王金濤， 李 野， 董麗華， 隋世華， 李加梅， 鄭加平*， 周廣喜

1.山東省日照市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，日照 276800 2.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，天津 300052

·短篇論著·

復(fù)發(fā)性視神經(jīng)脊髓炎患者外周血記憶T細(xì)胞與IL-7水平的變化

王金濤1， 李 野1， 董麗華1， 隋世華1， 李加梅1， 鄭加平1*， 周廣喜2

1.山東省日照市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，日照 276800 2.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，天津 300052

目的： 觀察復(fù)發(fā)與未復(fù)發(fā)視神經(jīng)脊髓炎(neuromyelitis optica, NMO)患者外周血記憶T細(xì)胞(CD4+CD45RA-T細(xì)胞)和IL-7水平的變化, 探討記憶T細(xì)胞在NMO復(fù)發(fā)機(jī)制中的作用。方法： 利用流式細(xì)胞儀檢測復(fù)發(fā)組(15例)、未復(fù)發(fā)組(17例)NMO患者及健康對照組(15例)CD4+CD45RA-細(xì)胞的比例。采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測3組血漿白細(xì)胞介素7(IL-7)的濃度。分析32例患者的CD4+CD45RA-細(xì)胞比例與IL-7水平的相關(guān)性。結(jié)果： 復(fù)發(fā)組CD4+CD45RA-細(xì)胞比例(32.86±5.53)%高于未復(fù)發(fā)組(19.98±5.72)%及健康對照組(19.59±4.49)%，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；未復(fù)發(fā)組CD4+CD45RA-細(xì)胞比例高于健康對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。復(fù)發(fā)組IL-7水平[(418.73±78.96)pg/mL]高于未復(fù)發(fā)組[(313.33±57.65) pg/mL]及健康對照組[ (303.43±40.48) pg/mL]，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；未復(fù)發(fā)組IL-7水平高于健康對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。NMO患者CD4+CD45RA-細(xì)胞比例與IL-7的水平顯著相關(guān)(r=0.817，P=0.000)。結(jié)論： 記憶T細(xì)胞參與NMO的復(fù)發(fā)過程，而IL-7對記憶T細(xì)胞的生成和功能有促進(jìn)作用

視神經(jīng)脊髓炎；復(fù)發(fā)；記憶T細(xì)胞；IL-7

視神經(jīng)脊髓炎(neuromyelitis optica, NMO)是一種主要累及視神經(jīng)及脊髓的炎性脫髓鞘疾病，臨床上以視神經(jīng)和脊髓同時或相繼受累為主要特征，呈進(jìn)行性發(fā)展或緩解復(fù)發(fā)交替。近年來，研究[1]發(fā)現(xiàn)，該病是由某些病因引起的針對水通道蛋白4產(chǎn)生特異性NMO-IgG抗體的自身免疫性疾?。?0%～90%的患者可復(fù)發(fā)，稱為復(fù)發(fā)型視神經(jīng)脊髓炎(relapsing neuromyelitis optica,RNMO)。隨著復(fù)發(fā)次數(shù)的增加，神經(jīng)功能累積損傷程度越重、預(yù)后越差，故進(jìn)一步探討NMO的復(fù)發(fā)機(jī)制對減少患者的復(fù)發(fā)率并改善預(yù)后有重要意義。

免疫記憶為自身免疫性疾病的重要特征。在自身免疫性疾病發(fā)病過程中，記憶T細(xì)胞(CD45RA-或CD45RO+)在抗原刺激下產(chǎn)生細(xì)胞因子等效應(yīng)因子，并輔助B細(xì)胞產(chǎn)生抗體。白細(xì)胞介素7(IL-7)是維持效應(yīng)T細(xì)胞生存并協(xié)助其發(fā)展至記憶階段的關(guān)鍵細(xì)胞因子[2]，尤其對維持CD4+記憶T細(xì)胞的功能起重要作用[3]。CD4+T細(xì)胞能夠分化為多種輔助性T細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，在適應(yīng)性免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，不僅參與體液免疫，而且參與細(xì)胞免疫。目前認(rèn)為,NMO發(fā)病過程中既有體液免疫的參與，又有細(xì)胞免疫參與[4]?；谏鲜鲅芯?，本研究測定了NMO患者外周血記憶T細(xì)胞的變化及血清IL-7的水平，并進(jìn)一步探討引起NMO復(fù)發(fā)的病理機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2009年1月至2015年12月在日照市人民醫(yī)院(12例)及天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院(20例)住院治療及門診就診的NMO患者。32例患者分為復(fù)發(fā)組15例、未復(fù)發(fā)組17例。另選擇15例在日照市人民醫(yī)院進(jìn)行健康體檢的健康人群作為健康對照組。

