Bernard Gitura Kimani， 楊套偉， 饒志明*， 張 顯， 徐美娟， 和 斐

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇無錫214122；2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無錫214122）

一種堿性γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶在Bacillus subtilis 168中的分泌表達與酶學(xué)性質(zhì)分析

Bernard Gitura Kimani1，2， 楊套偉1，2， 饒志明*1，2， 張 顯1，2， 徐美娟1，2， 和 斐1，2

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇無錫214122；2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇無錫214122）

將γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（GGT）在Bacillus subtilis 168同源過量表達，發(fā)現(xiàn)該酶能夠自動分泌到細(xì)胞外，且重組菌酶活比原始菌提高了3 568倍。通過SDS-PAGE分析發(fā)酵液上清液發(fā)現(xiàn)，該γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶是由一個相對分子質(zhì)量為42 000的大亞基和一個22 000的小亞基組成。通過酶學(xué)性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，該γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶是一個耐堿性的酶，最適反應(yīng)pH為10；同時該酶具有良好的耐熱性，最適反應(yīng)溫度達到50℃；另外，加入5.0 mmol/L的Mg2+、Ca2+、K+、La3+、Li+和 NH4+對GGT轉(zhuǎn)肽活力具有明顯的促進作用，其中添加的NH4+對GGT活力促進作用最為顯著，GGT活力提高45%以上，而Cu2+和Zn2+則對其具有抑制作用。

γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶；分泌表達；酶學(xué)特征；Bacillus subtilis 168

γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶 （γ-glutamyltranspeptidase，GGT，EC：2.3.2.2）屬于N-端親和水解酶系，普遍存在于生物體內(nèi)[1]，參與體內(nèi)谷胱甘肽的代謝，在抗氧化方面具有非常重要的作用[2]。GGT主要催化谷胱甘肽或其他含γ-谷氨酰的化合物中的γ-谷氨?；鶊F轉(zhuǎn)移至其他氨基酸等受體，形成新的含γ-谷氨酰基的氨基酸[3]。哺乳動物體內(nèi)的GGT鑲嵌在細(xì)胞膜中，而作用位點位于細(xì)胞膜外部[4]，而細(xì)菌體內(nèi)的GGT一般分布于細(xì)胞周質(zhì)中或分泌到細(xì)胞外，如芽孢桿菌合成的GGT基本全部分泌到胞外[1，5]。所有的GGT均由單個基因編碼合成一條多肽鏈，然后分裂成含有兩個大小亞基的成熟酶，大亞基相對分子質(zhì)量約38 000～72 000，而小亞基相對分子質(zhì)量一般22 000～66 000[6]。

據(jù)報道，GGT主要用于合成多種食品及醫(yī)藥功能性γ-谷氨?；衔?，例如L-茶氨酸、谷氨?；；撬帷ⅵ?L-谷氨?；?L-多巴、γ-L-谷氨?；?L-色氨酸等[7]，其中研究最廣泛的是合成L-茶氨酸。目前，大部分來自細(xì)菌的GGT通常在E.coli中過量表達和酶學(xué)表征，而在枯草芽孢桿菌（B.subtilis）中的研究還比較少。另外，近年來研究發(fā)現(xiàn)，L-茶氨酸具有鎮(zhèn)靜減壓、增強免疫力和預(yù)防腫瘤等重要作用，因此常作為食品添加劑為人類健康服務(wù)。目前，大部分研究是將GGT在E.coli中過量表達和合成L-茶氨酸[8-9]，但是，E.coli并不是食品安全菌株，因此并不符合食品安全生產(chǎn)的要求。而枯草芽孢桿菌是被美國FDA認(rèn)可的安全菌株[10]，因此，利用枯草芽孢桿菌構(gòu)建L-茶氨酸生產(chǎn)菌更符合食品安全生產(chǎn)的要求。另外，E.coli中的GGT一般是周質(zhì)空間蛋白質(zhì)，不利于分離純化；而枯草芽孢桿菌的GGT是胞外酶，分離純化步驟簡單、操作成本低。本研究首先將GGT克隆到B.subtilis168進行分泌表達，同時對其酶學(xué)性質(zhì)進行分析，為后續(xù)用于合成L-茶氨酸提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株和質(zhì)粒

