周開拓，蔣承耿，王秋萍，張 承，龍友華*

（1.福泉市農(nóng)村工作局，貴州 福泉 550599；2.貴州省煙草公司 六盤水市公司，貴州 六盤水 553000；3.貴州農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，貴州 清鎮(zhèn) 551400；4.貴州大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，貴州省煙草品質(zhì)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽 550025）

煙草青枯病是由Ralstonia solanacearum引起的一種嚴(yán)重危害烤煙生長的土傳病害，主要危害烤煙的根、莖、葉等部位，一般發(fā)病株率為10%～30%，嚴(yán)重的為70%～80%，許多煙田全田發(fā)病甚至絕收。目前，煙草青枯病的主要防治方法是化學(xué)防治，嚴(yán)重破壞農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)，還易使病原菌產(chǎn)生抗藥性。中生菌素是由中國農(nóng)科院研制的一種N-糖甙類抗生素，既有普通化學(xué)藥劑優(yōu)勢，兼具生物防治的特點(diǎn)，對水稻白葉枯病、白菜軟腐病等細(xì)菌性病害，以及蘋果輪紋病、西瓜枯萎病等真菌性病害具有較好的防治效果。作為一種新型生物農(nóng)藥殺菌劑，目前其用于防治煙草青枯病的報(bào)道較少。為此，以煙草青枯病為對象，探討中生菌素室內(nèi)和田間防治效果，旨在中生菌素在貴州煙區(qū)的合理使用提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試菌株為從貴州銅仁思南、畢節(jié)黔西、六盤水盤縣、貴陽修文、黔南甕安、黔西南貞豐等地采集的青枯病煙株上分離得到的青枯病菌 （Ralsto nia soanacearum E F Smith）。

供試培養(yǎng)基為牛肉蛋白胨培養(yǎng)基（牛肉膏3 g，蛋白胨 10 g，Nacl5 g，瓊脂 15～20 g，蒸餾水 1 000 mL）。

3%的中生菌素可濕性粉劑：東莞市瑞德豐生物科技有限公司；0.15%四霉素水劑：遼寧微科生物工程有限公司；72%農(nóng)用鏈霉素可溶性粉劑：華北制藥集團(tuán)愛諾有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病菌分離純化及保存 用清水沖洗病株基部莖桿表面，再用75%酒精消毒處理，用鑷子取潰膿的組織于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，培養(yǎng)皿墊2層濕潤濾紙，放濕潤棉花保濕，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2 d。用滅菌牙簽挑取膿狀物，于牛肉蛋白胨培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)。待培養(yǎng)基菌落后，繼續(xù)挑取菌落在培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)。重復(fù)數(shù)次以上步驟，即可純化出煙草青枯病菌種。對純化的菌株編號并斜面培養(yǎng)長出菌落，密封保存于4℃冰箱中。

1.2.2 菌懸液制備 用滅菌接種環(huán)蘸取含有煙草青枯病菌的試液，在NA培養(yǎng)基上劃線，于28℃恒溫箱中培養(yǎng)。待煙草青枯病菌在NA培養(yǎng)基上活化后，用3 mL無菌水配制病原菌原液。取1 mL病原菌原液，用無菌水按10，100，1 000等倍稀釋涂板，于28℃培養(yǎng)48 h，根據(jù)平板上長出的菌落數(shù)推算菌原液濃度。根據(jù)菌原液濃度制備菌懸液，使1 mL菌懸液涂板后長出的菌落數(shù)為100個(gè)左右。

1.2.3 致病菌室內(nèi)毒力測定 采用平板菌落計(jì)數(shù)法測定中生菌素對各地?zé)煵萸嗫莶【甑氖覂?nèi)毒力。根據(jù)預(yù)測試驗(yàn)結(jié)果將中生菌素配置成5個(gè)濃度梯度（125，250，500，1 000，2 000 mg/L），與 45 ℃滅菌培養(yǎng)基按1∶9的比例混合，倒入培養(yǎng)皿中混勻。用移液槍吸取500 μl菌懸液噴于含藥培養(yǎng)基上，慢慢搖勻。每處理5次重復(fù)，以無菌水為對照，在28℃恒溫培養(yǎng)48 h后，肉眼觀察統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)。所得結(jié)果用農(nóng)藥室內(nèi)生物測定數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)軟件計(jì)算，求出各藥劑的毒力回歸方程和EC50。

1.3 田間藥效試驗(yàn)

1.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)采取隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，設(shè)3%中生菌素可濕性粉劑 1 000 倍液（A）、1 200 倍液（B）、1 400 倍液（C）、0.15%四霉素水劑 500 倍液（D）、72%農(nóng)用鏈霉素可溶性粉劑1 500倍液 （E）和清水對照（CK）共 6個(gè)處理。

每個(gè)處理4次重復(fù)，共24個(gè)小區(qū)，每小區(qū)面積33 m2（長 10.0 m，寬 3.3 m），種植 60 株（行距 1.1 m，株距 0.5 m），四周設(shè)保護(hù)行。

