池福敏 水雨航 江帆 劉柳 辜雪冬 +羅章

摘要：采用堿性蛋白酶水解藏雞蛋卵白蛋白，制備抗氧化活性肽，以水解度和超氧陰離子自由基（O-2[KG-*2]· [KG-*3]）清除率為指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定最佳酶解參數(shù)，并對(duì)酶解多肽的體外抗氧化活性進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明：堿性蛋白酶酶解的最適條件為底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%、酶解時(shí)間5 h、酶添加量7 000 U/g；在最適條件下，堿性蛋白酶酶解所得抗氧化肽的O-2[KG-*2]· [KG-*3]、DPPH自由基、羥基自由基（·OH）清除率分別為71.75%、56.47%、84.46%；還原力、抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力分別為0.87、82.83%。

關(guān)鍵詞：藏雞蛋；卵白蛋白；多肽；抗氧化活性；堿性蛋白酶

中圖分類號(hào)： TS253.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）03-0144-04

收稿日期：2016-08-03

基金項(xiàng)目：西藏自治區(qū)自然科學(xué)基金（編號(hào)：2015ZR-14-30）；國(guó)家自然科學(xué)基金地區(qū)科學(xué)基金（編號(hào)：31560492）。

作者簡(jiǎn)介：池福敏（1985—），女，碩士研究生，講師，主要從事高原特色食品加工研究。E-mail：chifumin2008@163.com。

藏雞生活在我國(guó)青藏高原海拔2 200～4 100 m的半農(nóng)半牧區(qū)、雅魯藏布江中游流域河谷區(qū)、藏東三江中游高山峽谷區(qū)等區(qū)域，其生活環(huán)境相對(duì)封閉，幾乎無(wú)污染，因此藏雞蛋具有天然綠色的優(yōu)勢(shì)。巴桑等、陳烽烽等研究表明，藏雞蛋中粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、鐵、鋅、鈣的含量均高于普通雞蛋，具有比普通雞蛋更高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[1-2]。藏雞蛋具有綠色天然、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高等優(yōu)點(diǎn)，開(kāi)發(fā)利用前景廣闊。

卵白蛋白是雞蛋蛋清中一種重要的蛋白質(zhì)，占蛋清中蛋白質(zhì)的50%以上，含人體必需的8種氨基酸，是獲得抗氧化肽、抗菌肽、免疫肽、降血壓肽等生物活性肽的良好資源[3-6]。其中，抗氧化肽不僅具有多肽產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)作用，還具有抗氧化和清除體內(nèi)自由基的功能，可增強(qiáng)人體抗衰老、抗疾病的能力[7-8]。

目前，國(guó)內(nèi)外已有關(guān)于卵白蛋白抗氧化肽的研究報(bào)道。Davalos等研究發(fā)現(xiàn)，采用胃蛋白酶水解卵白蛋白可得到4種抗氧化肽，且4種肽的序列均包含在卵白蛋白序列中[9]。徐明生系統(tǒng)研究了卵白蛋白的提取和酶解制備抗氧化肽的工藝條件，并首次采用多種抗氧化活性試驗(yàn)，全面研究了雞蛋卵白蛋白酶解物的抗氧化活性[10]。沈勇根等用胃蛋白酶水解卵白蛋白，采用超濾、離子色譜、反相高效液相色譜法從卵白蛋白酶解液中分離制備抗氧化肽，得到抗氧化力較強(qiáng)的3個(gè)肽[11]。Chen等研究了不同酶酶解雞蛋清獲得水解物的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)木瓜蛋白酶的酶解物具有最強(qiáng)的DPPH自由基清除力[12]。薛海燕等采用胃蛋白酶水解卵清蛋白，通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)確定了酶解的最佳條件[13]。然而目前，有關(guān)藏雞蛋卵白蛋白抗氧化肽的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)以藏雞蛋卵白蛋白為材料，采用堿性蛋白酶水解藏雞蛋卵白蛋白制備抗氧化肽，探討最佳的水解條件，同時(shí)對(duì)其抗氧化活性進(jìn)行測(cè)定，以期為以藏雞蛋卵白蛋白為原料的抗氧化肽及其他生物活性肽的進(jìn)一步研究提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

