摘要： 地衣是一種傳統(tǒng)的民族藥物，能產(chǎn)生多種具有活性的物質(zhì)。該研究對(duì)地衣型真菌（Xanthoria elegans， Myelochroa indica， Ramalina peruviana， Cladonia macilenta， Nephromopsis pallescens， Cladonia coccifera）進(jìn)行液體培養(yǎng)，2個(gè)月后，培養(yǎng)液用乙酸乙酯萃取后獲得初提物。該研究采用抑菌圈法評(píng)價(jià)地衣型真菌初提物對(duì)7種致病細(xì)菌（Bacillus subtilis， Bacillus cereus， Vibrio parahaemolyticus， Straphylococcus haemolyticus， Pseudomonas aeruginosa， Staphylococcus aureus， Micrococcus luteus）的抗菌活性，并測(cè)定最低抑菌濃度（MIC）。結(jié)果表明：6種地衣型真菌的初提物均具有一定的抗菌活性，且不同培養(yǎng)基對(duì)地衣型真菌產(chǎn)生抗菌物質(zhì)有顯著影響。其中，R. peruviana在MY液體培養(yǎng)基中所產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、溶血性葡萄球菌、銅尿假單胞菌具有抑制效果，但在YMG培養(yǎng)基中所得初提物對(duì)供試7種致病細(xì)菌不具有抑菌效果。X. elegans在YMG培養(yǎng)基中所得初提物對(duì)枯草芽孢桿菌具有明顯抗菌活性，其抑菌圈直徑可達(dá)17.77 mm。該研究證實(shí)不同地衣型真菌液體培養(yǎng)初提物具有抗菌活性，不同的培養(yǎng)基也直接影響地衣型真菌抗菌效果。該研究結(jié)果為地衣型真菌的進(jìn)一步研究及民族藥的開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 地衣型真菌， 次級(jí)代謝產(chǎn)物， 抗菌活性， 抑菌圈法， 液體培養(yǎng)

中圖分類號(hào)： Q939.92文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A文章編號(hào)： 10003142（2017）02024207

Abstract： Lichen is a traditional ethnic medicine，which produces numerious active components. Thus， lichens have high research value. Most of antimicrobial ingredients from lichens were produced by lichen forming fungi. In order to detect the antimicrobial activity of secondary metabolites from lichen forming fungi， the fungi （Xanthoria elegans， Myelochroa indica， Ramalina peruviana， Cladonia macilenta， Nephromopsis pallescens and Cladonia coccifera） were cultured in liquid medium for two months. The secondary metabolites of lichen forming fungi were obtained by extracting with ethyl acetate， and then the extracts were weighed and dissolved in DMSO. Seven kinds of pathogenic bacteria（Bacillus subtilis， B. cereus， Vibrio parahaemolyticus， Straphylococcus haemolyticus， Pseudomonas aeruginosa， Staphylococcus aureus and Micrococcus luteus） were used to screen activity of the extracts. Inoculating inhibition zone was used to evaluate the antibacterial activity of the extracts， and the minimum inhibitory concentration with antibacterial activity was also detected. The results showed that all of primary extract of lichen forming fungi had extensive antibacterial activity， and the antibacterial activity of the same fungi cultured showed significantly difference in different media. The secondary metabolites produced by Ramalina peruviana cultured in MY liquid medium had inhibitory effect to Straphylococcus aureus， Straphylococcus haemolyticus， Pseudomonas aeruginosa and Micrococcus luteus. It showed that the primary extract from Ramalina peruviana had extensive antibacterial effect. But the secondary metabolites of R. peruviana cultured in YMG liquid medium had not inhibitory effect to all of these pathogenic bacteria. Extracts from all of lichen forming fungi cultured in YMG liquid medium， Only the extract of Cladonia coccifera inhibited the Staphylococcus aureus which is gramnegative bacteria. The primary extract produced by Xanthoria elegans cultured in YMG medium had antibacterial effect to Bacillus cereus， the diameter of inhibition zone was up to 17.77 mm. Our results confirmed that the secondary metabolites of lichen forming fungi have antimicrobial activity and the lichen forming fungi can produce bioactive secondary metabolites in laboratorial culture conditions. Experiment results also showed that different media can stimulate different lichen forming fungi to produce different components. The innovation of this study was that different media were used to culture lichen forming fungi and lichen forming fungi had the characteristics of one strain many compounds. This study provides the groundwork to identify the active ingredients from lichens and provides an important information for culturing mass lichens to obtain bioactive compounds.

