摘要：基因測(cè)序技術(shù)發(fā)展迅速，二代測(cè)序已代替一代測(cè)序被廣泛應(yīng)用，三代測(cè)序也已進(jìn)入市場(chǎng)。測(cè)序技術(shù)目前逐漸被應(yīng)用于病原微生物的檢測(cè)，主要分為單一微生物de novo測(cè)序、單一微生物基因組重測(cè)序、復(fù)雜病原樣品的宏基因組測(cè)序，檢測(cè)結(jié)果快速精準(zhǔn)。

關(guān)鍵詞：病原微生物；基因組測(cè)序；宏基因組

1977年，英國的Sanger利用DNA復(fù)制的生物學(xué)特性，設(shè)計(jì)了一種通過DNA復(fù)制來識(shí)別4種堿基的方法，即經(jīng)典的雙脫氧核苷酸末端終止測(cè)序法（Dideoxy chain termination），揭開了DNA測(cè)序技術(shù)新篇章。尤其是高通量測(cè)序[1]的發(fā)展，使得短短10年，一個(gè)人類基因組的測(cè)序由10年前的30億美金發(fā)展到今天只要6000美金。測(cè)序技術(shù)快速發(fā)展推進(jìn)了基因組測(cè)序應(yīng)用于臨床病原微生物的檢測(cè)。2016年是我國精準(zhǔn)醫(yī)療元年，也是基因組測(cè)序應(yīng)用于臨床診斷飛速發(fā)展的一年。國家衛(wèi)計(jì)委發(fā)布《關(guān)于印發(fā)遏制細(xì)菌耐藥國家行動(dòng)計(jì)劃（2016-2020）的通知》中支持耐藥菌感染快速診斷技術(shù)的研發(fā)，特別是快速鑒別細(xì)菌與非細(xì)菌感染的技術(shù)設(shè)備、耐藥菌快速檢測(cè)。

測(cè)序技術(shù)的發(fā)展

（一）一代測(cè)序

1977年，Sanger等提出了的雙脫氧核苷酸末端終止測(cè)序法，即在4個(gè)DNA合成體系中加入不同的放射性標(biāo)記的ddNTP，通過電泳條帶放射性自顯影，根據(jù)條帶的位置測(cè)DNA分子的序列，隨后Gilbert等提出了化學(xué)降解法。Sanger 和Gilbert測(cè)序方法的提出標(biāo)志著第一代測(cè)序技術(shù)的誕生。[1]

（二）二代測(cè)序（NGS）——高通量測(cè)序（HTS）

1990年，以熒光標(biāo)記代替放射性同位素標(biāo)記和毛細(xì)管電泳技術(shù)的發(fā)展大幅提高測(cè)序的通量。同時(shí)，研究者們又提出了焦磷酸測(cè)序法、連接酶測(cè)序法、雜交測(cè)序法等多種DNA序列測(cè)定方法。其中在焦磷酸測(cè)序法和連接酶測(cè)序法的基礎(chǔ)上分別發(fā)展出了Roche公司454測(cè)序方法，和ABI公司的SOLiD測(cè)序方法。454、SOLiD 與Illumina公司的Solexa技術(shù)，在2005-2007年短短三年時(shí)間內(nèi)相繼推出，共同組成了第二代測(cè)序技術(shù)[1]。第二代測(cè)序技術(shù)的共同特點(diǎn)是極高的測(cè)序通量，使得測(cè)序周期和成本大幅降低，是目前微生物基因組測(cè)序的主流方法。

（三）三代測(cè)序

近兩年，以PacBio公司的SMRT和Oxford Nanopore Technologies納米孔單分子測(cè)序技術(shù)，被稱之為第三代測(cè)序技術(shù)[2]。與前兩代相比，他們最大的特點(diǎn)就是單分子測(cè)序，測(cè)序過程無需進(jìn)行PCR擴(kuò)增。SMRT技術(shù)的測(cè)序速度很快，每秒約10個(gè)dNTP。但是，同時(shí)其測(cè)序錯(cuò)誤率比較高（這幾乎是目前單分子測(cè)序技術(shù)的通?。?，達(dá)到15%，但好在它的出錯(cuò)是隨機(jī)的，并不會(huì)像第二代測(cè)序技術(shù)那樣存在測(cè)序錯(cuò)誤的偏向，因而可以通過多次測(cè)序來進(jìn)行有效的糾錯(cuò)。納米孔單分子測(cè)序讀長很長，大約在幾十kb，甚至100 kb，錯(cuò)誤率目前介于1%至4%，且是隨機(jī)錯(cuò)誤，而不是聚集在讀取的兩端。數(shù)據(jù)可實(shí)時(shí)讀取，通量很高（30x人類基因組有望在一天內(nèi)完成），起始DNA在測(cè)序過程中不被破壞而且樣品制備簡(jiǎn)單又便宜。理論上它也能直接測(cè)序RNA，并且能直接讀取甲基化的胞嘧啶。第三代測(cè)序有望解決目前測(cè)序平臺(tái)的不足。

