吳 靜， 唐 蕾， 劉立明

（1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122；3.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江南大學(xué)，江蘇 無錫214122）

光滑球擬酵母轉(zhuǎn)錄因子Asg1p調(diào)控魯棒性的生理機制

吳 靜1，2，3， 唐 蕾*1，2， 劉立明1，2，3

（1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122；3.食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江南大學(xué)，江蘇 無錫214122）

為了闡明缺失轉(zhuǎn)錄因子CgAsg1p對光滑球擬酵母魯棒性的影響，通過同源重組的方法構(gòu)建突變菌株Cgasg1△，比較基因缺失突變株在不同條件下的細胞生長、基因轉(zhuǎn)錄水平和對不同脅迫的抵御能力。結(jié)果表明：與野生型菌株wt相比，突變菌株Cgasg1△失去在pH 2.0下的生長能力，轉(zhuǎn)錄因子CgAsg1p在低pH條件下通過改變一系列應(yīng)答基因的轉(zhuǎn)錄水平，影響壓力調(diào)控、氧化還原過程、跨膜轉(zhuǎn)運、DNA復(fù)制、重組和修復(fù)等生物過程，此外，突變菌株Cgasg1△也失去了對氧化脅迫和高滲脅迫的抵御能力。因此，CgAsg1p是光滑球擬酵母抵御多種脅迫的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。

光滑球擬酵母；轉(zhuǎn)錄因子；魯棒性；Asg1p

生物系統(tǒng)在受到外部環(huán)境擾動或內(nèi)部參數(shù)變化等不確定因素干擾時，能夠保持其結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定的一種特性，稱為生物魯棒性[1-2]。光滑球擬酵母（Candida glabrata）作為發(fā)酵生產(chǎn)丙酮酸[3]、富馬酸[4]、蘋果酸[5]、α-酮戊二酸[6]等有機酸的重要工業(yè)微生物，其重要生理特性如目標代謝途徑中的代謝通量穩(wěn)定性、對底物和產(chǎn)物的耐受性，以及應(yīng)對環(huán)境脅迫均涉及生物魯棒性。有機酸發(fā)酵過程中，隨著產(chǎn)物有機酸的積聚，培養(yǎng)液的pH迅速降低，導(dǎo)致菌體生長和產(chǎn)物積累減緩甚至停止[7]。此時一般通過流加堿性物質(zhì)如NaOH等來調(diào)控pH，但隨著堿性物質(zhì)的添加，培養(yǎng)液中的滲透壓不斷增加，也會導(dǎo)致細胞生長和產(chǎn)物積累減緩和停止。目前國內(nèi)外主要通過外源添加輔助底物、誘變育種與基因工程和適應(yīng)性進化等策略提高菌體的脅迫耐受性，從而增加目標產(chǎn)物有機酸的產(chǎn)量。如果能在闡明C.glabrata的脅迫耐受生理機制的基礎(chǔ)上，定向改造菌株的生產(chǎn)性能，則可更加有效的從根本上解決這一科學(xué)難題。

目前關(guān)于C.glabrata脅迫耐受機制的研究尚少。Bairwa等[8]對GPI錨定天冬氨酰蛋白酶的研究發(fā)現(xiàn)光滑球擬酵母可通過 CgYps1調(diào)節(jié)質(zhì)子泵CgPma1的活性以適應(yīng)酸脅迫環(huán)境。此外，研究者們對光滑球擬酵母轉(zhuǎn)錄因子進行的功能鑒定發(fā)現(xiàn)，Msn2p和Msn4p是抵御多種環(huán)境壓力必不可少的轉(zhuǎn)錄因子[9]，Yap1p、Skn7p和Slm7p通過抵御氧化脅迫參與酸脅迫應(yīng)答反應(yīng)[10-11]。鑒于轉(zhuǎn)錄因子在脅迫應(yīng)答反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，本論文中從轉(zhuǎn)錄因子Asg1p著手進行光滑球擬酵母脅迫耐受機制的研究。

轉(zhuǎn)錄因子Asg1p由基因ASG1編碼，敲除釀酒酵母 （Saccharomyces cerevisiae）的基因 ASG1（ScASG1，YIL130W） 或 白 色 念 珠 菌 （Candida albicans） 的 基 因 ASG1（CaASG1，CaO19.166，CaO19.7800）均會使細胞在非發(fā)酵性碳源中的生長能力大大降低[12-13]。通過序列比對分析，發(fā)現(xiàn)C.glabrata中基因ASG1（CgASG1，CAGL0G08844g）的序列與ScASG1和CaASG1分別有50%和39%的相似性。那么CgASG1是否保留了其同源基因在S.cerevisiae和C.albicans中的功能或發(fā)展出其他功能呢？