藏雞蛋購(gòu)自西藏自治區(qū)林芝市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；堿性蛋白酶（活力單位≥10 000 U/g）、Trolox、考馬斯亮藍(lán)G-250、DPPH均購(gòu)自Sigma公司；三羥甲基氨基甲烷購(gòu)自Amresco公司；大豆卵磷脂（BR）購(gòu)自科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

AL104型電子分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]，UPH-II-10L型實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)（成都優(yōu)越科技有限公司），電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），R134a型冷凍離心機(jī)（德國(guó)艾本德股份公司），KPN型凱氏定氮儀（浙江托普儀器有限公司），JK-500DB型數(shù)控超聲清洗器（合肥金尼克機(jī)械制造有限公司），ZD-F12型冷凍干燥機(jī)（鄭州比朗儀器有限公司），UV-2102 PCS型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)[尤尼柯（上海）儀器有限公司]，99-1型大功率磁力攪拌器（常州國(guó)華電器有限公司）。

1.3方法

1.3.1卵白蛋白的制備

按照傅冰等的方法[14]從藏雞蛋中提取卵白蛋白，制成藏雞蛋卵白蛋白凍干粉，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2堿性蛋白酶酶解試驗(yàn)設(shè)計(jì)

參照秦婧的前處理方法[15]，主要對(duì)堿性蛋白酶水解藏雞蛋卵白蛋白時(shí)的底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、水解時(shí)間、酶的添加量進(jìn)行單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，通過(guò)測(cè)定酶解液的O-2[KG-*2]· [KG-*3]清除率和水解度來(lái)判斷各因素對(duì)酶解效果的影響。

單因素試驗(yàn)中各因素的具體情況如下。底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)：分別設(shè)定底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%、3%、4%、5%、6%，在酶解時(shí)間為4 h、加酶量為8 000 U/g的條件下進(jìn)行酶解。酶解時(shí)間：分別設(shè)定水解時(shí)間為2、3、4、5、6 h，在底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%、加酶量為8 000 U/g的條件下進(jìn)行酶解。酶的添加量：分別設(shè)定酶的添加量為6 000、7 000、8 000、9 000、10 000 U/g，在底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%、時(shí)間為4 h的條件下進(jìn)行酶解。

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，對(duì)3個(gè)因素進(jìn)行L9（34）正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)（表1），確定最佳酶解參數(shù)。

1.3.3檢測(cè)指標(biāo)

O-2[KG-*2]· [KG-*3]清除率采用任娜等的方法[16]進(jìn)行測(cè)定。水解度的計(jì)算公式為：水解度=[SX（]氨基態(tài)氮總氮[SX）]×100%。采用甲醛滴定法[10]進(jìn)行氨基態(tài)氮測(cè)定，采用凱氏定氮法[17]進(jìn)行總氮測(cè)定。

1.3.4最優(yōu)組合驗(yàn)證

對(duì)“1.3.2”節(jié)正交試驗(yàn)中最優(yōu)組合得到的產(chǎn)物進(jìn)行驗(yàn)證，檢測(cè)指標(biāo)包括O-2[KG-*2]· [KG-*3]清除率、DPPH自由基清除率、·OH清除力、還原力、抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力。其中，O-2[KG-*2]· [KG-*3]清除率采用任娜等的方法[16]進(jìn)行測(cè)定，DPPH自由基清除率、抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力采用秦婧的方法[15]進(jìn)行測(cè)定，·OH清除力采用楊紅澎等的方法[18]進(jìn)行測(cè)定，還原力采用許效群等的方法[19]進(jìn)行測(cè)定。

2結(jié)果與分析

2.1堿性蛋白酶水解單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)酶解效果的影響

由圖1可知，隨著底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，酶解產(chǎn)物的O-2[KG-*2]· [KG-*3]清除率先逐漸上升，在3%時(shí)達(dá)到最大值后下降，此后又逐漸上升，整體呈現(xiàn)不規(guī)則的形式。隨著底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，酶解產(chǎn)物的水解度則呈先增加、后減小的趨勢(shì)，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%時(shí)水解度最大。綜合兩者進(jìn)行分析，3%為最佳的底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)，此時(shí)O-2[KG-*2]· [KG-*3]清除率為50.35%，水解度為59.64%。

[TPCFM1.tif][FK）]