測(cè)序技術(shù)應(yīng)用于病原微生物檢測(cè)的類型

（一）單一微生物de novo測(cè)序

de novo測(cè)序也稱為從頭測(cè)序：其不需要任何現(xiàn)有的序列資料就可以對(duì)某個(gè)物種進(jìn)行測(cè)序，利用生物信息學(xué)分析手段對(duì)序列進(jìn)行拼接，組裝，從而獲得該物種的基因組圖譜。獲得一個(gè)物種的全基因組序列是加快對(duì)此物種了解的重要捷徑[3]。目前主要利用二代測(cè)序技術(shù)進(jìn)行de novo測(cè)序，臨床上常見病原微生物的標(biāo)準(zhǔn)菌株多數(shù)已完成測(cè)序。

（二）單一微生物基因組重測(cè)序（Genome Re-sequencing）

全基因組重測(cè)序是對(duì)基因組序列已知的個(gè)體進(jìn)行基因組測(cè)序，并在個(gè)體或群體水平上進(jìn)行差異性分析的方法。隨著基因組測(cè)序成本的不斷降低，通過構(gòu)建不同長度的插入片段文庫和短序列、雙末端測(cè)序相結(jié)合的策略對(duì)重要的病原微生物進(jìn)行高通量測(cè)序。

（三）單一微生物測(cè)序應(yīng)用概況

臨床上培養(yǎng)陽性的菌株可進(jìn)行全基因組，24小時(shí)內(nèi)可以完成鑒定，分型，耐藥基因和毒力基因的分析，速度快而成本低。H7N9流感病毒最初分離時(shí)就是采用全基因組測(cè)序進(jìn)行鑒定的。目前大部分典型可培養(yǎng)病原微生物均已完成測(cè)序，精準(zhǔn)程度是質(zhì)譜技術(shù)無法相提并論的。

（四）復(fù)雜病原樣品的宏基因組測(cè)序（Magenomics）[3]

宏基因組測(cè)序研究的對(duì)象是整個(gè)微生物群落。相對(duì)于傳統(tǒng)單個(gè)細(xì)菌研究來說，它的優(yōu)勢(shì)明顯。主要有以下兩點(diǎn)：（1）微生物通常是以群落方式共生于某一小生境中，它們的很多特性是基于整個(gè)群落環(huán)境及個(gè)體間的相互影響的，因此做宏基因組測(cè)序研究比做單個(gè)個(gè)體的研究更能發(fā)現(xiàn)其特性；（2） 宏基因組測(cè)序研究無需分離單個(gè)細(xì)菌，可以研究那些不能被實(shí)驗(yàn)室分離培養(yǎng)的微生物。

（五）病原微生物宏基因組應(yīng)用實(shí)例

2010年，華大基因研究院和歐洲科學(xué)家研究發(fā)現(xiàn)人體微生物組分布在腸道菌群呼吸道，皮膚表面，占人總體重中的1-3%，基因種類為人體的十倍，被稱為人類第二基因組。從此開啟了微生物宏基因組測(cè)序的研究。

病原微生物的測(cè)序檢測(cè)展望

隨著測(cè)序技術(shù)成本的降低，病原微生物測(cè)序檢測(cè)將加速應(yīng)用速度。非培養(yǎng)標(biāo)本可直接檢測(cè)宏基因組，已培養(yǎng)菌株可進(jìn)行全基因組測(cè)序進(jìn)行分型，耐藥基因、毒力因子分析。病原微生物的測(cè)序技術(shù)將實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)（24小時(shí)內(nèi)），全面覆蓋（目前是2700多種），達(dá)到精準(zhǔn)醫(yī)療。

參考文獻(xiàn)：

[1] 解增言等.DNA測(cè)序技術(shù)的發(fā)展歷史與最新進(jìn)展[J].生物技術(shù)通報(bào)，2010.8.

[2] 曹晨霞等.第三代測(cè)序技術(shù)在微生物研究中的應(yīng)用[J]. 微生物學(xué)通報(bào)，2016.10.

[3] 秦楠等.高通量測(cè)序技術(shù)及其在微生物學(xué)研究中的應(yīng)用[J]. 微生物學(xué)報(bào)，2011.4.