李 瑩， 孫秀蘭， 張銀志

（1.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；2.食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無(wú)錫 214122）

基于量子點(diǎn)/抗體探針采用電化學(xué)方法檢測(cè)水中微囊藻毒素

李 瑩1， 孫秀蘭1， 張銀志*2

（1.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122；2.食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無(wú)錫 214122）

用量子點(diǎn)偶聯(lián)微囊藻毒素抗體作為探針，經(jīng)過(guò)間接競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)之后，通過(guò)方波溶出伏安法測(cè)定Cd2+的濃度，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)水中微囊藻毒素含量的檢測(cè)。分別對(duì)緩沖液pH、濃度、沉積電位、沉積時(shí)間等因素進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：Cd2+在-0.768 V左右會(huì)出現(xiàn)一個(gè)靈敏的溶出峰，在最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行檢測(cè)，峰電流值與微囊藻毒素濃度的對(duì)數(shù)值在一定范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性范圍在0.1～8 μg/L之間，線性方程為y=-196.66x+242.15，相關(guān)系數(shù)R2=0.992 45，檢出限為0.08 μg/L，加標(biāo)回收率為91.0%～108.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.97%～6.98%。

微囊藻毒素；量子點(diǎn)；鎘離子；方波溶出伏安法

近年來(lái)，隨著工農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展，水體富營(yíng)養(yǎng)化程度日益加劇，使得藻類植物大量繁殖。藻細(xì)胞死亡后會(huì)向水中釋放體內(nèi)毒素，其中以微囊藻毒素（microcystin，MC）最為常見(jiàn)。大量研究表明，MC具有強(qiáng)烈的毒性，嚴(yán)重威脅動(dòng)植物及人類的健康。WHO規(guī)定飲用水中微囊藻毒素（MC-LR）的含量不得超過(guò)1 μg/L[1-3]。但是由于MC化學(xué)性質(zhì)較為穩(wěn)定，具有耐高溫、耐pH值變化、水溶性好等特點(diǎn)，使得MC很難被去除[4]，因此建立起快速有效的檢測(cè)方法顯得尤為重要。常見(jiàn)的ML檢測(cè)方法有HPLC，LC-MS等，但因前處理復(fù)雜、儀器昂貴、操作復(fù)雜、耗時(shí)長(zhǎng)等原因[5-7]，一定程度上限制了它們的應(yīng)用推廣。量子點(diǎn)（Quantum dots，QDs），是一類由II—VI族（如 CdSe、CdTe、ZnSe、CdS等）或 III—V族 （如InAs、InP等）以及Si等元素組成的均一或核殼結(jié)構(gòu)的納米顆粒，是近年發(fā)展起來(lái)的一種新型納米材料。它具有激發(fā)光譜寬、發(fā)射光譜窄、光穩(wěn)定性好等眾多優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)吸引越來(lái)越多研究者的注意[8-9]。

本文中首先通過(guò)水相制備CdTe量子點(diǎn)，然后將其與微囊藻毒素抗體通過(guò)EDC偶聯(lián)，經(jīng)過(guò)間接競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)之后，用硝酸將量子點(diǎn)中的Cd2+溶出，最終通過(guò)方波溶出伏安法（SWSV）對(duì)Cd2+進(jìn)行檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)微囊藻毒素的定量分析。該方法將抗原抗體特異性反應(yīng)與電化學(xué)的便捷性相結(jié)合，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速方便等優(yōu)點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

碲粉（質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.9%），CdCl2·2.5H2O，硼氫化鈉（質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞96%），1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC），巰基乙酸，十二烷基磺酸鈉，丙烯酰胺，N-N亞甲基雙丙烯酰胺，TEMED，過(guò)硫酸銨，考馬斯亮藍(lán)R-250，甲醇，甘氨酸，濃硝酸等，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；所用試劑為分析純，實(shí)驗(yàn)用水均為超純水；緩沖溶液等，由實(shí)驗(yàn)室配制；微囊藻毒素標(biāo)準(zhǔn)品及抗原，購(gòu)自Sigma公司，抗體為作者所在實(shí)驗(yàn)室免疫所得；洗滌液為含有體積分?jǐn)?shù)0.05%Tween-20的PBS（pH 7.4），封閉液為含有3 g/dL BSA的PBS溶液。