Bacillus subtilis168和E.coli JM109為作者所在研究室保藏菌株；基因ggt來源B.subtilis168，同時B.subtilis168也是基因ggt過量表達的宿主菌；載體pMD18-T，購自大連寶公司，用于ggt克??；質(zhì)粒pMA5為作者所在研究室保藏，用于ggt在B.subtilis168中的過量表達。

1.2 基因ggt克隆與表達載體pMA5-ggt的構(gòu)建

首先，根據(jù)NCBI公布的B.subtilis168的ggt基因設(shè)計以下2條引物：

P1：5’-ATCGGATCCATGAAAAGAACGTGGAA C-3’（BamHI）

P2：5’-GGCACGCGTTTATTTACGTTTTAAATT AA-3’（MluI）

以上引物由上海生工生物工程有限公司合成并測序驗證。然后采用Ezup細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（上海生工生物工程有限公司）獲得的B.subtilis168基因組DNA為模板，利用引物P1和P2通過PCR擴增獲得。

PCR擴增體系50 μL：B.subtilis168基因組模板2 μL，10X buffer 5 μL，dNTP 4 μL，引物P1、P2各0.5 μL，ExTaqDNA聚合酶0.5 μL，ddH2O 37.5 μL。

ggt基因PCR擴增條件：94℃預(yù)變性5 min，95℃變性10 s，56℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，30個循環(huán)，最后72℃延伸10 min，4℃保溫。

PCR反應(yīng)產(chǎn)物用0.8 g/dL的瓊脂糖凝膠電泳分離，用膠回收試劑盒（Takara）回收目的條帶，回收的基因片段與pMD18-T連接，轉(zhuǎn)化E.coli JM109，經(jīng)過氨芐青霉素抗性平板篩選，挑取陽性轉(zhuǎn)化子。提取質(zhì)粒酶切驗證，重組質(zhì)粒命名為T-ggt，擴增獲得的DNA測序驗證由上海生工生物工程有限公司完成。經(jīng)測序驗證正確的重組質(zhì)粒T-ggt，用BamHI和MluI雙酶切后，與經(jīng)過相同酶切的pMA5質(zhì)粒連接，構(gòu)建表達載體pMA5-ggt。

1.3 在B.subtilis168中的表達

首先，取1 μLpMA5-ggt通過化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至B.subtilis168中[11]，挑取陽性轉(zhuǎn)化子單菌落接種于10 mL含有50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃、160 r/min培養(yǎng)10 h，然后以6%的接種體積分?jǐn)?shù)轉(zhuǎn)接于50 mL含有25 g蔗糖，5 g蛋白胨，15 g玉米漿，0.5 g MgSO4·7H2O和1 g K2HPO4·3H2O（pH 7.2）的發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min培養(yǎng)60 h。

1.4 GGT純化與表達分析

將培養(yǎng)60 h的菌液在4℃、10 000 g離心30 min，上清液采用0.45 μm濾膜過濾后，采用Ni-NTA蛋白純化柱純化目的蛋白質(zhì)，經(jīng)過兩次上樣，蛋白質(zhì)末端的6個His與Ni-NTA的金屬離子進行螯合。洗脫過程：首先用不含有咪唑的緩沖液洗柱，除去未與Ni-NTA結(jié)合的細(xì)胞體及雜蛋白質(zhì)，然后用不同濃度的咪唑（20～300 mmol/L）緩沖液進行梯度洗脫，在一定的咪唑濃度條件下，可以得到較純的酶液。利用SDS-PAGE分析GGT表達及純化情況，首先用5 g/dL的濃縮膠及12～15 g/dL分離膠的不連續(xù)垂直平板電泳進行蛋白質(zhì)分離，然后用考馬斯亮蘭R-250染色?？偟鞍踪|(zhì)質(zhì)量濃度采用Brandford方法，以牛血清蛋白（BSA）作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)[12]。