2.1.2酶解時(shí)間對(duì)酶解效果的影響

由圖2可知，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，酶解產(chǎn)物的O-2[KG-*2]· [KG-*3]清除率逐漸增加，在4 h達(dá)到最大值后下降，但在6%時(shí)再次上升。酶解產(chǎn)物的水解度隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸上升，在4 h后上升趨勢(shì)平緩。綜合兩者[CM（25]進(jìn)行分析，確定4[KG*3]h為最佳水解時(shí)間，此時(shí)O-2[KG-*2]· [KG-*3]清除率為[CM）]

[TPCFM2.tif；S+2mm][FK）]

47.11%，水解度為49.83%。

2.1.3加酶量對(duì)酶解效果的影響

由圖3可知，隨著酶添加量的增加，酶解產(chǎn)物的O-2[KG-*2]· [KG-*3]清除率和水解度均呈先增加、后減小的趨勢(shì)，兩者均在加酶量為8 000 U/g時(shí)達(dá)到最大值，此時(shí)O-2[KG-*2]· [KG-*3]清除率為55.86%，水解度為55.31%。

[FK（W12][TPCFM3.tif；S+3mm][FK）]

2.2堿性蛋白酶正交試驗(yàn)結(jié)果

堿性蛋白酶酶解卵白蛋白正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。O-2[KG-*2]· [KG-*3]清除能力、水解度的方差分析分別見(jiàn)表3、表4。

由表2可知，堿性蛋白酶酶解卵白蛋白試驗(yàn)中，各考察因素對(duì)O-2[KG-*2]· [KG-*3]清除能力的影響大小順序?yàn)镃（加酶量）>B（酶解時(shí)間）>A（底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)），最優(yōu)組合為A1B3C1，即底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%、酶解時(shí)間5 h、加酶量7 000 U/g；各考察因素對(duì)水解度的影響大小順序?yàn)镃（加酶量）>A（底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)）>B（酶解時(shí)間），最優(yōu)組合為A3B1C2，即底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%、酶解時(shí)間3 h、加酶量8 000 U/g。

由表3、表4可知，各考察因素中，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酶解時(shí)間、加酶量對(duì)O-2[KG-*2]· [KG-*3]清除率和水解度的影響均不顯著。

通過(guò)對(duì)2個(gè)指標(biāo)的極差和方差分析，在試驗(yàn)主要研究酶解物抗氧化性的基礎(chǔ)上，最終選擇O-2[KG-*2]· [KG-*3]清除率為主要參考指標(biāo)，通過(guò)正交試驗(yàn)得到蛋白酶酶解的最優(yōu)組合為A1B3C1，即底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%、酶解時(shí)間5 h、加酶量7 000 U/g。

2.3最優(yōu)組合驗(yàn)證

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果，以DPPH自由基清除能力、還原力、羥基自由基活性、超氧陰離子清除率、抗脂質(zhì)氧化能力為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別對(duì)堿性蛋白酶酶解藏雞蛋卵白蛋白的最優(yōu)組合進(jìn)行驗(yàn)證。

在最佳條件下，堿性蛋白酶酶解藏雞蛋卵白蛋白的酶解多肽O-2[KG-*2]· [KG-*3]清除率、DPPH自由基清除率、·OH清除率分別為71.75%、56.47%、84.46%，還原力、抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力分別為0.87、82.83%。此結(jié)果可為具體要求下酶解藏雞蛋卵白蛋白獲得酶解多肽提供依據(jù)。

3討論與結(jié)論

3.1討論

單因素試驗(yàn)中，研究底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)酶解物水解度的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，酶解過(guò)程中酶解產(chǎn)物的水解度并不隨著底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而增加，而是呈先增加、后減小的趨勢(shì)，這與郭剛軍等的研究結(jié)果一致，即堿性蛋白酶和中性蛋白酶酶解澳洲堅(jiān)果粕制備多肽的過(guò)程中，水解度與底物濃度之間的現(xiàn)象[20]。這主要由于在酶解過(guò)程中，當(dāng)?shù)孜餄舛仍谙鄬?duì)較低的范圍內(nèi)變化時(shí)，酶的水解效率受底物濃度的限制，表現(xiàn)為水解度隨著底物濃度的增加而逐漸加大；但當(dāng)?shù)孜餄舛瘸鲞@一范圍后，酶解液的黏度隨著底物濃度的增加而逐漸變大，蛋白質(zhì)的溶出率會(huì)相應(yīng)下降，過(guò)多的底物分子堆積于酶的活動(dòng)中心，超過(guò)酶飽和時(shí)所需的底物濃度，進(jìn)而影響酶催化速度及產(chǎn)物分子的擴(kuò)散，從而表現(xiàn)為水解度隨著底物濃度的繼續(xù)升高而下降的現(xiàn)象。