試驗(yàn)選在貴州思南縣許家壩鎮(zhèn)和德江縣煎茶鎮(zhèn)進(jìn)行。試驗(yàn)地前茬作物為煙草，黃壤土，pH值6.5，土壤肥力中等，青枯病發(fā)生較重。2014年4月15日移栽，田間栽培管理按照當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)技術(shù)規(guī)程進(jìn)行。移栽時(shí)用藥液澆定根水，每株澆250 mL，第2次施藥時(shí)間為移栽后20 d，用900 kg/hm2藥液噴淋莖基部；移栽后60 d，用藥液噴淋植株及莖基部，用量為 1 350 kg /hm2。

1.3.2 藥效調(diào)查 第3次施藥后每5 d調(diào)查1次，共調(diào)查5次。調(diào)查小區(qū)病害始發(fā)期、發(fā)病株數(shù)、病害級別，計(jì)算病情指數(shù)、發(fā)病率及防效。

病害分級標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 青枯病分級標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Grading standard of bacterial wilt

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2003和DPS數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 中生菌素對煙草青枯病菌室內(nèi)毒力測定

中生菌素對貴州各地?zé)煵萸嗫莶【亩玖ψ饔靡姳?。

表2 中生菌素對貴州各地?zé)煵萸嗫莶【玖ψ饔肨able 2 The effects of Zhongshengmycin on the virulence of tobacco bacterial wilt in various parts of guizhou

由表2可知：3%中生菌素對各地?zé)煵萸嗫莶【幸种谱饔?，不同地區(qū)的菌株對中生菌素的敏感性有一定差異；對黔南甕安煙草青枯病抑制作用較好，EC50達(dá) 337.547 3 mg/L；對銅仁思南、貴陽修文等地的毒力次之，EC50達(dá) 361.510 3 mg/L 和 372.912 2 mg/L；對黔西和六盤水地區(qū)煙草青枯病菌的毒力較差，EC50達(dá) 428.195 7 mg/L 和 481.699 2 mg/L。

2.2 中生菌素防治煙草青枯病田間藥效

中生菌素對煙草青枯病田間防治效果見表3。

從表3可知：不同藥劑對煙草青枯病均有防治效果，顯著降低發(fā)病率和病情指數(shù)；3%的中生菌素可濕性粉劑1 000倍液的大田防治效果好于其他藥劑，平均防治效果在70.00%以上，差異均達(dá)極顯著水平（P＜0.01）；其次為3%的中生菌素可濕性粉劑1 200倍，平均防治效果達(dá)63.00%以上，與其他防治藥劑差異極顯著 （P＜0.01）；0.15%四霉素水劑 500 倍液和 72%農(nóng)用鏈霉素可溶性粉劑1 500倍液效果較差，防治效果均小于60%，且這兩種藥劑之間存在差異性。

表3 中生菌素對煙草青枯病田間防治效果Table 3 Effects of zhongshengmycin on field control of tobacco bacterial wilt

3 結(jié)論與討論

研究結(jié)果表明，3%的中生菌素可濕性粉劑對貴州各地區(qū)煙草青枯病具有較好抑制效果，且抑制差異不大，其中對黔南甕安地區(qū)煙草青枯病菌的毒力較強(qiáng)，EC50達(dá) 337.547 3 mg/L，對銅仁思南、貴陽修文煙草等地青枯病菌的毒力次之，對黔西和六盤水地區(qū)煙草青枯病菌的毒力較弱。

蔣承耿等研究結(jié)果表明，40%硫酸鏈霉素SP，3%中生菌素WP進(jìn)行室內(nèi)毒力測定效果較好，EC50分別達(dá) 65.39 mg/L 和 361.51 mg/L；畢濤等研究也表明，3%四霉素水劑、3%中生菌素可濕性粉劑對煙草青枯病有較好的抑制效果。本試驗(yàn)結(jié)果與上述研究相同。

選用農(nóng)業(yè)常用的化學(xué)農(nóng)藥為對照，大田對比試驗(yàn)結(jié)果表明，3%的中生菌素可濕性粉劑1 000～1 200倍液平均防治效果在70%以上，同其他藥劑差異極顯著；防治效果次之的為0.15%四霉素水劑500倍液，72%農(nóng)用鏈霉素可溶性粉劑1 500倍液效果較差。這與蔣承耿、畢濤等研究結(jié)果一致。

綜上所述，3%的中生菌素可濕性粉劑對貴州各地區(qū)煙草青枯病室內(nèi)毒力均有效果，1 000～1 200倍液的田間防治效果較好，可用于田間防控?zé)煵萸嗫莶　?/p>

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［2］黃小琴，劉勇，張蕾，等.煙草青枯病生防芽孢桿菌協(xié)同防治藥劑的篩選和復(fù)配［J］.農(nóng)藥，2015，54（11）：848-851.

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