸潤。與模型對照組比較,圖龍膽水提物12mg/kg組，龍膽水提物24mg/kg組及龍膽水提物48mg/kg組。大鼠空泡及壞死均依次減少，細胞排列依次變整齊，邊界逐漸清晰，滲出及浸潤明顯減少，龍膽水提物48mg/kg組最接近于正常組肝組織結(jié)構(gòu)。見圖1。

圖1 5組大鼠肝組織病理變化

注:A:正常組;B:模型對照組;C:龍膽水提物12mg/kg組;D:龍膽水提物24mg/kg組;E:龍膽水提物48mg/kg組

2.4AP大鼠肝組織NF-κβ及I-κB蛋白表達水平 與正常組比較，模型對照組NF-κβ表達水平顯著升高(P<0.01)，與模型對照組比較，龍膽水提物24mg/kg及48mg/kg組NF-κβ表達水平顯著降低(P<0.01)；與正常組比較，模型對照組I-κB表達水平顯著降低(P<0.01)，與模型對照組比較，龍膽水提物12mg/kg組、4mg/kg及48mg/kg組I-κB表達水平顯著升高(P<0.05)。提示龍膽水提物可以改善急性胰腺炎大鼠肝組織NF-κβ及I-κB蛋白表達水平。見圖2。

圖2 5組大鼠肝組織NF-κβ及I-κB蛋白表達水平(n=8)

3 討論

AP是臨床常見的急腹癥之一，根據(jù)患者病情,可分為輕癥胰腺炎和重癥胰腺炎，輕癥胰腺炎多數(shù)病程較輕，發(fā)病較緩，可自愈，ASP常伴有胰外臟器損傷，其特點為胰腺實質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)壞死、出血、發(fā)病急、進展快、死亡率高[1]。

研究發(fā)現(xiàn)，并發(fā)肝損害及肝腎功能損害是導(dǎo)致ASP患者死亡的主要原因[2]。ASP患者出現(xiàn)肝損傷主要表現(xiàn)在血清AST、ALT及AMY升高；組織病理學(xué)改變主要為肝細胞出現(xiàn)空泡，充血，腫脹，壞死及滲出浸潤[6-8]。本研究結(jié)果顯示與模型對照組比較，龍膽水提物12mg/kg、24mg/kg及48mg/kg組ALT、AST水平顯著降低(P<0.05)；龍膽水提物24mg/kg及48mg/kg組AMY水平顯著降低(P<0.01)，提示低、中、高劑量龍膽水提物均能改善AP大鼠血清ALT和AST水平，龍膽水提物中、高劑量組龍膽水提物能改善AP大鼠血清AMY水平。

有文獻研究表明，肝損害并發(fā)后，可進一步加重AP的病情，炎癥的增加又反過來增加肝臟的負擔，使肝損害程度加重，IL-6 是炎癥急性反應(yīng)期的介質(zhì)，是AP判斷的重要指標[9]。TNF-α是發(fā)生滲透浸潤時白細胞產(chǎn)生的，TNF-α的大量釋放是導(dǎo)致AP的主要原因。本研究結(jié)果顯示與模型對照組比較，龍膽水提物12mg/kg、24mg/kg及48mg/kg組IL-6及TNF-α表達水平顯著降低(P<0.05)；提示低、中、高劑量龍膽水提物均能改善AP大鼠血清IL-6及TNF-α表達水平；肝病理組織學(xué)結(jié)構(gòu)顯示與模型對照組比較,龍膽水提物12mg/kg、24mg/kg組及48mg/kg大鼠空泡及壞死均依次減少，細胞排列依次變整齊，邊界逐漸清晰，滲出及浸潤明顯減少，龍膽水提物48mg/kg組最接近于正常組肝組織結(jié)構(gòu)。提示龍膽水提物12mg/kg、24mg/kg及48mg/kg均能減輕AP并發(fā)肝損傷大鼠炎性反應(yīng)。

很多研究認為NF-κβ的激活是炎性反應(yīng)中的關(guān)鍵，抑制NF-κβ的激活可以顯著減輕肝損傷的程度[10,11]，NF-κβ的激活受到I-κB的調(diào)節(jié)，本研究結(jié)果顯示，與模型對照組比較，龍膽水提物24mg/kg及48mg/kg組NF-κβ表達水平顯著降低(P<0.01)，龍膽水提物12mg/kg組、4mg/kg及48mg/kg組I-κB表達水平顯著升高(P<0.05)，提示龍膽水提物對AP導(dǎo)致的肝損傷的保護作用機制可能是通過I-κB/NF-κβ通路來實現(xiàn)的。

綜上所述，龍膽水提物可明顯改善由急性胰腺炎引起的肝損傷，其機制可能是是通過I-κB/NF-κβ通路來實現(xiàn)的。

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11WuYJ，LingQ，ZhouXH，etal.Urinarytrypsininhibitorattenuateshepaticischemia-reperfusioninjurybyreducingnuclearfactor-kappaBactivation.HepatohibitorPancreatDisInt,2009,8:53-58.

Protective effect and action mechanism of water extract of gentian on liver damage of rats with acute pancreatitis

WUJun,SHANGRui.

DepartmentofDigestiveSystemDiseases,People'sHospitalAffiliatedtoHubeiMedicineCollege,Hubei,Shiyan442000,China

Objective To investigate the protective effect and action mechanism of water extract of gentian on liver damage of rats with acute pancreatitis (AP).Methods Forty SD rats were randomly divided into normal control group (n=8)andmodelgroup(n=32).TheanimalmodelswithAPwereestablishedbyinjecting5%cow-bezoarsodiumcholatethroughtheduodenopapillaryretrogradecholangiopancreaticduct.Aftermodeling,theratswereredividedintofoursubgroups:modelcontrolgroup,low-dosegroup(waterextractofgentian12mg/kg),median-dosegroup(24mg/kg)andhigh-dosegroup(48mg/kg),with8ratsineachgroup.Theratsinlow-dose,median-doseandhigh-dosegroupsweregivenwaterextractofgentiane12mg/kg,24mg/kg,48mg/kg,respectivelybygavage,however,theratsinnormalcontrolgroupandmodelcontrolgroupweregivenequalvolumeof0.9%sodiumchloridesolution,onceadayfor1week.Afteradministration,theserumlevelsofALT,AST,AMY,IL-6andTNF-αweredetected.Moreovertheratsweresacrificedandliverspecimensweretakenout,thechangesofliverstructurewereobservedbyHEstaining,andtheexpressionlevelsofNF-κBandI-κBinlivertissueweredetectedbyWesternBlot.Results As compared with those in model control group, the serum levels of ALT,AST,AMY, IL-6,TNF-α in median-dose group and high-dose group were significantly decreased (P<0.01),andtheexpressionlevelsofNF-κβproteinwereobviouslydecreasedtoo(P<0.01),however,theexpressionlevelsofI-κBproteinweresignificantlyincreased(P<0.01).Conclusion The water extract of gentian can obviously improve the liver damage caused by acute pancreatitis in rats.

water extract of gentian; acute pancreatitis; liver damage; NF-κβ; I-κB

10.3969/j.issn.1002-7386.2017.08.005

442000 湖北省十堰市，湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院消化內(nèi)科

尚瑞，442000 湖北省十堰市，湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院消化內(nèi)科；

E-mail：shangree@126.com

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1002-7386(2017)08-1141-04

2016-08-21)