單因素試驗(yàn)中，研究酶解時(shí)間對(duì)酶解產(chǎn)物抗氧化活性和水解度的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，酶解過(guò)程中隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，水解度越來(lái)越大，但抗氧化活性卻不是越來(lái)越強(qiáng)，而是呈先增加、后減小的趨勢(shì)。產(chǎn)生該現(xiàn)象主要是由于存在過(guò)度水解的情況，即在一定的水解時(shí)間后，隨著水解的繼續(xù)進(jìn)行，一些具有抗氧化活性的肽段會(huì)被進(jìn)一步水解，相應(yīng)的抗氧化活性則消失，整體的抗氧化活性隨之下降[21]。可見(jiàn)，并不是水解越徹底則抗氧化活性越強(qiáng)。這也能解釋在其他因素的試驗(yàn)結(jié)果中，有時(shí)也會(huì)存在水解度與O-2[KG-*2]· [KG-*3]清除率變化不一致的情況，表明水解度與O-2[KG-*2]· [KG-*3]清除率的變化沒(méi)有顯著相關(guān)性，這與李誠(chéng)等、盛小波、焦寶利等的研究結(jié)果[22-24]一致，從另一角度說(shuō)明多肽的抗氧化活性與肽鏈中暴露的氨基酸側(cè)鏈性質(zhì)、肽的氨基酸序列有關(guān)。低水解度時(shí)，具有抗氧化活性的氨基酸殘基不能暴露，無(wú)法顯示抗氧化活性；水解度過(guò)高時(shí)，具有抗氧化活性的肽被進(jìn)一步水解，抗氧化活性結(jié)構(gòu)被破壞，活性降低[22，25]。

單因素試驗(yàn)中，研究加酶量對(duì)酶解物抗氧化活性和水解度的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，加酶量并不是越多越好，在一定范圍內(nèi)，抗氧化活性與水解度均隨著酶添加量的增加而增加，但超過(guò)這一范圍酶添加量繼續(xù)增加時(shí)，抗氧化活性與水解度反而下降。這可能是由于在一定范圍內(nèi)，隨著酶量的增加，底物與酶的接觸面積增大，酶解反應(yīng)速率相應(yīng)提高，酶解程度越來(lái)越大；但當(dāng)加酶量超過(guò)最佳值后，可能由于酶的過(guò)量加入造成整個(gè)酶解液性質(zhì)的改變，如造成黏度增加而使酶與底物的結(jié)合受到影響等，從而導(dǎo)致水解度和抗氧化活性下降，具體原因有待進(jìn)一步研究。

3.2結(jié)論

以O(shè)-2[KG-*2]· [KG-*3]清除率和水解度為指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)與正交試驗(yàn)，得出堿性蛋白酶酶解藏雞蛋卵白蛋白的最佳條件為底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%、酶解時(shí)間5 h、加酶量7 000 U/g。

對(duì)最優(yōu)組合進(jìn)行驗(yàn)證，在最佳酶解條件下，堿性蛋白酶酶解藏雞蛋卵白蛋白所得抗氧化肽的O-2[KG-*2]· [KG-*3]清除率、DPPH自由基清除率、·OH清除率分別為71.75%、56.47%、84.46%，還原力、抗脂質(zhì)過(guò)氧化能力分別為0.87、82.83%。該數(shù)據(jù)為針對(duì)性地酶解藏雞蛋卵白蛋白制備抗氧化多肽提供了依據(jù)。

[HS2]參考文獻(xiàn)：

[1]巴桑，強(qiáng)巴央宗，申曉東，等. 西藏地區(qū)藏雞蛋的營(yíng)養(yǎng)成分分析[J]. 畜禽業(yè)，2003（10）：18-19.

[2]陳烽烽，楊孔，趙曉剛，等. 藏雞蛋與普通雞蛋的營(yíng)養(yǎng)成分比較研究[J]. 西南民族大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2009，35（5）：1013-1016.

