摘要： 通過對甘草屬烏拉爾甘草（Glycyrrhiza uralensis）、光果甘草（G. glabra）、脹果甘草（G. inflata）及其人工雜交種組合G. uralensis♀ × G. glabra♂、G. glabra♀ × G. uralensis♂、G. uralensis♀ × G. inflata♂、G. inflata♀ × G. uralensis♂共68份材料的核基因ITS序列、葉綠體rbcL、matK、trnHpsbA基因的序列分析，探討了甘草屬葉綠體DNA遺傳方式。結(jié)果表明：（1）親本種和人工雜交種ITS序列長度均為614 bp，其中34份人工雜交種ITS序列存在4處變異位點，且人工雜交種均檢測出來自父本、母本ITS序列相同位點堿基的疊加，檢測率為100%。（2）親本種與人工雜交種的葉綠體基因rbcL、matK、trnHpsbA序列長度相同，共有4處變異位點，人工雜交種在變異位點處的堿基與其相對應(yīng)的父本堿基一致率高達(dá)97.1%。以上結(jié)果說明，該研究獲得34份人工雜交種為100%雜交成功的F1子代，核基因ITS序列可用于甘草屬雜交種的遺傳鑒定；甘草屬葉綠體rbcL、matK、trnHpsbA基因具有父系遺傳特性，推測甘草屬質(zhì)體的遺傳方式主要表現(xiàn)為父系遺傳，這種質(zhì)體遺傳方式的發(fā)現(xiàn)為甘草屬雜交種和遺傳多樣性研究提供了新的認(rèn)識，也為雜交種的親本鑒定提供分子依據(jù)。

關(guān)鍵詞： 甘草屬，種間雜交， ITS， 葉綠體DNA， 父系遺傳

中圖分類號： Q943，Q37文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A文章編號： 10003142（2017）02016208

Abstract： The goal of this paper was to have a better understanding of chloroplast inheritance patterns and identify the hybrid parent in Glycyrrhiza. A total of 68 individuals of Glycyrrhiza were selected including 34 parental species， G. uralensis， G. glabra， G. inflata and 34 artificial interspecific crosses， G. uralensis♀ × G. glabra♂， G. glabra♀ × G. uralensis♂， G. uralensis♀ × G. inflata♂ and G. inflata♀ × G. uralensis♂. Thirtyfour artificial interspecific crosses were performed and the sequence polymorphisms of chloroplast DNA （cpDNA） and internal transcribed spacer （ITS） of nuclear gene of parents and progenies were studied. Sequence analysis showed that ITS sequences of parents and progenies had the same length of 614 bp and altogether four variable sites， with three genotypes. Two different ITS sequence copies at four variable sites were found in each individual of F1 hybrids， one from the paternal and the other from the female parent， about which the detection ratio was 100%. It suggested that 34 artificial interspecific crosses produced successful F1 hybrids in this research and genetic trait of ITS could infer parents of Glycyrrhiza. Sequence analysis showed that the cpDNA rbcL， matK and trnHpsbA sequences of parents and artificial interspecific crosses had the same length， within a total of four variable sites and six genotypes. Two different cpDNA haplotypes were found in Glycyrrhiza. The cpDNA haplotypes of F1 hybrids matched those of the male parents and that ratio was up to 97.1%， indicating that the genetic trait was mainly inherited from the paternal parent. This result demonstrated that the chloroplast inheritance pattern of Glycyrrhiza was mostly paternal inheritance， which provides new insights into the use of cpDNA markers in studies of natural hybrids and genetic polymorphism in Glycyrrhiza.