1.2 儀器

CHl660D型電化學(xué)工作站，上海辰華儀器有限公司產(chǎn)品；三電極系統(tǒng)：玻碳電極為工作電極，鉑絲電極為對(duì)電極，飽和甘汞電極為參比電極；KQ-50E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；TecnaiG2F20s-TWIN型透射電鏡，美國(guó)FEI公司產(chǎn)品；Tanon GLS-2010型凝膠成像儀，上海天能科技有限公司產(chǎn)品；PB-10/C型標(biāo)準(zhǔn)型PH計(jì)，上海精密儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 量子點(diǎn)的制備及與抗體的偶聯(lián) 稱取120 mg硼氫化鈉，溶于5 mL超純水中，在氮?dú)獾谋Ｗo(hù)下快速加入40 mg碲粉，常溫磁力攪拌直至黑色碲粉完全溶解，反應(yīng)液最終為無(wú)色（或粉紅色）透明。稱取0.145 g CdCl2·2.5H2O，用超純水溶解于三口燒瓶中，加入適量巰基乙酸（TGA）（Cd∶Te∶TGA=1∶0.5∶2.4，摩爾比），用0.1 mol/L的NaOH調(diào)解溶液pH值至最佳，通氮?dú)?0 min左右，排出體系中的氧氣，然后在氮?dú)獗Ｗo(hù)下迅速加入新鮮制備的碲氫化鈉溶液，強(qiáng)力攪拌，100℃加熱回流。將制備好的量子點(diǎn)避光冷卻至室溫，取出適量量子點(diǎn)，用甲醇進(jìn)行離心純化，以便去除未反應(yīng)的物質(zhì)[10-11]，將所得沉淀真空干燥過(guò)夜，干燥后用超純水復(fù)溶。

取1 mL純化后的量子點(diǎn)溶液，加入20 μL的EDC（100 mmol/L），振蕩10 min左右，加入適量微囊藻毒素抗體，37℃反應(yīng)2 h。用100 kD的超濾離心管對(duì)樣品進(jìn)行離心純化，去除未結(jié)合的量子點(diǎn)及其他雜質(zhì)，將截留的QDs-Ab偶聯(lián)物用超純水復(fù)溶，4℃密閉保存?zhèn)溆肹12]。

1.3.2 裸電極的預(yù)處理 將玻碳電極分別用0.3 μm和0.05 μm的Al2O3打磨拋光，分別在乙醇和超純水中超聲2 min左右，然后在2.5 mmol/L HAuCl4溶液中于-0.2～0.6 V掃描至得到穩(wěn)定的循環(huán)伏安圖[13]。

1.3.3 間接競(jìng)爭(zhēng)法 將MC抗原用碳酸鹽緩沖溶液稀釋至0.25 μg/mL，每孔100 μL，4℃過(guò)夜，取出板條，用洗滌液清洗后，每孔加入含質(zhì)量濃度3 g/dL BSA的PBS溶液250 μL，以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)，37℃反應(yīng)2 h，清洗后，每孔分別加入50 μL不同質(zhì)量濃度的MC標(biāo)準(zhǔn)品和50 μL QDs-Ab，37℃反應(yīng)1 h后清洗[14]，然后每孔加入1 mol/L的HNO3，使得結(jié)合在孔板上的量子點(diǎn)中Cd2+溶出，然后吸取20 μL混合液加入到10 mL緩沖溶液中。

1.3.4 Cd2+的檢測(cè) 在三電極體系下按照預(yù)先設(shè)定好的條件進(jìn)行測(cè)試，因?yàn)檠鯕獾拇嬖跁?huì)增加背景電流，所以測(cè)試前先向緩沖液中通氮?dú)? min以除去溶液中的溶解氧[15]。然后將電極浸入含有一定濃度Cd2+的緩沖溶液中，適當(dāng)攪拌，在一定電位下富集，沉積完成后，將溶液靜置片刻，最后再掃描溶出。以溶出峰電流作為標(biāo)準(zhǔn)，控制變量，對(duì)檢測(cè)條件進(jìn)行優(yōu)化。掃描范圍：-1.2～-0.1 V；測(cè)定條件：電位增量0.004 V/s，方波頻率25 Hz，振幅25 mV，平衡時(shí)間10 s，清洗電位0.3 V，清洗時(shí)間60 s。所有測(cè)試均在室溫下進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)原理如圖1所示。