[3]Mine Y，Kovacs-Nolan J，包文斌，等. 從雞蛋中獲取生物活性蛋白及生物活性肽新探[J]. 國(guó)外畜牧學(xué)：豬與禽，2006，26（4）：54-57.

[4]趙法利，劉靜波，劉瑜，等. 雞蛋中功能成分的研究[J]. 食品科學(xué)，2006，27（12）：798-802.

[5]吳建平. 雞蛋中生物活性肽的機(jī)遇與挑戰(zhàn)[J]. 中國(guó)家禽，2012，34（13）：39.

[6]王勇德，項(xiàng)錦欣. 雞蛋功效成分的研究進(jìn)展[J]. 肉類工業(yè)，2005（7）：20-23.

[7]劉建濤，趙利，蘇偉. 雞蛋中的生物活性蛋白質(zhì)和肽[J]. 中國(guó)釀造，2008（24）：27-29.

[8]唐蔚，寧奇，孫培冬. 南瓜籽抗氧化肽的制備及分離純化[J]. 中國(guó)油脂，2016，41（2）：20-24.

[9]Davalos A，Miguel M，Bartolome B，et al. Antioxidant activity of peptides derived from egg white proteins by enzymatic hydrolysis[J]. Journal of Food Protection，2004，67（9）：1939-1944.

[10]徐明生. 雞蛋卵白蛋白酶解物抗氧化肽研究[D]. 西安：陜西師范大學(xué)，2006.

[11]沈勇根，徐明生，尹忠平，等. 卵白蛋白抗氧化肽分離與純化[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2011，11（8）：16-22.

[12]Chen C，Chi Y，Zhao M，et al. Purification and identification of antioxidant peptides from egg white protein hydrolysate[J]. Amino Acids，2012，43（1）：457-466.[HJ1.75mm]

[13]薛海燕，王戰(zhàn)勇，宋宏新，等. 卵清蛋白水解及抗氧化肽制備工藝研究[J]. 陜西科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2016，34（3）：126-131.

[14]傅冰，季秀玲，俞匯穎，等. 鹽析法快速分離雞蛋清卵白蛋白[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（6）：229-230.

[15]秦婧. 卵白蛋白源抗氧化活性肽的酶法制備及分離鑒定[D]. 西安：陜西科技大學(xué)，2014.

[16]任娜，郭麗萍，劉玉環(huán)，等. 國(guó)產(chǎn)葡萄酒清除自由基作用的研究[J]. 食品科學(xué)，2009，30（15）：90-93.

[17]食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定：GB 5009.5—2010[S]. 北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2010.

[18]楊紅澎，蔣與剛，崔玉山，等. 藍(lán)莓等10種果蔬提取物體外抗氧化活性的比較[J]. 食品研究與開(kāi)發(fā)，2010，31（11）：69-71.

[19]許效群，劉志芳，霍乃蕊，等. 苦蕎糠皮總黃酮的抗氧化活性及免疫調(diào)節(jié)活性[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2012，12（6）：42-47.

[20]郭剛軍，鄒建云，胡小靜，等. 液壓壓榨澳洲堅(jiān)果粕酶解制備多肽工藝優(yōu)化[J]. 食品科學(xué)，2016，37（17）：173-178.

[21]劉偲琪，方佳茂，劉紅梅，等. 水解度對(duì)蠶蛹蛋白酶物的物化特性和抗氧化能力的影響[J]. 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報(bào)，2014，32（2）：32-38.

[22]李誠(chéng)，余霞，付剛，等. 豬皮膠原蛋白酶解及其酶解產(chǎn)物的抗氧化活性[J]. 食品科學(xué)，2011，32（23）：147-151.

[23]盛小波. 超高壓處理對(duì)牛乳清蛋白水解及其產(chǎn)物抗氧化活性的影響[D]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2011.

[24]焦寶利，田少君，毛小平，等. 大豆蛋白酶解產(chǎn)物抗氧化活性與水解度相關(guān)性研究[J]. 糧食與油脂，2015，28（2）：28-32.

[25]孫騫，胡鑫，羅永康，等. 豬血紅蛋白抗氧化肽的酶法制備及其體外抗氧化活力觀察[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，13（4）：77-81.