Key words： Glycyrrhiza， interspecific crossing， ITS， chloroplast DNA， paternal inheritance

豆科（Leguminosae）甘草屬（Glycyrrhiza L.）植物全世界約20種，主要分布在中亞、北美及東歐，我國甘草屬植物以新疆、內(nèi)蒙古、寧夏和甘肅為主要分布區(qū)（李學(xué)禹和陸嘉惠，2015）。相關(guān)研究均提出在甘草屬中可能存在自然雜交種，張鵬云和彭澤祥（1960）根據(jù)甘草的形態(tài)推測，認(rèn)為存在脹果甘草（Glycyrrhiza inflate）和烏拉爾甘草（G. uralensis）的天然雜交種；而蘇聯(lián)學(xué)者認(rèn)為自然界存在光果甘草（G. glabra）與烏拉爾甘草（G. uralensis）的雜交種（李學(xué)禹，1993）；謝良碧等（2014）通過甘草屬種間雜交親和性分析和雜交種的幼苗形態(tài)觀察，提出同域分布區(qū)內(nèi)的烏拉爾甘草（G. uralensis）、光果甘草（G. glabra）、脹果甘草（G. inflata），由于花期重疊，共有傳粉昆蟲，種間有自然雜交的可能；李曉嵐等（2015）利用ESTSSR分子標(biāo)記技術(shù)，構(gòu)建甘草屬植物遺傳分化聚類圖，結(jié)果表明存在G. inflata × G. uralensis或者G. inflata × G. glabra的天然雜交種。但有關(guān)疑似雜交種的雜交起源及其親本的推斷，目前仍需要進(jìn)一步尋找證據(jù)。自然雜交種父本、母本的確定是揭示其雜交起源和分類地位的關(guān)鍵。由于核DNA是雙親遺傳，比較核DNA序列組成，通常能夠找出其雙親起源，例如位于核糖體18S rDNA和26S rDNA基因間隔的ITS序列（李小娟等，2007； Steiner Cruz，2009）。大多被子植物的葉綠體DNA通過雌配子以母系遺傳的方式傳遞（胡適宜，1997； 方曉華等，2003； Zhang et al，2003），比較雜交個體及其可能親本的葉綠體DNA序列，可以揭示其母本起源（余姣君等，2014； 王瑩等，2015）。但也有一些類群葉綠體基因被證明為父系遺傳，例如大部分的裸子植物（Neale Sederoff，1989； 劉興梁和胡適宜，1995； Gou et al，2005），被子植物中的胡蘿卜屬（Boblenz et al，1990）、牽牛屬（胡贊民等，1996）、獼猴桃屬（Testolin Cipriani，1997）、蒺藜屬（Yang et al，2000）等。甘草屬植物的葉綠體基因為母系遺傳還是父系遺傳？尚未見有相關(guān)報道。闡明甘草屬葉綠體基因遺傳特性，才能準(zhǔn)確、客觀地對雜交種的父本、母本做出科學(xué)判斷，為揭示疑似雜交種的雜交起源和分類地位提供依據(jù)。

本研究在前期研究已獲得的甘草屬種間雜交種幼苗的基礎(chǔ)上（謝良碧等，2014），以不同雜交組合的子代及其已知親本為材料，通過核DNA的ITS和葉綠體DNA的rbcL、matK、trnHpsbA片段擴增和測序，分析了親本種及雜交種的序列。其主要目的在于：（1）通過雙親遺傳的ITS序列分析，篩選出雜交成功，含有已知父本、母本基因的F1代，以用于葉綠體遺傳規(guī)律的分析。（2）通過葉綠體rbcL、matK、trnHpsbA基因的分析，揭示親本和F1代葉綠體DNA遺傳方式。（3）在以上研究基礎(chǔ)上，分析甘草屬ITS及葉綠體rbcL、matK、trnHpsbA序列在甘草屬雜交種的鑒定研究中的應(yīng)用價值，為甘草屬疑似雜交種的鑒定及其分類地位探討提供分子依據(jù)。

1材料與方法

1.1 材料

用于測序分析的材料包括34個親本種和34個人工雜交種：烏拉爾甘草（G. uralensis）、光果甘草（G. glabra）、脹果甘草（G. inflata）和正反交人工雜交種G. uralensis♀ × G. glabra♂、G. glabra♀ × G. uralensis♂、G. uralensis♀ × G. inflata♂、G. inflata♀ × G. uralensis♂，共68份。取親本種植株的成熟健康葉片和人工雜交后獲得的雜交種幼苗的新鮮葉片，采集后迅速用硅膠干燥，待葉片徹底干燥后存放于-20 ℃冰箱備用。