圖1 實(shí)驗(yàn)流程圖Fig.1 Flow diagram of this experiment

2 結(jié)果與分析

2.1 量子點(diǎn)表征及偶聯(lián)結(jié)果鑒定

通過(guò)CdTe量子點(diǎn)的透射電鏡圖（見(jiàn)圖2），可以看出，制備的量子點(diǎn)分散性良好，形狀接近球形，粒徑比較均一。

對(duì)QDs-Ab偶聯(lián)物進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，各道上樣的樣品及上樣量分別是：1泳道為10 μL標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker，2泳道為10 μL量子點(diǎn)，3泳道為 10 μL微囊藻毒素抗體，4泳道為 10 μL QDs-Ab偶聯(lián)物，5泳道為 20 μL QDs-Ab偶聯(lián)物。電泳結(jié)束后，用凝膠成像儀對(duì)其進(jìn)行透射拍照[16]，獲得圖3（a）。然后將凝膠在染色液中浸泡15 min，再進(jìn)行脫色處理，直到背景顏色完全脫掉為止，用成像儀對(duì)凝膠再次進(jìn)行拍照，獲得圖3（b）。

未標(biāo)記的抗體（或Marker）不會(huì)產(chǎn)生熒光，透射拍照也就不會(huì)產(chǎn)生亮帶。而量子點(diǎn)有熒光，所以在紫外照射下會(huì)有條帶，如圖 3（a）所示，2、4、5泳道都有亮光，并且QDs-Ab偶聯(lián)物（4，5泳道）亮光的強(qiáng)度會(huì)隨著上樣量的增加而增強(qiáng)。在考馬斯亮藍(lán)染色之后，圖3（b）所示，QDs（2泳道）無(wú)條帶，Marker，抗體及QDs-Ab均有明顯的條帶，兩者結(jié)合表明QDs與Ab偶聯(lián)成功。

圖3 偶聯(lián)物透射和照射電泳圖Fig. 3 Transmission electrophoresis and exposure electrophoresis of QDs-Ab conjugates

2.2 檢測(cè)條件優(yōu)化

2.2.1 差分脈沖溶出伏安法與方波溶出伏安法對(duì)比 對(duì)金屬離子的溶出分析分為兩步，首先在一定電位下將金屬離子富集到電極，然后再施加電壓，使其溶出，由于溶出時(shí)可采用不同掃描方式，因此溶出峰的電流大小也不一樣。根據(jù)參考文獻(xiàn)可知，對(duì)Cd2+的檢測(cè)通常采用差分脈沖溶出伏安法（DPV）和SWSV這兩種方法，因此首先在合適的條件下將Cd2+沉積到電極上，然后改變掃描方式，使其重新溶出，以溶出峰電流作為指標(biāo)，從中選擇出最優(yōu)的檢測(cè)方法。如圖4所示，在相同的測(cè)量條件下，采用兩種溶出方法對(duì)同一濃度的Cd2+進(jìn)行檢測(cè)，可以看出SWSV所得到的峰型更好，峰電流也更大，故采用SWSV對(duì)鎘離子進(jìn)行檢測(cè)。

2.2.2 硝酸用量 取出包被好的板條，清洗后，加入相同質(zhì)量濃度的MC和QDs-Ab，37℃反應(yīng)1 h之后清洗，然后分別加入20、30、40、50、60、70、80 μL的1 mol/L HNO3，輕微晃動(dòng)，然后從中吸取20 μL加入緩沖溶液中，采用SWSV方法進(jìn)行檢測(cè)，如圖5所示，隨著HNO3用量的增加，溶出峰電流逐漸增大，但當(dāng)HNO3用量超過(guò)40 μL之后，電流又開(kāi)始降低，這可能是由于HNO3用量較少時(shí)，不足以將板條中的Cd2+全部溶出，而當(dāng)HNO3用量過(guò)大時(shí)，又起到了稀釋的作用，降低了Cd2+的濃度，使得溶出峰電流降低，因此本實(shí)驗(yàn)中選擇加入40 μL的HNO3。