1.5 GGT酶活力測定

GGT酶活力采用分光光度計法測定[13]。反應(yīng)體系 （1 mL）：2.5 mmol/L γ-谷氨酰對硝基苯胺，60 mmol/L雙甘二肽，750 mmol/L NaCl，50 mmol/L硼酸-NaOH（pH 10），10 μl適當(dāng)稀釋的酶液，在37℃反應(yīng)10 min后，加入2 mL 3.5 mol/L的醋酸溶液終止反應(yīng)，在410 nm處測定吸光值。該條件下每分鐘生成1 μmol γ-谷氨酰對硝基苯胺所需的酶量定義為一個酶活單位。

1.6 酶學(xué)性質(zhì)分析

1.6.1 最適反應(yīng)pH及pH穩(wěn)定性 將酶液分別置于pH 8～11的緩沖液中，在37℃反應(yīng)10 min后測定剩余酶活力，確定其最適反應(yīng)pH。另外，將酶液分別置于pH 3～12的緩沖液中，在37℃反應(yīng)20 h后，測定剩余酶活力，考察其pH穩(wěn)定性。

1.6.2 最適反應(yīng)溫度及溫度穩(wěn)定性 確定最適pH后，將酶液分別置于20～70℃條件測定酶活力，確定其最適反應(yīng)溫度。另外，將酶液分別置于50、60、70℃條件下測定酶活力，考察其溫度穩(wěn)定性。

1.6.3 各種陽離子對GGT酶活的影響 將酶液分別置于含有5.0 mmol/L的Mg2+、Ca2+、K+、Ba2+、La3+、Li+、Cu2+、Zn2+、NH4+的溶液中，在37℃反應(yīng)10 min后，測定剩余酶活力，考察各種陽離子對GGT活力的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因克隆及其表達載體的構(gòu)建

提取B.subtilis 168的基因組DNA為模板，以P1/P2引物進行PCR擴增，獲得包含18 bp His的GGT基因，基因大小與NCBI報道的一致 （見圖1（a）），將該基因克隆到pMD-18T載體上，獲得T-ggt重組質(zhì)粒。隨后將T-ggt轉(zhuǎn)化至E.coli JM109中，提取質(zhì)粒，經(jīng)酶切和基因序列測序驗證（見圖1（b）），保證所克隆基因序列及酶切位點的準(zhǔn)確性。重組表達載體構(gòu)建示意圖如圖1（c）所示：將驗證正確的載體T-ggt經(jīng)BamHI和MluI酶切，膠回收獲得的ggt基因與經(jīng)同樣酶切的pMA5質(zhì)粒連接，成功構(gòu)建重組表達載體pMA5-ggt，并且轉(zhuǎn)化至B.subtilis 168，并提取質(zhì)粒進行酶切驗證 （見圖1（d）），確保重組菌構(gòu)建成功。

圖1 ggt基因克隆及其表達載體pMA5-ggt的構(gòu)建Fig.1 Amplification of ggt gene and construction of pMA5-ggt recombinant vector

2.2 重組菌B.subtilis 168/pMA5-ggt表達

重組表達載體pMA5-ggt轉(zhuǎn)化B.subtilis 168，成功獲得重組菌B.subtilis 168/pMA5-ggt，挑取單菌落接種于10 mL含有50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃、160 r/min培養(yǎng)10 h，然后以體積分?jǐn)?shù)6%的接種量轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃、200 r/min培養(yǎng)60 h。菌液在4℃、10 000 g條件下離心30 min。由表1可知，重組菌胞外酶活為26.464 U/mL，比原始菌（0.007 415 U/mL）提高了3 568倍，且81%以上的GGT被分泌到胞外，說明GGT在B.subtilis 168中成功過量分泌表達。然后將上清液進行蛋白質(zhì)電泳分析，結(jié)果如圖2所示，產(chǎn)物在42 000和 22 000處有條帶，與研究報道[17]的B.subtilis GGT大小亞基的相對分子質(zhì)量及序列預(yù)測的相對分子質(zhì)量相似，總相對分子質(zhì)量約64 000。