1.2 方法

每份材料，稱取葉片20 mg研磨成粉狀，用新型植物基因組DNA提取試劑盒（天根公司），按說明書操作提取總DNA。

核DNA的ITS序列和葉綠體DNA中rbcL、matK、trnHpsbA序列引物參照Kondo et al（2007）的設(shè)計，引物經(jīng)生工生物工程（上海）股份有限公司合成。擴增反應(yīng)在Biometera 070851 PCR儀上進(jìn)行。采用50 μL的PCR反應(yīng)體系：TaKaRa PrimeSTAR Max DNA Polymerase （北京六合通經(jīng)貿(mào)有限公司）25 μL，引物各2 μL，模板DNA 4 μL，最后超純水（ddH2O）補足至50 μL。PCR反應(yīng)條件為98 ℃預(yù)變性2 min，98 ℃變性10 s，55 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，共36個循環(huán)，最后72 ℃延伸2 min，4 ℃保存。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測片段后，在凝膠成像儀上觀察，切下目的條帶，經(jīng)凝膠回收試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司]回收處理后，送往北京六合華大基因科技股份有限公司，采用ABI 3700型自動測序儀進(jìn)行重復(fù)測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

測序結(jié)果使用SnapGene觀察峰圖后，借助MEGA 4.0進(jìn)行人工校對，手動刪除不可信的位點，并用DNAman軟件進(jìn)行多序列比對及分析。通過豆科中的錦雞兒屬（侯鑫等，2008）、甘草屬ITS序列的研究（劉春生等，2005），確定本實驗的ITS序列邊界，對照峰圖，手工篩選堿基疊加位點，分析雜交位點。葉綠體基因型的確定，參照Kondo et al（2007）的設(shè)計。

2結(jié)果與分析

2.1 ITS序列分析

親本種和人工雜交種共68份的核基因ITS序列測序結(jié)果表明，其長度均為614 bp。如圖1所示，ITS有4種多態(tài)性位點，其中ITS1含有1處變異位點；ITS2含有3處變異位點。根據(jù)變異位點分析，可以將核基因ITS基因型分為3種，分別是I1、I2、I3型，其中I2型為雜合型（表1）。烏拉爾甘草的17個樣本均有4處變異位點，分別為187（C）、411（T）、412（G）、413（C），顯示了種內(nèi)較高的保守性；光果甘草和脹果甘草具有相同的變異位點，均為187（T）、411（C）、412（A）、413（A），說明其親緣關(guān)系較近；34份人工雜交種在4個變異位點處均出現(xiàn)其親本種的疊加峰現(xiàn)象，分別為187（Y）、411（Y）、412（L）、413（M），應(yīng)為雜合位點，說明已經(jīng)獲得成功的人工雜交種。

2.2 葉綠體rbcL、matK、trnHpsbA基因序列分析

親本種和人工雜交種的葉綠體基因測序結(jié)果經(jīng)比對、剪切后，得到rbcL、matK、trnHpsbA序列長度分別為124、96、177 bp，共有4處變異位點，有6種基因型（表2），其中rbcL有2種基因型，為R1、R4；matK有2種基因型為M1、M2；trnHpsbA有2種基因型為T1、T2。如圖24所示，烏拉爾甘草17個樣本，基因型均為R1、M1、T1，記為H1型，所測葉綠體基因片段一致，說明該物種種內(nèi)保守性較高；光果甘草和脹果甘草葉綠體基因型為R4、M2、T2，記為H2型，說明光果甘草和脹果甘草親緣關(guān)系較近；人工雜交種rbcL序列為2處堿基替換突變；matK序列為1處堿基缺失突變；trnHpsbA序列有1處堿基替換突變。人工雜交種的葉綠體DNA與其母本的基因型相同的個數(shù)為1株，占總體人工雜交種的比例為2.9%，而與其相對應(yīng)的父本基因型相同的個數(shù)為33株，占總體人工雜交種的比例為97.1%（表2，圖2-4）。故人工雜交種葉綠體DNA遺傳方式主要表現(xiàn)為父系遺傳。