鑒于轉(zhuǎn)錄因子Asg1p在C.glabrata環(huán)境耐受性中的作用尚未有研究報道，為此，本文通過構(gòu)建光滑球擬酵母突變菌株Cgasg1△，比較基因CgASG1缺失前后菌株在酸脅迫條件下的生長、轉(zhuǎn)錄組水平的變化及其在氧化脅迫和高滲脅迫下的生長，以期理解轉(zhuǎn)錄因子CgAsg1p在調(diào)控C.glabrata魯棒性中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 本課題研究中所涉及的菌株和質(zhì)粒見表1，所使用的引物見表2。

1.1.2 主要試劑和儀器 TaKaRa Taq、Ex Taq、Pyrobest DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、DNA Marker等，購自TaKaRa公司；普通DNA產(chǎn)物純化回收試劑盒、酵母基因組提取試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒，購自生工生物工程（上海）股份有限公司；其它常規(guī)試劑采用進口分裝或國產(chǎn)分析純。C1000型PCR儀，美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；GelDoc EZ型凝膠成像儀，美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；DYY-6D型電泳儀，北京六一儀器廠制造；IQ5型熒光定量PCR儀，美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；UV2450型紫外可見分光光度計，日本Shimadzu公司產(chǎn)品；RF-5310PC型熒光分光光度計，日本Shimadzu公司產(chǎn)品。

表1 作者課題研究所使用的菌株和質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids used in this study

表2 本課題研究中所使用的引物Table 2 Primers used in this study

1.1.3 培養(yǎng)基 1）YPD培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20，蛋白胨20，酵母粉10；2）MM培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20，尿素7，乙酸鈉3，磷酸二氫鈉5，七水硫酸鎂0.8；3）YNB培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20，無氨基酵母氮源6.7；pH 5.2。根據(jù)不同實驗需要更換碳源、加鹽、H2O2或調(diào)整pH；4）LB培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10，酵母粉5，氯化鈉10。以上培養(yǎng)基可加瓊脂粉20 g/L制成相應(yīng)的固體培養(yǎng)基。

1.2 菌株構(gòu)建方法

1.2.1 基因CgASG1的敲除與驗證 基因CgASG1的敲除與驗證按照圖1進行。以C.glabrata ATCC 2001（wild-type strain，wt）的基因組為模板，分別以P1和P2為引物擴增CgASG1的左臂（L），以P3和P4為引物擴增標記基因CgURA3（M），以P5和P6為引物擴增CgASG1的右臂（R）。按照圖1（a）所示原理進行融合PCR構(gòu)建敲除框CgASG1-LMR。通過連接pMD19-T vector、轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細胞，以及測序驗證此敲除框序列的正確性，將大量擴增的高濃度敲除框電擊轉(zhuǎn)化到受體菌株C.glabrata ATCC 55的感受態(tài)細胞中，在基因組上CgASG1序列兩端發(fā)生同源重組，尿嘧啶缺陷型菌株恢復(fù)合成尿嘧啶的能力，經(jīng)不含尿嘧啶、含有組氨酸和色氨酸的MM平板篩選，提取轉(zhuǎn)化子的基因組，按照圖1（b）所示原理以P7/P8和P7/P9為引物進行轉(zhuǎn)化子的驗證。

圖1 突變菌株構(gòu)建及驗證示意圖Fig.1 Construction and verification of the mutant strain

1.2.2 基因CgASG1的回補與驗證 以野生型菌株wt的基因組為模板，以P10和P11為引物擴增基因CgASG1。將該基因序列與表達載體pY13經(jīng)限制性內(nèi)切酶BamH I和EcoR I消化得到相同的粘性末端，連接酶切產(chǎn)物并轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細胞，得到如圖2所示重組質(zhì)粒pY13-CgASG1，通過PCR和雙酶切驗證其正確性。將構(gòu)建好的表達質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化CgASG1缺失菌株的感受態(tài)細胞，獲得質(zhì)粒的細胞可自主合成組氨酸，涂布不含尿嘧啶和組氨酸、含有色氨酸的MM培養(yǎng)基進行篩選，通過質(zhì)粒酶切及表型觀察進行驗證。

圖2 重組質(zhì)粒pY13-CgASG1的結(jié)構(gòu)Fig.2 Structure of expression plasmid pY13-CgASG1