表1 GGT在重組枯草芽孢桿菌過量表達分析Table 1 GGT production in recombinant B.subtilis

2.3 重組GGT分離純化

由于在重組蛋白質(zhì)GGT的N端加入了6個組氨酸標(biāo)簽，因此，可以采用Ni-NTA一步純化獲得目的蛋白質(zhì)。離心獲得的上清液采用0.45 μm濾膜過濾后，采用Ni-NTA蛋白純化柱純化獲得電泳純的目的蛋白質(zhì)。重組酶純化步驟及結(jié)果如表2所示，重組GGT純化倍數(shù)為2.57倍，回收率為21.9%，重組GGT的比酶活為49.8 U/mg。對純化的酶進行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖2所示，重組酶在42 000和22 000處有條帶，總相對分子質(zhì)量約64 000，而基本上沒有其它條帶，說明成功獲得電泳純的重組酶。

表2 重組GGT純化步驟及結(jié)果分析Table 2 Purification summary of GGT

圖2 重組GGT純酶SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE of the purified GGT

2.4 重組GGT酶學(xué)性質(zhì)

基于獲得的電泳純重組酶，對其進行酶學(xué)性質(zhì)研究，包括最適反應(yīng)pH及pH穩(wěn)定性、最適反應(yīng)溫度及溫度穩(wěn)定性，以及各種離子對其活力的影響。

2.4.1 最適反應(yīng)pH及pH穩(wěn)定性 環(huán)境pH對酶的催化活性具有較大的影響，環(huán)境過酸或過堿都有可能導(dǎo)致酶發(fā)生不可逆變性失活，只有在最適pH環(huán)境中，才能保證酶和底物處于最佳解離狀態(tài)，最適宜相互作用，從而達到最佳的催化效果。因此，首先研究了GGT催化的最適反應(yīng)pH及pH穩(wěn)定性。結(jié)果如圖3（a）所示。GGT轉(zhuǎn)肽催化最適pH為10.0，在pH 9.0～10.5范圍內(nèi)，GGT保持80%以上的活力，而當(dāng)pH＜9或pH＞10.5，GGT轉(zhuǎn)肽催化活力迅速下降至50%以下，說明該酶催化范圍比較窄。而當(dāng)pH為8.0時，GGT僅保持25%的活力，說明該酶對酸性環(huán)境非常敏感。由圖3（b）所示，GGT在pH 5～12范圍內(nèi)保存20 h后，剩余酶活力達到80%以上，說明GGT在pH 5～12范圍內(nèi)穩(wěn)定性良好，同時說明該酶具有較寬泛的pH耐受范圍；然而，當(dāng)環(huán)境pH低于5時，保存20 h后酶活力迅速下降，說明該酶在強酸性環(huán)境中穩(wěn)定性較差。綜上所述，該GGT在堿性條件下能夠充分發(fā)揮作用，而合成茶氨酸過程中涉及到轉(zhuǎn)肽反應(yīng)。堿性環(huán)境最有利于轉(zhuǎn)肽反應(yīng)，因此，該堿性GGT非常適合用于茶氨酸的合成。