圖4 不同檢測(cè)方法的比較Fig.4 Comparison of different detection methods

圖5 硝酸用量的優(yōu)化Fig.5 Optimization of the amount of nitric acid

2.2.3 緩沖溶液的優(yōu)化 緩沖液的種類對(duì)金屬離子的電流大小和峰電位均有較大影響，因此選擇合適的緩沖溶液可以有效提高檢測(cè)的靈敏度。因?yàn)榻饘匐x子的測(cè)定通常在酸性環(huán)境[17]，因此在pH=5的情況下，配制幾種常見(jiàn)的緩沖溶液（磷酸鹽，醋酸鹽，Tris-HCl，檸檬酸-檸檬酸鈉），如圖6（a）所示，Cd2+在磷酸鹽緩沖液中的峰電流值最高，峰型最好，因此選擇磷酸鹽緩沖液作為支持電解質(zhì)溶液。

配制pH為2～9的磷酸鹽緩沖溶液，檢測(cè)不同pH下溶出峰電流的變化，如圖6（b）所示，溶出峰在pH為3時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)，隨著pH值的增加，峰電流先增加再降低，在pH為5時(shí)達(dá)到最大，這可能是由于Cd2+在弱酸環(huán)境中的沉積能力要強(qiáng)于強(qiáng)酸環(huán)境，而在堿性條件下，Cd2+易發(fā)生水解，使得電極對(duì)它的吸附能力減弱，從而導(dǎo)致峰電流降低[18]。

配制不同濃度的磷酸鹽緩沖溶液，在相同條件下對(duì)同一濃度的Cd2+進(jìn)行檢測(cè)，如圖6（c）所示，隨著緩沖液濃度的增加，溶出峰的值也在不斷增加。這是由于隨著電解質(zhì)的濃度的升高，更多的離子可以參與到電極表面的反應(yīng)，使得電極表面電子遷移速率增大，進(jìn)而使得溶出峰電流值增加[19]，當(dāng)緩沖液濃度達(dá)到0.1 mol/L之后，電流值增加速度減緩，且溶出峰的峰形也會(huì)發(fā)生一些偏移，因此選擇濃度為0.1 mol/L的緩沖溶液。

圖6 不同條件的優(yōu)化Fig.6 Optimization of different conditions

2.2.4 沉積電位和沉積時(shí)間 沉積過(guò)程是指游離的Cd2+在某一電位下被還原成鎘單質(zhì)富集在電極表面，因此沉積電位的選擇對(duì)隨后的溶出峰測(cè)定具有很大的影響。沉積電位如果離溶出峰的電位太近，可能會(huì)造成溶出峰電流不穩(wěn)定，甚至?xí)?dǎo)致Cd2+無(wú)法在電極表面富集，而沉積電位如果過(guò)負(fù)則可能引起干擾，直接影響測(cè)定結(jié)果[20]。本文中試驗(yàn)了-1.4～-0.8 V的沉積電位，如圖7（a）所示，隨著沉積電位的增大，Cd2+溶出峰的值逐漸增大，當(dāng)沉積電位為-1.2時(shí)，峰電流值最高，但隨著電位的繼續(xù)增加，峰值反而開(kāi)始下降，所以選擇最佳沉積電位為-1.2 V。此外，在沉積過(guò)程中對(duì)溶液進(jìn)行適當(dāng)?shù)臄嚢瑁梢杂行岣逤d2+的沉積效率。但應(yīng)該控制好攪拌速度，不可過(guò)快，否則易使溶液形成漩渦。

沉積時(shí)間對(duì)溶出峰電流也會(huì)產(chǎn)生影響，在一定時(shí)間范圍內(nèi)，隨著沉積時(shí)間的增加，沉積到電極上的Cd2+會(huì)增多，則溶出峰的電流值也會(huì)增高，本文比較了沉積時(shí)間從60 s增加到480 s時(shí)溶出峰電流的變化，如圖7（b）所示，在300 s之前，峰電流會(huì)隨著沉積時(shí)間的增加而增大，但當(dāng)沉積時(shí)間超過(guò)300 s后，溶出峰的值增加很緩慢甚至還略有下降，這可能是由于隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，電極上沉積的Cd2+達(dá)到飽和，并且在電極表面形成的沉積膜，厚度增加，從而影響了電子的傳輸[21]，導(dǎo)致峰電流的下降。所以最終選擇300 s作為沉積時(shí)間。

圖7 沉積電位和時(shí)間的優(yōu)化Fig.7 Optimization of deposition potential and deposition time