1.1.1 診斷標(biāo)準(zhǔn) 患者依據(jù)Wingerchuk等[5]在2006年提出的NMO修訂后診斷標(biāo)準(zhǔn)確診。診斷標(biāo)準(zhǔn)如下：(1)視神經(jīng)炎；(2)急性脊髓炎；(3)至少符合脊髓MRI T2WI圖像上超過3個脊椎節(jié)段損害征、頭顱MRI表現(xiàn)不符合多發(fā)性硬化、NMO-IgG血清抗體陽性3項中的2項。

1.1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) 復(fù)發(fā)組納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)確診NMO患者再次復(fù)發(fā)，出現(xiàn)新的神經(jīng)系統(tǒng)受損癥狀或原有癥狀加重，并且癥狀持續(xù)時間大于48 h；(2)Kurtzke擴(kuò)展殘疾狀態(tài)量表(Kurtzke extended disability status scale, EDSS)評分支持病情惡化；(3)不伴發(fā)熱和代謝紊亂；(4)未應(yīng)用大劑量激素、免疫球蛋白或其他免疫抑制劑治療。

未復(fù)發(fā)組納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)自上次臨床治愈后半年以上病情穩(wěn)定、無新的神經(jīng)系統(tǒng)受損癥狀出現(xiàn)或原有癥狀加重；(2)EDSS評分1個月內(nèi)無明顯改變。

健康對照組納入標(biāo)準(zhǔn)： (1)年齡、性別與上述兩組病例相匹配；(2)均無免疫相關(guān)疾病史，近2個月內(nèi)無感染史，近3個月內(nèi)未使用腎上腺皮質(zhì)激素、免疫抑制劑及其他免疫調(diào)節(jié)劑等。

1.2 方 法

1.2.1 實驗試劑及儀器 人白細(xì)胞分化抗原CD4 perCP-CY 5.5、CD45RA FITC、紅細(xì)胞裂解液、FACS Calibur流式細(xì)胞儀購自BD公司；人IL-7 ELISA試劑盒購自R&D公司；標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格酶標(biāo)儀購自Thermo公司。

1.2.2 標(biāo)本采集 所有研究對象于8:00～9:00采集空腹靜脈血2 mL，用EDTA抗凝。取200 μL全血，3 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀進(jìn)行淋巴細(xì)胞亞型分析。余標(biāo)本離心，1 006×g，收集血清，分裝后-20℃保存。

1.2.3 免疫熒光法 將上述200 μL全血分別取100 μL(白細(xì)胞約1×106個/10 μL)置入兩個空管內(nèi)，分別作為試驗管及對照管。于試驗管內(nèi)加入10 μL PerCP熒光標(biāo)記的抗人CD4、FITC 熒光標(biāo)記抗人CD45RA抗體，將試驗管與對照管放于4℃、避光10 min。染色后將試驗管和對照管在室溫下分別加入經(jīng)去離子水稀釋的紅細(xì)胞裂解液(10∶1)1 mL，室溫下避光10 min。裂解后兩試管分別161×g離心5 min，棄去上清，得白細(xì)胞沉淀，加入2 mL PBS洗滌1次，161×g離心5 min。最后澄清的沉淀分別加入500 μL PBS制成單細(xì)胞懸液，上機(jī)分析。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附分析法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA) 嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書，同期檢測3組的血漿IL-7濃度。于波長450 nm 處讀取各孔光密度(D)值。以D值為縱坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，在對數(shù)坐標(biāo)紙上繪制曲線圖，樣品D值對應(yīng)的濃度范圍為檢測結(jié)果(血清IL-7的靈敏度為1.0 pg/mL)。

2 結(jié) 果

2.1 一般資料比較 3組資料的性別、年齡差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；復(fù)發(fā)組及未復(fù)發(fā)組發(fā)病次數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。

表1 3組患者一般資料比較

2.2 外周血CD4+T細(xì)胞比例 熒光染色細(xì)胞標(biāo)本行流式細(xì)胞術(shù)檢測，計算各組樣本外周血CD4+CD45RA-T細(xì)胞數(shù)及比例(圖1)。 復(fù)發(fā)組CD4+CD45RA-細(xì)胞比例明顯高于未復(fù)發(fā)組及健康對照組(P=0.000)；未復(fù)發(fā)組與健康對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表2)。

2.3 血清IL-7水平 復(fù)發(fā)組IL-7水平顯著高于未復(fù)發(fā)組及健康對照組(P<0.01);未復(fù)發(fā)組及健康對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表2)。