Key words： Lichen forming fungi， secondary metabolites， antimicrobial activity， inoculating inhibition zone， liquid culture

地衣是共生菌與共生藻經(jīng)過(guò)漫長(zhǎng)的生物演化過(guò)程共生聯(lián)合形成的一類具有高度遺傳穩(wěn)定性的生物有機(jī)體，其生物學(xué)特性主要是菌藻共生體中真菌的體現(xiàn)（Moreira et al，2015）。藻類為地衣型真菌提供光合產(chǎn)物，地衣型真菌為藻類提供水和無(wú)機(jī)鹽，同時(shí)，地衣型真菌還產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物保護(hù)地衣體免受輻射和病原微生物侵入（韓樂琳等，2009）。地衣長(zhǎng)期作為民族藥使用（Behera et al，2001；王立松等，2012；魏江春，1982），近年，化學(xué)分析及活性研究也證實(shí)地衣具有巨大的潛在藥用價(jià)值（Moreira et al，2015；Rankovic' Kosanic'，2015；Stockerwrgtter，2008）。松蘿酸在1950年就被被證明具有抗革蘭氏陽(yáng)性菌的活性物質(zhì)（Francolini et al，2004），其后又發(fā)現(xiàn)地衣中的酚類物質(zhì)大多都具有抗菌活性，隨著研究不斷深入，Sushil et al（2003）發(fā)現(xiàn)，Parmalia cirrhatum地衣水提液具有抗菌活性，當(dāng)濃度達(dá)到10%時(shí)對(duì)哺乳動(dòng)物皮膚無(wú)副作用且該水提液抗菌活性可保留長(zhǎng)達(dá)2 a時(shí)間。Nashi （2008）； Stockerwrgtter（2008）發(fā)現(xiàn)，具有生物活性的地衣產(chǎn)物，比如松蘿酸，縮酚酸及縮酚酸環(huán)醚等都是由地衣型真菌合成，這些獨(dú)特的次生代謝產(chǎn)物在抗菌、抗腫瘤、抗病毒等方面具有很好的藥用價(jià)值（Molnár Farkas，2010；Luo et al，2013；Xu et al，2016）。國(guó)內(nèi)從1975年開始至今一直對(duì)地衣體抗菌活性有報(bào)道 （木全章和丁靖凱，1975；董原等，2010；黨悅方等，2014），但由于分離地衣型真菌難度較大且培養(yǎng)時(shí)間漫長(zhǎng)，因此國(guó)內(nèi)對(duì)于地衣型真菌的活性研究鮮有報(bào)道。地衣中雖然有很多活性成分，對(duì)地衣的研究也不斷深入，加之地衣本身生長(zhǎng)緩慢的特性以及地衣生長(zhǎng)環(huán)境惡化，地衣資源勢(shì)必面臨萎縮（房敏峰等，2011）。地衣中的抗菌成分都是由地衣型真菌產(chǎn)生，要想大量獲得地衣型真菌中的有效成分，必然不能從自然環(huán)境中采集新鮮地衣以免加速地衣資源的萎縮，而通過(guò)培養(yǎng)地衣型真菌并從而得到地衣型真菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物可有效地解決地衣資源利用和保護(hù)的矛盾（Stockerwrgtter，2008）。

人類的生活環(huán)境中充斥著各種各樣的致病細(xì)菌。隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，抗生素的濫用導(dǎo)致許多致病菌都具有一定的耐藥性，普通的抗生素已經(jīng)不能很好的起到治療疾病的作用（周威等，2015），例如，金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是臨床上常見致病菌，但隨著抗生素大量、廣泛的應(yīng)用，其耐藥率也逐年上升（王爽等，2004）。Francolini et al（2004）年發(fā)現(xiàn)地衣中的松蘿酸能夠直接殺死金黃色葡萄球菌，因此，大量培養(yǎng)地衣型真菌，獲得其次生代謝產(chǎn)物，得到一系列具有抗菌效果的產(chǎn)品，這將對(duì)地衣資源的開發(fā)利用及獲得抗生素替代品起到至關(guān)重要的作用。本研究在選取試驗(yàn)用地衣型真菌之前進(jìn)行了大量的預(yù)實(shí)驗(yàn)，之后選出6種生長(zhǎng)速度快，具有一定活性的地衣型真菌（Xanthoria elegans， Myelochroa indica， Ramalina peruviana， Cladonia macilenta， Nephromopsis pallescens， Cladonia coccifera），獲得乙酸乙酯粗提物并分別對(duì)7種致病菌進(jìn)行活性篩選，以期找到具有抗菌效果的初提物，為下一步大量培養(yǎng)地衣型真菌，分離提純活性化合物及功能基因的研究作鋪墊。