3討論

3.1 核基因ITS序列在甘草屬植物雜交種鑒定的應(yīng)用

隨著分子技術(shù)的發(fā)展，核基因ITS序列測序技術(shù)也應(yīng)用到雜交種的鑒定中。ITS序列為雙親遺傳，子代在雙親相同位點會出現(xiàn)堿基的疊加（范文月等，2011）。該序列被認(rèn)為是鑒定雜交種有用的分子標(biāo)記基因（嚴(yán)容，2009）。通常，如果一些植物類群的疑難種是雜交造成的，則在這些疑難種ITS序列的突變位點中會檢測到其雙親堿基的疊加，進(jìn)而可以對疑似親本做出判斷。如楊威等（2011）借助ITS序列分析，揭示了自然雜交種的親本為興安白頭翁和朝鮮白頭翁；吳杰等（2015）對分布于云南的旱柳和云南柳之間的自然雜交種進(jìn)行研究，結(jié)果表明疑似雜交種ITS序列的基因型為疑似親本的嵌合體。以上研究表明，核基因ITS序列能揭示一些疑似雜交種的真實身份。本研究中，親本種和人工雜交種的ITS序列長度均為614 bp，34個人工雜交種的ITS序列均有4處雜合位點，均表現(xiàn)為相應(yīng)親本種的堿基疊加，這與Kondo et al（2007）對甘草屬野生疑似雜交種及其自然種群的烏拉爾甘草、光果甘草及脹果甘草ITS序列分析的4個變異位點的研究結(jié)果是一致的。因此，本研究所獲得的人工雜交種是可信并可進(jìn)一步用于雙親與子代遺傳關(guān)系的分析。同時，本研究對可控雙親及人工雜交后代的ITS序列分析的結(jié)果，也將為揭示自然界甘草屬雜交現(xiàn)象和雜交種鑒定提供更有利的分子證據(jù)。

3.2 甘草屬葉綠體DNA父系遺傳的推定

到目前為止，關(guān)于豆科植物葉綠體DNA遺傳方式的研究報道表明，該科不同屬、種的質(zhì)體遺傳方式并不一致：Parker（1934）通過對菜豆花葉突變體雜交的實驗，首次證明了菜豆質(zhì)體遺傳方式為雙親遺傳；之后一些學(xué)者借助細(xì)胞學(xué)的方法，證明豌豆（劉興梁和胡適宜，1995）、大豆、野生大豆（胡適宜，1997）、菜豆（劉興梁，1997）的質(zhì)體遺傳方式為母系遺傳；父系遺傳的報道僅見苜蓿屬的紫花苜蓿（Schumann Hancock，1989； Masoud et al，1990； Dudas et al，2012）。本研究通過對甘草屬已知親本種及其雜交種的葉綠體基因中rbcL、matK、trnHpsbA片段的序列分析，共得到4處變異位點，基因型可分成兩種，一種類型為H1型，另一種為H2型。正反交的人工雜交種的葉綠體rbcL、matK、trnHpsbA的變異位點、基因型與其相應(yīng)父本的基因型一致率高達(dá)97.1%。以上結(jié)果表明，甘草屬葉綠體中的rbcL、matK、trnHpsbA片段主要為父系遺傳。初步推測甘草屬的質(zhì)體遺傳方式主要表現(xiàn)為父系遺傳，而是否為低、高頻父系遺傳，還有待進(jìn)一步研究和驗證。

3.3 甘草屬葉綠體基因遺傳的復(fù)雜性

在同屬植物中質(zhì)體的遺傳方式基本一致，所以葉綠體基因遺傳方式在屬內(nèi)是可以推測的（Zhong et al，2011）。本研究中葉綠體遺傳方式為父系遺傳的比率高達(dá)97.1%，說明在甘草屬中主要表現(xiàn)為父系遺傳；其次，葉綠體遺傳方式表現(xiàn)為母系遺傳的比率為2.9%，說明甘草屬葉綠體基因遺傳方式并不是單向的父系或母系遺傳，而是混合的，但以父系遺傳為主，這種混合的葉綠體遺傳模式在獼猴桃等其它雙子葉植物均有發(fā)現(xiàn)（Li et al，2013； Anja et al，2015）。葉綠體基因遺傳方式的多樣性可能會降低雜交頻率和轉(zhuǎn)移基因漸滲的方向（Li et al，2013），影響種群結(jié)構(gòu)和物種的遺傳分化。甘草屬植物葉綠體基因遺傳的復(fù)雜性的發(fā)現(xiàn)，將為進(jìn)一步對該屬種群結(jié)構(gòu)、遺傳分化及物種進(jìn)化的研究提供了有力證據(jù)。

