周敏 付金娥 韋樹(shù)根 潘麗梅

摘要：為從青蒿中提取高質(zhì)量的RNA，以青蒿葉片、莖、根和花為材料，采用TRIzol法、改良TRIzol法、十六烷基三甲基溴化銨-LiCl（CTAB-LiCl）法、CTAB-異丙醇法4種方法，比較不同材料不同方法分離RNA的效果。結(jié)果表明，4種方法所提RNA純度均較高，其中改良TriZol法所提RNA質(zhì)量最好。

關(guān)鍵詞：青蒿；RNA提??；改良TRIzol法；蛋白質(zhì)

中圖分類號(hào)： Q522文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）03-0031-02

收稿日期：2015-09-29

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81560623）；廣西自然科學(xué)基金（編號(hào)：2013GXNSFAA019221、2013GXNSFBA019180）。

作者簡(jiǎn)介：周敏（1991—），女，江西贛州人，碩士研究生，主要從事藥用植物資源育種方面研究。E-mail：zmlww1020@163.com。

通信作者：韋樹(shù)根，碩士，副研究員，主要從事藥用植物資源、繁殖、育種等方面的研究。E-mail：weishugen2@163.com。

2015版《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定，青蒿為菊科植物黃花蒿（Artemisia annua L.）的干燥地上部分[1]。青蒿苦、辛、寒，具有清虛熱、除骨蒸、解暑熱、截瘧、退黃的功效，多用于治療溫邪傷陰、夜熱早涼、陰虛發(fā)熱、骨蒸勞熱、暑邪發(fā)熱、瘧疾寒熱、濕熱黃疸等疾病。隨著青蒿素被發(fā)現(xiàn)是治療瘧疾的首選藥物，挽救了全球特別是發(fā)展中國(guó)家數(shù)百萬(wàn)人的生命，使得青蒿一直以來(lái)是研究的熱點(diǎn)。目前青蒿的研究不僅從資源、栽培、育種等傳統(tǒng)技術(shù)方面進(jìn)行，還從分子生物學(xué)的角度闡明青蒿生長(zhǎng)和發(fā)育機(jī)制及其有效成分青蒿素合成和累積機(jī)制等方面進(jìn)行。因此，提取高質(zhì)量、高純度、完整性好的RNA是分子生物學(xué)研究的重要基礎(chǔ)，對(duì)于進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR），cDNA合成、RNA序列分析、Northern印跡雜交等具有重要意義。由于植物組織中化學(xué)成分復(fù)雜，并沒(méi)有一種RNA提取方法適用于所有的植物[2]。青蒿的化學(xué)成分主要有揮發(fā)油類、香豆素類、萜類、黃酮類、苯丙酸類及其他類成分[3]，復(fù)雜的化學(xué)成分增加了青蒿RNA提取的難度，且前人也未系統(tǒng)地對(duì)青蒿不同部位RNA提取進(jìn)行研究。本研究通過(guò)比較TRIzol法、改良TRIzol法、十六烷基三甲基溴化銨-LiCl（CTAB-LiCl）法和CTAB-異丙醇4種方法提取青蒿不同部位的RNA，不僅進(jìn)一步地為青蒿進(jìn)行RT-PCR、cDNA合成、RNA序列分析、Northern印跡雜交等分子生物學(xué)試驗(yàn)提供基礎(chǔ)，還為近緣種植物RNA的提取提供參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

2015年8月，采集廣西藥用植物園栽培基地的青蒿葉片、莖、花、根等作為試驗(yàn)材料，立即用液氮速凍后置于 -80 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2試驗(yàn)試劑

TRIzol試劑盒、三氯甲烷、異丙醇、三氯甲烷+異戊醇（24 ∶[KG-*3]1）、苯酚、75%乙醇、焦碳酸二乙酯（DEPC）水、CTAB、8 mol/L LiCl、1%瓊脂糖凝膠，1×TAE緩沖液。

1.3試驗(yàn)儀器

主要儀器：Eppendorf移液槍，Sigma Sartorius臺(tái)式冷凍離心機(jī)，渦旋振蕩儀器，Bio-Rad電泳儀，ChemiDoc XRS凝膠成像系統(tǒng)，MILIPORE超純水機(jī)，制冰機(jī)（北京長(zhǎng)流科學(xué)儀器公司），恒溫干燥箱（上海天恒醫(yī)療器械有限公司），微量分光光度計(jì)，水浴鍋。

1.4操作方法

1.4.1TRIzol試劑盒法

取0.2 g植物組織，在液氮中研磨成細(xì)粉，轉(zhuǎn)移至裝有1 mL TRIzol的1.5 mL離心管中，再加入0.2 mL三氯甲烷顛倒混勻15 s，室溫靜置3 min，4 ℃、12 000 r/min 離心15 min；取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入等體積異丙醇，渦旋混勻，室溫靜置10 min，4 ℃、12 000 r/min 離心10 min，棄上清液，沿試管壁加入1 mL 75%乙醇溶液，4 ℃、8 190 r/min離心5 min，棄上清液，室溫干燥5 min，加50 μL DEPC水溶解。