1材料與方法

1.1 研究材料

地衣型真菌（Xanthoria elegans， Myelochroa indica， Ramalina peruviana， Cladonia macilenta， Nephromopsis pallescens， Cladonia coccifera）樣本，由韓國(guó)地衣資源中心贈(zèng)送。6種地衣均采自于中國(guó)云南，憑證標(biāo)本分別保存在昆明植物研究所標(biāo)本館和韓國(guó)地衣資源中心，Xanthoria elegans（館藏號(hào)041247）；Myelochroa indica（館藏號(hào)041562）；Ramalina peruviana（館藏號(hào)Chy040302）；Cladonia macilenta（館藏號(hào)CH050136）；Nephromopsis pallescens（館藏號(hào)CH050089）；Cladonia coccifera（館藏號(hào)CH050056）。對(duì)新鮮的地衣體采用孢子分離法獲得地衣型真菌后，通過(guò)比對(duì)地衣型真菌和地衣體ITS序列，確定所分離得到的真菌為地衣型真菌。地衣型真菌于 MY（麥芽糖提取物 20 g，葡萄糖6 g，酵母提取物 2 g，瓊脂 8 g，用水定容至1 L）培養(yǎng)基上 15 ℃培養(yǎng)， 并定期轉(zhuǎn)接。獲得足夠的菌絲體后，接種于體積為300 mL的MY（麥芽糖提取物 20 g，葡萄糖6 g酵母提取物2 g每升）與YMG（胰蛋白胨10 g；麥芽糖5 g； 葡萄糖10 g）液體培養(yǎng)基中，置于15 ℃，轉(zhuǎn)速為150 r·min1搖床中培養(yǎng)2個(gè)月。

1.2 供試菌種

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、蠟樣芽孢桿菌（B. cereus）、副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、溶血性葡萄球菌（Straphylococcus haemolyticus）、銅尿假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、藤黃微球菌（Micrococcus luteus）由昆明市食品藥品檢驗(yàn)所提供。

1.3 提取物制備

將所得培養(yǎng)物過(guò)濾后，按體積比1∶1加入乙酸乙酯振蕩混勻，30 min超聲2次，倒入分液漏斗靜置過(guò)夜。放出水相，上層乙酸乙酯層用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮致干，稱重后，加入二甲基亞砜（DMSO）備用。

1.4 抑菌活性檢測(cè)

供試菌株懸浮液制備：將6種供試菌種分別接種于固體肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h。用接種鉤挑取已進(jìn)行菌種斜面活化的培養(yǎng)基表面的菌塊，加入無(wú)菌生理鹽水，在組織研磨器中研磨均勻，將菌懸液濃度調(diào)到1×106～6×106 cfu·mL1。

抑菌試驗(yàn)：配制LB固體培養(yǎng)基，將固體培養(yǎng)基溶化倒入培養(yǎng)皿中冷卻，凝固后用無(wú)菌棉拭子分別蘸取各試驗(yàn)菌菌懸液，均勻涂布培養(yǎng)基表面，制成含菌平板，每個(gè)菌種重復(fù)3次。采用濾紙片法（王軍等，2013），將直徑5 mm的濾紙圓片，經(jīng)高壓滅菌處理后干燥，分別滴加10 μL供試8種地衣所得不同溶劑的乙酸乙酯濃縮液作為試驗(yàn)樣片，滴加DMSO液作為陰性對(duì)照片，用無(wú)菌鑷子將樣片和1片陰性對(duì)照樣片貼放于每個(gè)培養(yǎng)皿表面，蓋好培養(yǎng)皿，于37 ℃培養(yǎng)24 h，每個(gè)萃取濃縮物重復(fù)3次。