3.4 甘草屬葉綠體基因父系遺傳方式對物種遺傳多樣性的影響

葉綠體是綠色植物質(zhì)體的主要類型，葉綠體DNA為母系遺傳的植物，在同一母株上形成的后代，其葉綠體單倍型是完全一致的。但葉綠體DNA為父系遺傳方式的植物，如果自然環(huán)境中有穩(wěn)定的花粉傳播途徑，如風(fēng)媒或蟲媒，可以使葉綠體單倍型通過花粉散布，這樣，同一母株上有多個父系的葉綠體單倍型，因而可能比母系遺傳植物具有更高的葉綠體單倍型多態(tài)性（張?zhí)锏龋?007）?，F(xiàn)已證明在裸子植物中父系遺傳較為普遍（Neale Sederoff，1989； 劉興梁和胡適宜，1995； Gou et al，2005），此遺傳方式，也為裸子植物遺傳多樣性提供了證據(jù)。在被子植物中，獼猴桃屬葉綠體遺傳方式前期被認(rèn)為是嚴(yán)格的父系遺傳（Testolin Cipriani，1997； Cipriani et al，1995； Chat et al，1999），后Li et al （2013）通過AFLP和測序技術(shù)對獼猴桃屬種間雜交植物進(jìn)行研究，得出獼猴桃屬葉綠體不僅具有父系遺傳的特性，還具有母系及雙親遺傳的特性。獼猴桃屬蟲媒或風(fēng)媒的混合傳粉，使該屬植物維持了較高水平的遺傳多樣性，同時也是一個具有自然雜交和基因漸滲的類群（張?zhí)锏龋?007； Li et al，2002； Chat et al，2004）。由此可見，葉綠體DNA為父系遺傳的植物類群，其遺傳多樣性的組成應(yīng)該比母系遺傳的類群更為復(fù)雜和豐富。

在前期研究工作中，對甘草屬自然種群的繁殖系統(tǒng)和雜交現(xiàn)象、遺傳多樣性研究與獼猴桃屬植物研究結(jié)果相似，其種間過渡類型復(fù)雜（李學(xué)禹和陸嘉惠，2015），同域分布種存在花期重疊、雜交親和現(xiàn)象（廖云海，2011； 田潤煒等，2013），種間雜交親和性最高可達(dá)96.67%（謝良碧等，2014）。較高的種間親和性使種間花粉交流變得更為頻繁，本研究發(fā)現(xiàn)的葉綠體父系遺傳方式則使這種由花粉流動而帶來的遺傳基因的變化更為豐富。可以推測，在屬內(nèi)的同域種分布區(qū)，種間和種內(nèi)由于頻繁的花粉交流，其葉綠體單倍型在同一母株的不同花序或果序上將會呈現(xiàn)多樣性。這不僅豐富了種內(nèi)的遺傳多樣性，也使種間的雜交和遺傳變異更為復(fù)雜。因此，甘草屬葉綠體父系遺傳的特性和種間較高的雜交親和度，使花粉流在不同個體間、種內(nèi)和種間進(jìn)出，基因的頻繁交流是導(dǎo)致甘草屬野生種群種內(nèi)較高的遺傳多樣性（李曉嵐等，2015； 張富民，1995； 陸嘉惠等，2006）和種間過渡類型大量出現(xiàn)的原因之一，也是導(dǎo)致該屬成為疑難種和爭議種較多的“困難屬”的原因。本研究發(fā)現(xiàn)的甘草屬葉綠體主要為父系遺傳特性，將為科學(xué)、客觀地對自然雜交種的雜交起源和親本鑒定提供有力依據(jù)，同時也為被子植物尤其是雙子葉豆科植物的物種進(jìn)化和演化提供了新的資料。

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