1.4.2改良TRIzol法

取0.2 g植物組織，在液氮中研磨成細(xì)粉，轉(zhuǎn)移至裝有1 mL TRIzol的1.5 mL離心管中，渦旋振蕩1 min，4 ℃、2 000 r/min離心15 min；取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入等體積苯酚+三氯甲烷+異戊醇（25 ∶[KG-*3]24 ∶[KG-*3]1）溶液，渦旋振蕩1 min，室溫靜置3～5 min，4 ℃、12 000 r/min離心15 min；取上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入等體積的三氯甲烷+異戊醇，室溫靜置3～5 min，4 ℃、12 000 r/min離心 15 min，加入等體積三氯甲烷，室溫靜置3～5 min，4 ℃、12 000 r/min 離心15 min；取上清液200 μL轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入 0.5 mL 預(yù)冷的異丙醇，顛倒混勻8～10次，室溫靜置8～10 min，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，棄上清液，試管壁加入1 mL 75%乙醇溶液，4 ℃、8 190 r/min離心5 min，棄上清液，室溫干燥5 min，加50 μL DEPC水溶解。

1.4.3CTAB-LiCl法

取0.2 g液氮研磨的樣品迅速轉(zhuǎn)移至60 ℃預(yù)熱的含有600 μL CTAB的離心管中，渦旋振蕩 30 s，于60 ℃水浴2 min，其間顛倒混勻2～3次，室溫冷卻 1 min 后加入等體積三氯甲烷+異戊醇溶液，渦旋振蕩1 min后，4 ℃、12 000 r/min離心15 min；取上清液，加入等體積的三氯甲烷+異戊醇溶液，渦旋振蕩1 min，4 ℃、12 000 r/min離心 15 min；將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入1/3體積的 8 mol/L LiCl，4 ℃過(guò)夜沉淀，4 ℃、12 000 r/min離心15 min，棄上清液，加1 mL 75%乙醇溶液，4 ℃、8 190 r/min離心 5 min，棄上清液，室溫干燥5 min，加50 μL DEPC水溶解。

1.4.4CTAB-異丙醇法

步驟同CTAB-LiCl法，用等體積的異丙醇沉淀。

1.5RNA的質(zhì)量檢測(cè)

用1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)RNA的純度和完整性，用微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的濃度和純度。D260 nm/D280 nm為1.8～20、D260 nm/D230 nm為2.0～2.3，表明RNA樣品純度高。

2結(jié)果與分析

2.1TRIzol法提取RNA效果

由圖1、表1可見(jiàn)，電泳結(jié)果顯示有3條條帶，且條帶清晰；葉片和根的D260 nm/D280 nm值<1.80，圖1中18S條帶有拖尾，說(shuō)明RNA已有部分降解。結(jié)果表明，用此方法提取的RNA濃度較低。

2.2改良TRIzol法提取RNA效果

由圖2、表2可見(jiàn)，改良TRIzol法電泳可見(jiàn)3條清晰條帶，無(wú)拖尾，帶與帶之間無(wú)明顯彌散現(xiàn)象；D260 nm/D280 nm值均在1.8～2.1間，說(shuō)明RNA在整個(gè)提取過(guò)程中結(jié)構(gòu)完整，未發(fā)生明顯降解；D260 nm/D230 nm值均在2.0～2.3間，說(shuō)明去DNA和蛋白質(zhì)效果很好。改良后樣品濃度較高，可用于進(jìn)一步的分子試驗(yàn)。

2.3CTAB-LiCl法提取RNA效果

由圖3、表3可見(jiàn)，電泳結(jié)果有18S、28S條帶，5S條帶模糊，不清晰，不適合用于小RNA的分析，此方法沉淀RNA時(shí)，沉淀有顏色，可能是有些物質(zhì)未去除干凈；其中葉片提取的RNA D260 nm/D280 nm值<1.8，RNA有所降解，說(shuō)明此方法不適合葉的提取。

2.4CTAB-異丙醇法提取RNA效果

由圖4、表4可見(jiàn)，電泳結(jié)果與CTAB-LiCl法相同，5S條帶模糊，不清晰；但用此方法提取的RNA濃度比CTAB-LiCl高，其中花的D260 nm/D230 nm值<2.0，可能有蛋白質(zhì)殘留或者次生代謝物沒(méi)有抽提完全。

3討論

[JP2]組織的破碎程度、RNase的活性、多糖和蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)的存在[4]都會(huì)影響RNA提取的質(zhì)量。TRIzol試劑盒法比較簡(jiǎn)單方便，耗時(shí)也較短，但是可能由于步驟比較簡(jiǎn)單，對(duì)雜質(zhì)的去除不夠徹底[5-6]。改良后的TRIzol，加了苯酚，能更好去除蛋白質(zhì)、多酚、多糖等物質(zhì)，通過(guò)電泳圖、D260 nm/D280 nm值可知，濃度和純度也較高，符合轉(zhuǎn)錄組、基因克隆等高通量試驗(yàn)的要求。5S條帶缺失或不清晰是CTAB法提取RNA的不足之處，此方法提取的RNA不能用于小RNA的分析。

LiCl本身沉淀大片段RNA效果好的特點(diǎn)使得到的RNA大片段損失很少，更適于進(jìn)行后續(xù)的分子生物學(xué)試驗(yàn)；而異丙醇沉淀獲得的沉淀體積大，導(dǎo)致多糖和酚類物質(zhì)的共沉淀作用，因而CTAB-LiCl比CTAB-異丙醇更適合青蒿RNA的提取。因此，青蒿不同部位RNA用TRIzol法提取的比用CTAB法質(zhì)量更好，條帶清晰、完整，且TRIzol法比CTAB法用時(shí)更短，效率更高。[JP]

[HS2*3]參考文獻(xiàn)：

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