最小抑菌活性（MIC）的測(cè)定：采用二倍稀釋法，測(cè)定相應(yīng)具有活性培養(yǎng)物MIC值。

2結(jié)果與分析

2.1 乙酸乙酯萃取得率及備試液濃度

6種地衣型真菌培養(yǎng)液經(jīng)乙酸乙酯（300 mL）萃取后得率及DMSO溶解后備試液濃度如表1所示。表1中，NP代表Nephromopsis pallescens，CC代表Cladonia coccifera，Xe代表Xanthoria elegans，MI代表Myelochroa indica，RP代表Ramalina peruviana，CMA代表Cladonia macilenta。MY，YMG為培養(yǎng)基代號(hào)。從表1可以，看出相同地衣型真菌在不同培養(yǎng)基中所得萃取物得率差別很大，不同地衣型真菌在相同培養(yǎng)中所得萃取物得率差別也非常顯著。

2.2 六種地衣型真菌在MY、YMG液體培養(yǎng)基下抑菌活性比較

將6種共生菌在MY液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，用乙酸乙酯萃取后初提物的抑菌效果如表2所示。從表2看出，6種共生菌在MY液體培養(yǎng)基中所得培養(yǎng)物抑菌活性差別很大，Xe與MI共生菌在MY培養(yǎng)基中雖然其乙酸乙酯萃取濃縮物得率高，但是不能產(chǎn)生對(duì)供試7種致病菌達(dá)到抑制作用的有效成分，RP共生菌在MY培養(yǎng)基培養(yǎng)物中能夠產(chǎn)生對(duì)2種革蘭氏陽(yáng)性菌及2種革蘭氏陰性菌產(chǎn)生抑制作用的有效成分。CMA在MY中乙酸乙酯萃取物得率雖低，但其對(duì)枯草芽孢桿菌存在抑制效果。

將6種共生菌在YMG液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，用乙酸乙酯萃取培養(yǎng)物物抑菌效果如表3所示。

從表3可以看出，6種地衣型真菌在YMG液體培養(yǎng)基中所得培養(yǎng)物抑菌活性差別很大。其中，Xe所得培養(yǎng)物對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制最為敏感，抑菌圈半徑最大，但Xe所得培養(yǎng)物不能夠?qū)ζ渌?種參試致病菌產(chǎn)生抑制。6種地衣型真菌在YMG培養(yǎng)基中所得培養(yǎng)物對(duì)革蘭氏陰性菌抑制效果較差，只有CC能對(duì)溶血性葡萄球菌產(chǎn)生抑制。CMA在YMG中乙酸乙酯萃取物含量極低，但能對(duì)三種革蘭氏陽(yáng)性菌產(chǎn)生抑制。

對(duì)比表2表3發(fā)現(xiàn)，同種地衣型真菌在不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)其抑菌活性差別很大，NP在MY中培養(yǎng)能對(duì)兩種致病菌產(chǎn)生抑制，但NP在YMG中培養(yǎng)對(duì)參試7種致病菌都沒有抑制效果，RP在兩種不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)抑菌作用差別最為顯著，RP在MY中培養(yǎng)能對(duì)4種致病菌產(chǎn)生抑制，其中包括革蘭氏陰性菌，而在YMG培養(yǎng)基中，對(duì)7種供試菌無(wú)抑制效果，其它4種地衣型真菌在兩種培養(yǎng)基中抑菌活性均有改變。

2.3 抗菌活性初提物MIC

挑取具有抗菌活性培養(yǎng)物的相應(yīng)備試液與相應(yīng)致病菌進(jìn)行MIC的測(cè)定（表4）。從表4中可以看出，各個(gè)地衣型真菌培養(yǎng)物乙酸乙酯濃縮物的最低抑制濃度各不相同，其中CMA的MIC最低。說(shuō)明CMA在兩種培養(yǎng)基中能產(chǎn)生的抑菌有效成分對(duì)供試的這幾種菌較為敏感，僅需較低濃度就能對(duì)供試的3種革蘭氏陽(yáng)性菌產(chǎn)生抑制。而抑菌范圍最廣泛的為RPMY，RPMY的缺陷在于雖然RPMY得率高，但RPMY的濃度也較高，說(shuō)明其雖然有較廣泛的抑制效果，但對(duì)能抑制的4種菌抑制效果并不敏感，可能是其中的有效成分含量較低。