2.4 NMO患者記憶T細(xì)胞與IL-7水平的相關(guān)性分析 NMO患者記憶T細(xì)胞水平與IL-7水平正相關(guān)(r=0.817，P=0.000；圖2)。

圖1 經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測3組樣本CD4+CD45RA-T細(xì)胞數(shù)

組 別NCD4+CD45RA-細(xì)胞(%)IL-7(pg/mL)復(fù)發(fā)組1532.86±5.53*△418.73±78.96*△未復(fù)發(fā)組1719.98±5.72313.33±57.65健康對照組1519.59±4.49303.43±40.48

*P=0.000與未復(fù)發(fā)組相比；△P=0.000與健康對照組相比

圖2 NMO患者CD4+CD45RA-細(xì)胞比例與IL-7水平的相關(guān)性分析

3 討 論

人外周血T細(xì)胞主要由CD4+和CD8+T細(xì)胞所組成。根據(jù)其表型、功能和不同的組織分布，將T細(xì)胞分為多種亞群。初始T細(xì)胞是指離開胸腺但還未受到抗原刺激的T細(xì)胞。初始T細(xì)胞接受抗原刺激后轉(zhuǎn)化為效應(yīng)T細(xì)胞，當(dāng)抗原被清除后，90%以上的效應(yīng)T細(xì)胞凋亡，5%～10%的效應(yīng)T細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)橛洃汿細(xì)胞。目前，根據(jù)CD45RO 或CD45RA的表達(dá)與否鑒別初始和記憶T細(xì)胞的方法。CD45RO陰性 或CD45RA陽性為初始T細(xì)胞，反之為記憶T 細(xì)胞[6]。當(dāng)再次接受抗原刺激后，記憶T細(xì)胞迅速克隆、增殖，并迅速分化為效應(yīng)細(xì)胞，進(jìn)而產(chǎn)生炎癥反應(yīng)和發(fā)揮細(xì)胞毒作用。而效應(yīng)T細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)橛洃汿細(xì)胞必須逃脫凋亡程序，及時獲得生存優(yōu)勢，這對記憶細(xì)胞的生成至關(guān)重要。IL-7通過上調(diào)Bcl-2和Bcl-X的表達(dá)，促進(jìn)胸腺及胸腺外T細(xì)胞的增殖[5]。當(dāng)IL-7少于生理需要量時，記憶T細(xì)胞的生成數(shù)量減少[7]。有文獻(xiàn)[8]報道，在敲除IL-7基因的小鼠中，胸腺細(xì)胞的Bcl-2表達(dá)水平大幅度下降，細(xì)胞周期停滯于G0/G1期，導(dǎo)致外周T細(xì)胞大量減少。本研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)發(fā)組CD4+CD45RA-(即記憶T細(xì)胞)和IL-7水平較未復(fù)發(fā)組和健康對照組均顯著升高，提示NMO復(fù)發(fā)期外周血中CD4+T細(xì)胞再次受到抗原刺激后，活化和增殖狀態(tài)較好。

NMO-IgG在NMO發(fā)病過程中起重要作用。NMO-IgG來源于外周血B細(xì)胞，與星形膠質(zhì)細(xì)胞足突上的水通道蛋白4(AQP4)結(jié)合成免疫復(fù)合物，通過激活補(bǔ)體途徑，破壞突觸細(xì)胞膜的完整性和血腦屏障功能，使郎飛節(jié)周圍和突觸微環(huán)境發(fā)生改變，導(dǎo)致炎癥細(xì)胞浸潤和少突膠質(zhì)細(xì)胞凋亡，從而出現(xiàn)脫髓鞘和軸索損害[9]。血清中NMO-IgG抗體水平在復(fù)發(fā)期和緩解期含量不同，復(fù)發(fā)期含量升高，而緩解期含量下降[10]。因此，我們推測記憶T細(xì)胞再次遇到相同抗原時迅速發(fā)生克隆、增殖，并輔助B細(xì)胞增殖分化為漿細(xì)胞，產(chǎn)生IgG抗體，進(jìn)而導(dǎo)致疾病的復(fù)發(fā)。IL-6、IL-17等細(xì)胞因子在NMO炎癥進(jìn)展中起重要作用[11]。IL-7主要通過與T細(xì)胞、B細(xì)胞及單核細(xì)胞等細(xì)胞上的IL-7受體(IL-7R)結(jié)合發(fā)揮作用，而IL-7Rα(即CD127)可作為記憶T細(xì)胞的標(biāo)志物[12]。本研究顯示，IL-7水平在急性復(fù)發(fā)期顯著增加，且與記憶T細(xì)胞相關(guān)，提示IL-7參與NMO疾病的復(fù)發(fā)，且可以作為疾病進(jìn)展過程的監(jiān)測指標(biāo)。