1.3 生長測定方法

1.3.1 平板生長實驗 將待測C.glabrata單菌落接種于20 mL的YNB液體培養(yǎng)基中，30℃搖床培養(yǎng)12 h至對數(shù)生長期，測定菌體濃度并將菌懸液調(diào)節(jié)至OD600=l.0。以此為初始濃度，進行5次10倍梯度稀釋，依次將4 μL菌液點種在待測固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)2 d，觀察菌體的生長情況并記錄。

1.3.2 生長曲線的測定 將待測C.glabrata單菌落接種于20 mL YNB液體培養(yǎng)基中，30℃搖床培養(yǎng)12 h至對數(shù)生長期，將菌液轉(zhuǎn)接至裝有50 mL不同條件的YNB液體培養(yǎng)基中，初始OD600=0.1，每隔一定的時間取樣一次，測菌液在600 nm下的吸光值。以此吸光值為縱坐標，菌體生長時間為橫坐標，比較不同C.glabrata菌株在不同脅迫條件下的生長情況。

1.3.3 細胞活性的測定 取不同時段（間隔2 h）的菌液200 μL，稀釋至適當倍數(shù)（每塊平板上的單菌落數(shù)控制在30～300個）后涂布YPD固體培養(yǎng)基，24 h后進行單菌落計數(shù)，按照式（1）計算得出菌落數(shù)，

上式（1）中：C為菌落數(shù)，個/mL；C0為平板上單菌落數(shù)；d為稀釋倍數(shù)。

1.4 轉(zhuǎn)錄組測序

將菌株wt和Cgasg1△在YNB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h至對數(shù)期，分別轉(zhuǎn)接至YNB和YNB-pH 2.0液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 h，迅速離心菌體并用PBS緩沖液洗滌，于-70℃保存。將以上樣品送至北京百邁客生物科技有限公司進行RNA測序（RNAseq）。

2 結(jié)果與討論

2.1 突變菌株Cgasg1Δ的構(gòu)建及驗證

以C.glabrata基因組為模板，經(jīng)兩次融合PCR將基因CgASG1-L、CgURA3和CgASG1-R連接起來，構(gòu)建敲除框CgASG1-LMR（見圖3（a））。對轉(zhuǎn)化子進行PCR驗證，發(fā)現(xiàn)以P7/P8為引物時，野生菌株wt無條帶產(chǎn)生，轉(zhuǎn)化子獲得1.8 kb左右的片段（基因CgURA3及基因CgASG1的左臂）；以P7/P9為引物時，野生菌株wt獲得4.5 kb左右的片段（基因CgASG1及其左右臂），轉(zhuǎn)化子獲得2.8 kb左右的片段 （基因CgURA3及基因CgASG1的左右臂）（圖3（b））。上述結(jié)果表明基因CgASG1成功被基因CgURA3替換，突變菌株構(gòu)建成功，命名為Cgasg1△。

圖3 突變菌株Cgasg1Δ的構(gòu)建和驗證Fig.3 Construction and verification of the mutant strain Cgasg1Δ

2.2 回補菌株Cgasg1Δ/CgASG1的構(gòu)建及驗證

將擴增得到的基因CgASG1（見圖4（a））通過質(zhì)粒pY13在突變菌株Cgasg1△中表達。經(jīng)質(zhì)粒雙酶切驗證，發(fā)現(xiàn)在5.5 kb（pY13）和2.5 kb（CgASG1）處出現(xiàn)條帶（見圖4（b）），表達質(zhì)粒pY13-CgASG1（見圖2）構(gòu)建成功。對酵母轉(zhuǎn)化子進行菌落PCR驗證，獲得2.5 kb的基因CgASG1（見圖4（c）），回補菌株構(gòu)建成功，命名為Cgasg1△/CgASG1。

圖4 回補菌株Cgasg1Δ/CgASG1的構(gòu)建和驗證Fig.4 Construction and verification of the reconstructed strain Cgasg1Δ/CgASG1

