摘要： 膜蕨科植物是薄囊蕨類中種類最多的科，主要分布在潮濕的熱帶地區(qū)，擁有陸生、附生、半附生和攀生等多種生態(tài)型。為進(jìn)一步了解膜蕨科植物輻射式物種分化的分子適應(yīng)機(jī)制，該研究在時(shí)間框架下采用位點(diǎn)模型對膜蕨科植物rbcL基因的進(jìn)化式樣進(jìn)行分析。結(jié)果表明：共鑒定出6個(gè)氨基酸正選擇位點(diǎn)（125I、227L、231A、258F、304S和351L），其中位點(diǎn)304S位于環(huán)六上，對維持Rubisco功能有重要作用。此外，還計(jì)算了Rubisco大亞基內(nèi)部氨基酸位點(diǎn)之間的共進(jìn)化關(guān)系，共檢測出39組（35個(gè)氨基酸）共進(jìn)化位點(diǎn)，其中位點(diǎn)在α螺旋上的占46%，在β折疊上的占14%。膜蕨科植物rbcL基因這種復(fù)雜的進(jìn)化式樣可能與其起源較早有關(guān)。鑒于此，基于UCLD分子鐘模型對膜蕨科植物的分化時(shí)間進(jìn)行了估計(jì)，結(jié)果顯示膜蕨科植物首次發(fā)生分歧的時(shí)間在三疊紀(jì)早期，瓶蕨屬和膜蕨屬的分歧時(shí)間分別發(fā)生在侏羅紀(jì)早期和白堊紀(jì)晚期，并且得出陸生生態(tài)型是其它生態(tài)型進(jìn)化的基礎(chǔ)，推測最近幾次最熱事件可能對物種分化的形成產(chǎn)生一定的作用。該研究結(jié)果對認(rèn)識膜蕨科植物如何應(yīng)對被子植物興起所導(dǎo)致的陸地生態(tài)系統(tǒng)改變具重要意義。

關(guān)鍵詞： 膜蕨科， rbcL基因， 共進(jìn)化， 正選擇位點(diǎn)， 生態(tài)型

中圖分類號： Q941.2文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A文章編號： 10003142（2017）02014508

Abstract： Hymenophyllaceae is the most rich speices family of leptosporangiate ferns. It mainly distributed in the humid tropics， possessing terrestrial， epiphytic， hemepiphytic and climbing ecotypes. To further understand the molecular adaptation linked to fern radiation， evolutionary patterns of the rbcL sequences in the family Hymenophyllaceae were examined using randomsite models along with the estimated timescale of Hymenophyllaceous phylogeny. By comparing Modles M1a/M2a and M7/M8 under randomsite modles， six amino acid sites （125I， 227L， 231A， 258F， 304S and 351L） were found to be positively selected， in which the site 304S was located in the Dloop six， playing an important role in keeping Rubisco function. We also used CAPS v1.0 （coevolution analysis using protein sequences） to study the evolutionary relationship between the amino sites within the Rubisco large subunit. Thirtynine groups of coevolutionary sites were detected （totally thirtyfive amino sites）， of which 46% were located in the αhelix， 14% in the βsheet. This complex evolutionary patterns may be related to its earlier origin. In view of this， the phylogenetic tree was reconstructed. The results showed that the initial divergence whin Hymenophyllaceae occurred in the early Triassic. The divergence within Trichomanes and Hymenophyllum occurred in the early Jurassic and Cretaceous， seperatelly. The results also indicated that the ancestral state for the Hymenophyllaceae was terrestrial， suggesting possible roles played by the Thermal Maximum recently. These results provide new insights for how Hymenophyllaceae ferns response to the terrestrial ecosystem changes caused by the rise angiosperms.

Key words： Hymenophyllaceae， rbcL gene， coevolution， positive selection， ecotypes

核酮糖1，5二磷酸羧化酶/加氧酶（簡稱Rubisco），是葉綠體基質(zhì)中的可溶性蛋白。該酶在植物光合作用中發(fā)揮重要作用，既是固定CO2的羧化酶，也是光呼吸途徑中的加氧酶（Rowan Athena，2006；張江洪等，2002）。光呼吸代謝途徑消耗光合作用過程中合成的有機(jī)物，由此造成的損失非常高。現(xiàn)已知，葉綠體rbcL基因編碼Rubisco大亞基，且大亞基的C末端與催化固定CO2密切相關(guān)（Spreitzer Salvuccim，2002；Curmipm et al，1992）。鑒于此，若能深入了解Rubisco的結(jié)構(gòu)并對其進(jìn)行改造，適當(dāng)增強(qiáng)與CO2的親合力，則能提高植物的光合效率（蔣德安等，2001；洪健等，2004）。