目前，NMO治療的目的是控制疾病的復(fù)發(fā)或減少復(fù)發(fā)的次數(shù)，從而延緩患者神經(jīng)功能損傷的進(jìn)展。雖然免疫抑制劑已廣泛應(yīng)用于預(yù)防NMO復(fù)發(fā)，但NMO復(fù)發(fā)預(yù)后仍不理想。近年來，一些靶向性藥物也積極應(yīng)用于臨床，如單克隆抗NMO-IgG抗體、中性粒細(xì)胞蛋白抑制劑等[13-14]。但是，記憶T細(xì)胞因其自身特性，對這些治療可能不敏感。記憶T細(xì)胞群體在體內(nèi)穩(wěn)定狀態(tài)的維持主要受控于有γc亞單位的細(xì)胞因子IL-7和IL-15。有研究[15]發(fā)現(xiàn)，阻斷有γc亞單位的細(xì)胞因子受體能抑制記憶T細(xì)胞介導(dǎo)的移植胰島損傷。因此，通過阻斷IL-7與IL-7R的結(jié)合，進(jìn)而減少記憶T細(xì)胞的產(chǎn)生可能為治療NMO提供了新途徑。

綜上所述，NMO的病因及復(fù)發(fā)的病理機(jī)制十分復(fù)雜。本研究結(jié)果提示，記憶T細(xì)胞和IL-7的異常與NMO疾病的復(fù)發(fā)有關(guān)，這為NMO的早期診斷和早期干預(yù)提供了依據(jù)。然而，由于NMO的異質(zhì)性及記憶T細(xì)胞的復(fù)雜性，目前很難確定記憶T細(xì)胞水平正常與異常的臨界值，而且檢測價格昂貴，不適合廣泛應(yīng)用于臨床。此外，目前沒有可靠的手段能在研究中有效地預(yù)防和控制記憶T細(xì)胞的產(chǎn)生。因此，仍需進(jìn)一步明確記憶T細(xì)胞在臨床的應(yīng)用價值，并針對記憶T細(xì)胞采取有效的治療措施。

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[本文編輯] 姬靜芳

Changes of memory T cells and IL-7 level in peripheral blood of patients with relapsing neuromyelitis optica

WANG Jin-tao1, LI Ye1, DONG Li-hua1, SUI Shi-hua1, LI Jia-mei1, ZHENG Jia-ping1*, ZHOU Guang-xi2

1.Department of Neurology, Rizhao People’s Hospital, Rizhao 276800, Shandong, China 2.Department of Neurology, General Hospital of Tianjin Medical University, Tianjin 300052, China

Objective： To observe the changes of memory T cells (CD4+CD45RA-T cell) and IL-7 level in peripheral blood of patients with relapsing or non-relapsing neuromyelitis optica, and discuss the role of memory T cells in NMO relapsing mechanism.Methods： The proportion of CD4+CD45RA-cells in the relapsing NMO group (n=15), the non-relapsing NMO group (n=17) and the healthy control group (n=15) was detected by flow cytometry.Plasma interleukin 7 (IL-7) levels were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) in all 3 groups.The correlation of CD4+CD45RA-cell ratio with IL-7 level in 32 patients was analyzed.Results： The CD4+CD45RA-cell ratio in the relapsing group (32.86±5.53) % was higher than that in the non-relapsing group (19.98±5.72) % and the healthy control group (19.59±4.49) %, and the differences were statistically significant (P<0.01); the ratio in the non-relapsing group was higher than that in the control group, but the difference was not statistically significant.The IL-7 level in the relapsing group([418.73±78.96] pg/mL) was higher than that in the non-relapsing group ([313.33±57.65] pg/mL) and the healthy control group ([303.43±40.48] pg/mL), and the differences were statistically significant (P<0.01); the IL-7 level in the non-relapsing group was higher than that in the healthy control group, but the difference was not statistically significant.The CD4+CD45RA-cell ratio was significantly correlated with IL-7 level in NMO patients (r=0.817,P=0.000).Conclusions： Memory T cells participate in the relapsing process of neuromyelitis optica (NMO), while IL-7 promotes the cytopoiesis and function of memory T cells.

neuromyelitis optica; relapse; memory T cells; IL-7

2016-08-15 [接受日期] 2016-11-18

王金濤, 碩士, 主治醫(yī)師.E-mail: wangjintao819@163.com

*通信作者(Corresponding author).Tel: 0633-3365112, E-mail:rzzjp@126.com

10.12025/j.issn.1008-6358.2017.20160811

R 744.5+2

A