2.3 缺失CgASG1基因?qū)饣驍M酵母酸脅迫耐受性的影響

根據(jù)文獻報道，轉(zhuǎn)錄因子Asg1p在S.cerevisiae和C.albicans中的生理功能是影響非發(fā)酵性碳源中的生長能力[12-13]，那么在C.glabrata中Asg1p是否存在類似功能呢？比較了菌株 wt、Cgasg1△和Cgasg1△/CgASG1在6種不同的非發(fā)酵性碳源平板上的生長情況，結(jié)果如表3所示。突變菌株Cgasg1△在以乙酸鈉、檸檬酸鈉、甘油或乙醇為唯一碳源的YNB培養(yǎng)基上與野生型菌株wt表現(xiàn)出相同的生長情況，但在乙酸和乳酸為唯一碳源的平板上生長微弱。隨后比較了以乙酸和乙酸鈉為唯一碳源時細胞的生長情況，發(fā)現(xiàn)在乙酸為碳源時生長微弱的原因在于乙酸引起的pH下降。為此對比分析了野生型菌株wt和突變菌株Cgasg1△在pH 2.0～8.0時的細胞生長情況，結(jié)果列于表3，發(fā)現(xiàn)突變菌株Cgasg1△在pH 4.0～8.0范圍內(nèi)表現(xiàn)出與野生型菌株相同的生長趨勢，但在pH 3.0時生長受到抑制，而pH 2.0時則無法生長。而回補菌株Cgasg1△/CgASG1在任何培養(yǎng)基上均表現(xiàn)出與野生型菌株wt相同的生長表型（見表3）。上述結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄因子CgAsg1p在C.glabrata抵御酸脅迫中發(fā)揮著重要作用。

比較了pH 2.0條件下野生型菌株wt、突變菌株Cgasg1△的細胞活性變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)野生型菌株wt的細胞活性隨著時間緩慢增長，12 h時比0 h增加了20倍，而突變菌株Cgasg1△在pH 2.0時的細胞活性則隨著培養(yǎng)時間迅速降低，12 h時降低了90%（見表4）。以上結(jié)果進一步證實了缺失CgASG1基因降低了C.glabrata對酸性環(huán)境的耐受能力。

表3 不同條件下光滑球擬酵母菌株的生長表型Table 3 Phenotypes of Candida glabrata strains under various conditions

表4 野生型菌株wt和突變菌株Cgasg1Δ在YNB-pH 2.0中的菌落數(shù)Table 4 Number of colonies of wt and Cgasg1Δ strains in YNB-pH 2.0 medium

2.4 缺失CgASG1基因?qū)饣驍M酵母轉(zhuǎn)錄組水平的影響

將野生菌株wt和突變菌株Cgasg1△分別用pH 5.2和pH 2.0進行處理，然后進行轉(zhuǎn)錄組測序，結(jié)果如圖5所示。與野生菌株wt相比，突變菌株Cgasg1△中轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生顯著差異的基因主要參與壓力調(diào)控、氧化還原過程、跨膜轉(zhuǎn)運、ATP酶活性、細胞分裂、DNA復(fù)制、重組和修復(fù)等相關(guān)的生物過程。其中，1）作為氧化應(yīng)激反應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子Skn7p的靶基因，TRR1通過影響硫氧還蛋白還原酶的活性調(diào)節(jié)氧化還原平衡[14-15]；2）Dad2p是復(fù)合物Duo1p-Dam1p-Dad1p的一個亞基，基因DAD2和DUO1轉(zhuǎn)錄水平的變化直接影響復(fù)合物連接著絲粒以及定位到紡錘體，進而影響細胞分裂[16-17]；3）Pol2是DNA損傷時用于末端修復(fù)的一種主要的DNA聚合酶[18]，Csm3可與另兩種蛋白質(zhì)Tof1和Mrc形成復(fù)合物，當DNA合成受阻時抑制用于復(fù)制的MCM解旋酶活性[19]，基因POL2和CSM3轉(zhuǎn)錄水平的變化影響DNA復(fù)制及修復(fù)。上述結(jié)果表明，缺失CgASG1基因改變了上述相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平，降低了光滑球擬酵母對酸脅迫的抵御能力。

綜上，C.glabrata中的轉(zhuǎn)錄因子Asg1p不參與細胞對非發(fā)酵性碳源的利用過程，但是在生物魯棒性的維持中發(fā)揮重要作用。缺失基因CgASG1，光滑球擬酵母在酸性環(huán)境中的生長能力降低，原因有：1）酸性條件下ATPase活性相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平變化，使得細胞泵出質(zhì)子的能力降低，胞內(nèi)質(zhì)子積累，pH降低引起胞內(nèi)ROS含量升高[20]，進而導(dǎo)致胞內(nèi)代謝紊亂[21]；2）氧化還原相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的變化影響胞內(nèi)氧化還原電勢，進而改變細胞生長[22]；3）缺少轉(zhuǎn)錄因子CgAsg1p，酸性環(huán)境下影響DNA復(fù)制、重組和修復(fù)，使細胞無法維持基因組穩(wěn)定而導(dǎo)致活性降低[23]等?；诖搜芯恐邪l(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子CgAsg1p參與的生物過程，為了深入解析該轉(zhuǎn)錄因子的作用機制，下一步將從CgAsg1p直接作用的靶基因著手，通過蛋白質(zhì)免疫共沉淀后測序，分析CgAsg1p結(jié)合的每一個靶基因，描繪該轉(zhuǎn)錄因子參與的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