基因序列適應(yīng)性進(jìn)化分析可為深入理解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能提供參考信息。將蛋白質(zhì)編碼序列分為同義置換（dN）和非同義置換（dS）。 ω=dN/dS可用來判斷蛋白質(zhì)中氨基酸位點(diǎn)的進(jìn)化方式（Yang，2007）。當(dāng) ω=1表示為中性進(jìn)化； ω<1說明受到負(fù)選擇； ω>1表明發(fā)生了正向選擇，也即暗示蛋白質(zhì)發(fā)生了適應(yīng)性進(jìn)化。與此同時(shí)，蛋白質(zhì)內(nèi)部氨基酸位點(diǎn)并不是孤立存在，單獨(dú)進(jìn)化的，它們之間存在一種共進(jìn)化關(guān)系。氨基酸位點(diǎn)間的這種共進(jìn)化關(guān)系的復(fù)雜性與它們在結(jié)構(gòu)和功能上的聯(lián)系成正比，正是這種分子內(nèi)部氨基酸位點(diǎn)間的共進(jìn)化關(guān)系網(wǎng)促成了蛋白質(zhì)的進(jìn)化。近年來有文獻(xiàn)報(bào)道，發(fā)生正選擇的位點(diǎn)多數(shù)都伴隨著與其它氨基酸之間的復(fù)雜的共進(jìn)化關(guān)系，鑒于此，我們計(jì)算了Rubisco大亞基內(nèi)部各氨基酸位點(diǎn)間的共進(jìn)化關(guān)系，以期為研究其功能提供精確的位點(diǎn)參考信息。

膜蕨科植物有750～800種，是薄囊蕨類中種類最多的科，主要分布在潮濕的熱帶地區(qū)，擁有多種生態(tài)型（陸生、附生、半附生和攀生等）?？紤]到膜蕨科植物生境的異質(zhì)性（Zhang et al，2006），推測在物種發(fā)生輻射式分化的過程中，參與光合作用的關(guān)鍵基因可能也發(fā)生了某種程度的適應(yīng)性進(jìn)化。鑒于此，本研究的目的是①揭示膜蕨科植物rbcL基因編碼的氨基酸位點(diǎn)發(fā)生適應(yīng)性進(jìn)化式樣并進(jìn)一步檢測各氨基酸位點(diǎn)間的共進(jìn)化關(guān)系；②對膜蕨科植物分歧時(shí)間進(jìn)行估計(jì)；③初步探討膜蕨科植物不同生態(tài)型之間的進(jìn)化關(guān)系。

1材料與方法

1.1 序列數(shù)據(jù)

由GenBank獲得膜蕨科139種植物的rbcL基因序列（表1），根據(jù)文獻(xiàn)以4種植物（水蕨，楔葉鐵線蕨，鳳丫蕨和沼澤蕨）為外類群（Qin，1978）。使用ClustalW（Thompson et al，1994）軟件對序列進(jìn)行比對，共獲得402個(gè)密碼子。

1.2 統(tǒng)計(jì)分析

運(yùn)行Modeltest 3.7（Pos Crandall，1998）軟件選取核苷酸進(jìn)化模型。采用Mrbayes 3.1.2（Hulsenbeck Ronquist，2001）軟件構(gòu)建膜蕨科植物系統(tǒng)發(fā)育樹。根據(jù)MCMC（Markov Chain Monte Carlo）理論計(jì)算15 000 000代，每100代取樣1次，總共產(chǎn)生150 000棵樹，運(yùn)算過程按照4條鏈同時(shí)運(yùn)行（3條熱鏈和1條冷鏈），這樣最開始的37 500棵樹作為預(yù)熱樣本被摒棄掉，用余下的樣本在時(shí)間框架下構(gòu)建一致樹。使用Tracer v1.4.1（Rambaut Drummonda，2008）軟件檢測運(yùn)算的收斂程度。最后用Figtree v1.2.3（Rambaut Drummonda，2009）軟件查看膜蕨科植物的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