圖3 重組GGT最適pH及pH穩(wěn)定性Fig.3 Effect of pH on activity and stability of GGT

2.4.2 最適反應(yīng)溫度及溫度穩(wěn)定性 環(huán)境溫度是影響酶催化效率的另一個重要因素。一般來說，溫度過低時，酶的活性也較低，酶的催化效率也隨之降低；適度提高溫度可以提高酶催化效率，而溫度過高會使酶發(fā)生不可逆的變性失活。因此，只有保持合適的溫度才能保證酶高效的催化作用。溫度對GGT活力的影響如圖4所示，GGT最適作用溫度為50℃，而當(dāng)溫度低于或高于50℃，GGT活力迅速下降，說明GGT對環(huán)境溫度的變化非常敏感，而其溫度作用范圍也較窄，只是在50℃左右才能保持較高的活力。隨后，考察了GGT的熱穩(wěn)定性，結(jié)果如圖5（a）所示，GGT在溫度低于50℃表現(xiàn)出良好的熱穩(wěn)定性，即使在較高溫度50℃條件下（見圖5（b））連續(xù)保存6 h，仍保留85%以上的酶活力；而當(dāng)環(huán)境溫度高于50℃時，GGT的熱穩(wěn)定性迅速下降，如溫度升高至60℃時，GGT活力的半衰期只有12 min，在此條件下保存30 min，GGT殘留活力已經(jīng)降至30%以下。當(dāng)繼續(xù)升高溫度至70℃時，GGT活力在10 min內(nèi)下降至10%以下。說明當(dāng)環(huán)境溫度高于60℃時就可以使GGT快速變性失活。

圖4 溫度重組GGT活力的影響Fig.4 Effect of temperature on activity and thermostability of GGT

圖5 重組GGT熱穩(wěn)定性研究Fig.5 Effect of temperature on GGT thermostability

2.4.3 各種陽離子對GGT酶活的影響 金屬離子對酶活力具有重要的影響，有的金屬離子可以顯著提高酶的活力，而有些離子則會嚴(yán)重抑制酶的催化活力。因此，考察以下常見離子Mg2+、Ca2+、K+、Ba2+、La3+、Li+、Cu2+、Zn2+、NH4+對GGT轉(zhuǎn)肽活力的影響。結(jié)果如圖6所示，與對照組添加任何不外源離子的相比較，Cu2+和Zn2+對GGT活力具有明顯抑制作用，加入5.0 mmol/L的Cu2+或Zn2+時，GGT活力下降了20%以上；而5.0 mmol/L的Ba2+對GGT轉(zhuǎn)肽活力基本沒有影響；而同樣質(zhì)量濃度的Mg2+、Ca2+、K+、La3+、Li+和 NH4+對GGT轉(zhuǎn)肽活力具有明顯的促進作用，其中添加5.0 mmol/L的NH4+對GGT活力促進作用最為顯著，GGT活力提高45%以上。Shuai等（2011）報道發(fā)現(xiàn)添加Ca2+、K+、Mg2+等能夠提高GGT活力，而添加Cu2+和Zn2+則會抑制GGT活力。而作者首次發(fā)現(xiàn)添加鑭系元素（La3+）對GGT活力具有促進作用。

圖6 金屬離子對GGT活力的影響Fig.6 Effect of ions on GGT activity

2.4.4 來源于芽孢桿菌屬GGT酶學(xué)性質(zhì)特征比較目前已報道的GGT基本都是來源于枯草芽孢桿菌，而GGT來源的菌株不同，酶學(xué)性質(zhì)也會存在差別。本研究中對來源于不同枯草芽孢桿菌的GGT酶學(xué)性質(zhì)特征進行比較，結(jié)果如表3所示。Ogawa等在1991年報道了來源于枯草芽孢桿菌的GGT特征，發(fā)現(xiàn)該GGT由兩個不同大小的亞基組成，總相對分子質(zhì)量約為62 000，這與本研究及Shuai等發(fā)現(xiàn)的GGT相對分子質(zhì)量基本一致，而Wu等則發(fā)現(xiàn)來源于B.subtilis NX-2的GGT具有較大的相對分子質(zhì)量，約為75 000。通過考察最適作用pH發(fā)現(xiàn)，不同芽孢桿菌來源最適作用pH存在一定差異，最適pH在 7.0～10.0之間。而本研究中來源于菌株 B. subtilis 168和 Shuai等發(fā)現(xiàn)的來源于 B.subtilis SK11.004的GGT均為堿性GGT，最適pH為10。但是，本研究報道的GGT最適作用溫度（50℃）高于Shuai等[14]發(fā)現(xiàn)的來源于 B.subtilis SK11.004的GGT的最適作用溫度 （37℃），而目前已報道的GGT最適作用溫度在37～60℃之間。

表3 不同來源的芽孢桿菌GGT酶學(xué)性質(zhì)特征比較Table 3 Comparison of biochemical properties of GGTs from different Bacillus sp.