2.3 線性范圍及檢測(cè)限

在最佳檢測(cè)條件下，采用SWSV，對(duì)不同濃度的微囊藻毒素進(jìn)行測(cè)量，如圖所示，Cd2+方波溶出檢測(cè)的出峰電位大約在-0.768 V，當(dāng)濃度在0.1～8 μg/L之間，微囊藻毒素濃度的對(duì)數(shù)值與峰電流具有良好的線性關(guān)系，回歸方程為：y=-196.66x+242.15，R2= 0.992 45，檢測(cè)限可達(dá)0.08 μg/L。

圖8 線性擬合曲線Fig.8 Linear fitting curve

2.4 重現(xiàn)性

分別對(duì)質(zhì)量濃度為0.25、2 μg/L的微囊藻毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)測(cè)定10次，如表1所示，測(cè)得的相對(duì)平均偏差分別為2.38%、4.42%，表明該方法具有良好的重現(xiàn)性。

表1 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)Table 1 Repeatability test

2.5 樣品分析

在最優(yōu)條件下，對(duì)飲用水、校園湖水（若湖水濁度過(guò)大，則測(cè)定之前先用0.45 μm的濾膜抽濾）兩種水樣進(jìn)行檢測(cè)，并同ELISA檢測(cè)結(jié)果相比較，此外對(duì)兩種水樣進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，采用標(biāo)準(zhǔn)加入法，分別向水樣中加入不同濃度的微囊藻毒素標(biāo)準(zhǔn)品（每個(gè)濃度平行測(cè)定5次）。結(jié)果如表2所示，本法的測(cè)定結(jié)果與ELISA基本相符，所測(cè)樣品的回收率為91%～108.6%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.97%～6.98%。

表2 實(shí)際水樣中MC的檢測(cè)Table 2 Detection results of MC in water samples（n=5）

3 結(jié)語(yǔ)

本研究中利用CdTe量子點(diǎn)為媒介，將抗原抗體的特異性反應(yīng)與電化學(xué)的溶出分析方法相聯(lián)系，通過(guò)SWSV對(duì)Cd2+的分析，從而間接實(shí)現(xiàn)對(duì)微囊藻毒素的定量檢測(cè)。該方法保留了溶出分析法靈敏度高，操作簡(jiǎn)單快速等傳統(tǒng)優(yōu)點(diǎn)，并且由于抗原抗體的特異性反應(yīng)，可以有效排除雜質(zhì)干擾。在最優(yōu)檢測(cè)條件下，該方法的檢測(cè)限可達(dá)0.08 μg/L，且線性范圍較寬。對(duì)水樣的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)及實(shí)際樣品檢測(cè)，結(jié)果表明該方法在檢測(cè)實(shí)際水體中的微囊藻毒素具有很好的應(yīng)用前景。

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Determination of Microcystin in Water Using Electrochemical Method Based on Quantum Dot/Antibody Probe

LI Ying1， SUN Xiulan1， ZHANG Yinzhi*2
(1.School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.State Key Laboratory of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

With the probe of quantum dots coupled with microcystin antibody（QDs-Ab），the content of microcystin was determined by measuring cadmium ions released from QDs based on square wave stripping voltammetry after indirect competitive reaction.The electrochemical response was optimized with respect to pH，buffer concentration，deposition potential，deposition time and so on.Results showed that the sensitive stripping peak potential of cadmium ions was about-0.768 V. Under the optimal conditions，the peak current was linear with the logarithm of microcystin concentration in the range of 0.1～8 μg/L and the equation of regression was y=-196.66x+242.15（R2=0.994 8）with a detection limit of 0.08×10-9.The recovery of standard addition experiment was in the range of 91%～108.6%with the relative standard deviation of 2.97%～6.98%.

microcystin，quantum dots，cadmium ions，square wave stripping voltammetry（SWSV）

X 82；O 661；TS 201

A

1673—1689（2017）02—0136—07

2015-03-21

國(guó)家973計(jì)劃項(xiàng)目 （2012CB720804）；國(guó)家自然科學(xué)基金委員會(huì)-廣東省人民政府自然科學(xué)聯(lián)合基金項(xiàng)目（U1301214）；2010年度公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201003008-08）。

*通信作者：張銀志（1975—），男，陜西漢中人，高級(jí)工程師，主要研究方向?yàn)槭称钒踩珯z測(cè)與分析。E-mail：yinzhizhang@jiangnan.edu.cn

李瑩，孫秀蘭，張銀志.基于量子點(diǎn)/抗體探針采用電化學(xué)方法檢測(cè)水中微囊藻毒素[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2017，36（02）：136-142.