圖5 酸脅迫下轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生顯著變化的基因Fig.5 Significantly regulated genes in response to acid stress

2.5 缺失CgASG1基因?qū)饣驍M酵母氧化和高滲脅迫耐受性的影響

缺失CgASG1基因是否也會降低光滑球擬酵母抵御其他脅迫的能力呢？研究菌株wt、Cgasg1△和Cgasg1△/CgASG1在無脅迫（YNB）、氧化脅迫（YNB+ 4 mmol/L H2O2）及高滲脅迫（YNB+1.2 mol/L NaCl）下的生長，如圖6所示，發(fā)現(xiàn)：1）突變菌株Cgasg1△在無脅迫時與野生型菌株wt表現(xiàn)出相同的生長情況，但在氧化脅迫和高滲脅迫時的生長受到明顯抑制；2）野生型菌株wt在氧化脅迫和高滲脅迫時的生長分別降低56%和62%，突變菌株Cgasg1△分別降低69%和71%；3）與野生型菌株wt相比，突變菌株Cgasg1△在無脅迫時的生長降低16%，在氧化脅迫時降低40%，在高滲脅迫時降低35%。上述結(jié)果表明，基因CgASG1缺失不僅降低了C.glabrata對酸性環(huán)境的耐受能力，還降低了對氧化脅迫和高滲脅迫的抵御能力。

圖6 菌株wt、Cgasg1Δ和Cgasg1Δ/CgASG1在氧化脅迫和高滲脅迫下的生長比較Fig.6 Growth of wt，Cgasg1Δ and Cgasg1Δ/CgASG1 under peroxide stress and hyperosmotic stress

3 結(jié)語

文中以菌株C.glabrata ATCC 55為出發(fā)菌株，通過敲除基因CgASG1，并比較不同條件下細胞生長、轉(zhuǎn)錄水平變化及對不同脅迫的抵御能力，闡釋了轉(zhuǎn)錄因子CgAsg1p在光滑球擬酵母維持魯棒性中的生理功能：1）幫助維持低pH條件下的生長能力；2）調(diào)控參與氧化還原、跨膜轉(zhuǎn)運、DNA復(fù)制、重組和修復(fù)等過程的基因以參與酸脅迫應(yīng)答反應(yīng)；3）幫助維持氧化脅迫、高滲脅迫等環(huán)境下的生長?；谧髡哒n題研究中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子CgAsg1p在調(diào)控光滑球擬酵母抵御酸脅迫、氧化及高滲脅迫中的重要功能，可通過增加或減少轉(zhuǎn)錄因子CgAsg1p及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵基因的表達水平，以提高發(fā)酵生產(chǎn)有機酸過程中菌體對脅迫環(huán)境的耐受能力、增加有機酸的產(chǎn)量。

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Physiological Mechanism of Transcription Factor Asg1p for the Regulation of Robustness of Candida glabrata

WU Jing1，2，3， TANG Lei*1，2， LIU Liming1，2，3
（1.SchoolofBiotechnology，Jiangnan University，Wuxi214122，China；2.Key Laboratory ofIndustrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；3.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

To analyze the effect of transcription factor CgAsg1p on the robustness of Candida glabrata，the mutant strain Cgasg1△was constructed and the cell growth，gene transcriptional level and the ability of resisting various stresses were investigated.Compared to the wild-type strain C. glabrata ATCC 2001，the mutant strain Cgasg1△lost the ability of surviving in the medium at pH 2.0. CgAsg1p changed the transcription level ofseveral response genes，influencingstressregulation，redox process，transmembrane events，DNA replication，recombination and repair，etc.Besides，the mutant strain Cgasg1△lost the ability of resisting oxidative stress and hyperosmotic stress.These results indicatedthatCgAsg1pisanessentialtranscriptionfactorinC.glabrata forvariousstressresponses.

Candida glabrata，transcription factor，robustness，Asg1p

Q 935

A

1673—1689（2017）02—0156—08

2015-04-17

國家自然科學(xué)基金項目（31270079）；江南大學(xué)自主科研計劃重點項目（JUSRP51303A）。

*通信作者：唐 蕾（1966—），女，江蘇無錫人，工學(xué)博士，教授，主要從事代謝調(diào)控與酶技術(shù)方面的研究。E-mail：ltang@jiangnan.edu.cn

吳靜，唐蕾，劉立明.光滑球擬酵母轉(zhuǎn)錄因子Asg1p調(diào)控魯棒性的生理機制[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報，2017，36（02）：156-163.