3 結(jié)語

本文首次報道將來源于枯草芽孢桿菌的GGT在B.subtilis 168進行同源過量表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該酶大部分都被分泌到細(xì)胞外（見表1），這為后續(xù)酶的分離純化提供了便利，降低了分離純化的成本。通過對來源于B.subtilis 168的GGT酶學(xué)性質(zhì)的研究，發(fā)現(xiàn)該酶最適反應(yīng)溫度達到50℃，而在低于50℃的環(huán)境中具有良好的熱穩(wěn)定性，有利于后續(xù)催化反應(yīng)操作的連續(xù)性，進而提高產(chǎn)物產(chǎn)量。另外，研究發(fā)現(xiàn)，該GGT是一種堿性酶，在催化L-谷氨酰胺合成L-茶氨酸的過程中，需要加入乙胺，從而造成反應(yīng)體系pH升高，為了使催化反應(yīng)快速有效進行，需要加入大量鹽酸調(diào)節(jié)pH。而本文報道的GGT最適反應(yīng)pH為10，屬于較強堿性環(huán)境。因此，用本課題研究的GGT催化L-谷氨酰胺合成L-茶氨酸時，與最適反應(yīng)pH＜10的GGT比較，需要添加較少量的鹽酸即可進行有效催化反應(yīng)，從而降低生產(chǎn)成本。因此，本文報道的堿性GGT更具有工業(yè)應(yīng)用價值。在后續(xù)研究中，作者將對該GGT催化L-谷氨酰胺合成L-茶氨酸催化條件深入研究，進一步提升其工業(yè)化合成L-茶氨酸的應(yīng)用價值。

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Homologous Cloning and Characterization of Bacillus subtilis 168 γ-Glutamyltranspeptidase

Bernard Gitura Kimani1，2， YANG Taowei1，2， RAO Zhiming*1，2， ZHANG Xian1，2， XU Meijuan1，2， HE Fei1，2
（1.Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Gammaglutamyltranspeptidase gene from Bacillussubtilis168 was cloned and overexpressed with pMA5 vector in Bacillus subtilis 168 for overproduction of GGT.GGT was secreted in the extracellular space.The overexpressed enzyme was 3568 fold higher in activity than that from the parent strain and exhibited a specific transpeptidase activity of 49.8 U/mg.The molecular mass of two sub-units was estimated to be 42 000 and 22 000 respectively，by SDS-PAGE. The overexpressed GGT was a very versatile enzyme in alkaline pH.Its optimal temperature was 50℃ showing a moderately high thermostability.The effect of ions on purified GGT was also examined.Results showed that NH4+had the highest activation effect on GGT（＞45%），other ions such as Ca2+、K+、Mg2+、Li+and La3+had a significant activation effect on the enzyme，whereas Cu2+and Zn4+recorded the highest deactivation on GGT activity.

γ-Glutamyltranspeptidase，homologous cloning，enzymatic characterization，Bacillus subtilis 168

Q 78

A

1673—1689（2017）02—0149—07

2015-04-17

國家973計劃項目（2012CB725202）；國家863計劃項目（2015AA021004）；國家自然科學(xué)基金項目（31400082）；教育部重點項目（113033A）；江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項目。

*通信作者：饒志明（1975—），男，江西臨川人，農(nóng)學(xué)博士，教授，博士研究生導(dǎo)師，主要從事工業(yè)微生物育種發(fā)酵代謝方面的研究。

E-mail：raozhm@jiangnan.edu.cn

Bernard Gitura Kimani，楊套偉，饒志明，等.一種堿性γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶在Bacillus subtilis 168中的分泌表達與酶學(xué)性質(zhì)分析[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報，2017，36（02）：149-155.