3討論

本研究首次采用不同成分液體培養(yǎng)發(fā)酵的方法，培養(yǎng)得到地衣型真菌，并首次將地衣型真菌用于液體中培養(yǎng)。地衣真菌培養(yǎng)液經(jīng)乙酸乙酯處理后得初提物，對(duì)地衣真菌初提物進(jìn)行抑菌活性研究發(fā)現(xiàn)，Ramalina peruviana在MY培養(yǎng)基中有較廣泛的抑菌活性，能抑制革蘭氏陽(yáng)性菌及革蘭氏陰性菌，可以考慮將Ramalina peruviana置于MY培養(yǎng)基中進(jìn)行大量培養(yǎng)，之后分離得到相應(yīng)有效成分加以鑒定。Cladonia macilenta在YMG培養(yǎng)基中雖然其乙酸乙酯萃取物得率低，但它在低濃度下依然有較好的抑菌效果，因此Cladonia macilenta也同樣能置于YMG中進(jìn)行大量培養(yǎng)，之后分離鑒定出相應(yīng)有效成分。其余地衣型真菌由于能抑制的致病菌較少，因此暫不考慮對(duì)其余地衣型真菌進(jìn)行大量培養(yǎng)。此外，可以考慮增加致病菌種類別，再次判斷剩余暫無(wú)活性的地衣型真菌的抑菌活性。本研究的6種地衣型真菌活性相較地衣體活性較弱，可能是由于液體培養(yǎng)時(shí)間較短，僅為2個(gè)月且培養(yǎng)體積只有300 mL，因此次級(jí)代謝產(chǎn)物低于成熟地衣體。

本研究還發(fā)現(xiàn)，同種地衣型真菌在不同培養(yǎng)基中得到的抑菌效果差別顯著，因此可以初步判斷他們產(chǎn)生的化合物并不相同。這也首次在國(guó)內(nèi)印證了地衣型真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)培養(yǎng)條件的影響非常敏感，在不同培養(yǎng)條件下會(huì)刺激地衣型真菌得到不同的次級(jí)代謝產(chǎn)物（Deduke et al，2012），這一特點(diǎn)正體現(xiàn)出地衣型真菌單菌多產(chǎn)物的優(yōu)勢(shì)（OSMAC）。利用這一優(yōu)勢(shì)在不同培養(yǎng)條件下使得地衣型真菌的不同功能基因表達(dá)能夠得到更多結(jié)構(gòu)多樣的代謝產(chǎn)物，從而有效解決了利用地衣資源與保護(hù)的根本矛盾（Wang et al，2014）。

本次研究通過(guò)分離得到的地衣型真菌并對(duì)其進(jìn)行液體培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)地衣型真菌中存在抗菌活性成分的，這一結(jié)果與Nashi（2008）的結(jié)果相同。雖然地衣具有很高的研究?jī)r(jià)值，但是地衣在自然環(huán)境下生長(zhǎng)緩慢，而且由于地衣被環(huán)境影響較大，要在野外得到大量地衣型真菌難度極大，為了獲得地衣中的有效成分，可以先分離得到地衣型真菌，然后對(duì)其進(jìn)行液體培養(yǎng)，通過(guò)模仿自然界中的營(yíng)養(yǎng)成分，把共生菌中需要的糖類、有機(jī)和無(wú)機(jī)氮化合物、無(wú)機(jī)鹽和一些微量元素等即共生菌在生長(zhǎng)過(guò)程中的所必須的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)混合在水溶液中，通過(guò)供氧進(jìn)行菌絲體的大量培養(yǎng)繁殖（周勇，2008），液體培養(yǎng)將加快菌絲體生長(zhǎng)速度且能得到大量菌絲體（張建輝等，2002），并且得到大量的次級(jí)代謝產(chǎn)物。

本研究證實(shí)在實(shí)驗(yàn)室條件下培養(yǎng)地衣型真菌是切實(shí)可行的。雖然培養(yǎng)地衣型真菌能夠獲得具有抗菌活性的有效成分，但是在工業(yè)生產(chǎn)上難以分離純化得到大量有效成分，因此，從地衣型真菌中確定有效成分后定位其功能基因，將功能基因轉(zhuǎn)化到容易培養(yǎng)的真菌中發(fā)酵培養(yǎng)得到具有活性的地衣產(chǎn)物（王毅等，2015），以期用此途徑在將來(lái)進(jìn)行工業(yè)生產(chǎn)以推動(dòng)地衣資源藥用開發(fā)。

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