利用BEAST v2.2.1軟件估計(jì)膜蕨科植物的分歧時(shí)間（Drummond Rambaut，2007）。根據(jù)所得的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系將所有植物劃分為5個(gè)類群集。為準(zhǔn)確估計(jì)膜蕨科植物的分歧時(shí)間，本研究基于最近共同祖先時(shí)間（tMRCA）值校正主要分支的分歧時(shí)間，由于沒有可用化石記錄的報(bào)道，我們采用外類群水蕨屬，楔葉鐵線蕨屬和鳳丫蕨屬的分歧時(shí)間進(jìn)行單點(diǎn)校正（Pryer et al，2004；Schneider et al，2004）（圖1）。采用Modeltest 3.7軟件選取核苷酸進(jìn)化模型并計(jì)算30 000 000代，每1 000代取樣1次，最開始的7 500棵樹作為預(yù)熱樣本被摒棄掉，用Figtree v1.2.3（Rambaut Drummonda，2009）軟件查看剩余樣本重建的最大置信度時(shí)間樹。

采用位點(diǎn)模型進(jìn)行適應(yīng)性進(jìn)化分析，根據(jù)dN和dS的比值（ ω>1）來判斷氨基酸位點(diǎn)是否發(fā)生正向選擇（Yang，2007）。其中，M0模型設(shè)定系統(tǒng)樹上所有的位點(diǎn)及分支具有同樣的 ω值，即單一比值。近中性M1a模型假設(shè)蛋白質(zhì)具保守（0< ω<1）和中性（ ω=1）兩類位點(diǎn)。M2a（選擇）模型中 ω值可以大于1，為自由參數(shù)，由此衍生出第三類位點(diǎn)。M3模型可以根據(jù)離散型分布分別計(jì)算出三類位點(diǎn)的 ω比值（ω1 、ω2和 ω3）及其所占比例（p0、p1和p2）。M7模型允許 ω值在0到1之間，符合beta分布（p，q）。M8（beta和 ω）模型允許 ω值大于1，其數(shù)值和比例可由數(shù)據(jù)計(jì)算獲得，這樣，M8在M7基礎(chǔ)上新增了一類位點(diǎn)。與M8模型類似，M8a（beta和 ω=1）模型設(shè)定 ω值固定為1。在此設(shè)定基礎(chǔ)上對模型進(jìn)行成對比較（M1aM2a、M7M8和M8M8a），根據(jù)比較的結(jié)果便可判定位點(diǎn)是否發(fā)生過正向選擇（Nielsen Yang，1998）。以上各種模型的參數(shù)利用PAML4軟件計(jì)算獲得（Yang，2007）。

同時(shí)，用CAPS v1.0 （coevolution analysis using protein sequences） 計(jì)算Rubisco大亞基內(nèi)部氨基酸位點(diǎn)之間的共進(jìn)化關(guān)系（Fares，2006）。CAPS既能計(jì)算分子內(nèi)共進(jìn)化又能計(jì)算分子間共進(jìn)化，本研究屬于分子內(nèi)共進(jìn)化。CAPS通過檢測氨基酸位點(diǎn)的進(jìn)化速率相關(guān)性來揭示它們之間是否存在共進(jìn)化關(guān)系。計(jì)算中設(shè)置 α值為0.001，隨機(jī)抽樣值設(shè)置為1 000 000，以此減少假陽性。此外，為了消除系統(tǒng)發(fā)育拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的影響，我們采用CAPS v1.0中的亞程序，通過去掉一些明顯具有系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系（后驗(yàn)概率>75%）的分支來鑒定出結(jié)構(gòu)和功能共進(jìn)化位點(diǎn)。

2結(jié)果與分析

2.1 膜蕨科的系統(tǒng)發(fā)育和分化時(shí)間

膜蕨科植物的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系如圖1，主要聚為兩大類群（后驗(yàn)概率值為1.00）：類群1包括除膜蕨屬之外的膜蕨科大部分屬（后驗(yàn)概率值為0.97）；類群2主要由膜蕨屬、簇生蕨屬、細(xì)口團(tuán)扇蕨屬、腎膜蕨屬組成（后驗(yàn)概率值為1.00），其中腎膜蕨屬首先分化出來，這與傳統(tǒng)分類學(xué)的觀點(diǎn)是一致的（張巧艷等，2006）。

BEAST軟件計(jì)算結(jié)果顯示膜蕨科的首次分歧時(shí)間發(fā)生在三疊紀(jì)早期（約233 Ma；圖1），瓶蕨屬的分歧時(shí)間發(fā)生在侏羅紀(jì)早期（約201 Ma），膜蕨屬的分歧時(shí)間發(fā)生在白堊紀(jì)晚期（約83 Ma）。結(jié)果與以往的研究基本一致（Pryer et al，2004）。其次，圖1很清晰地反映了不同種生態(tài)型之間的親緣關(guān)系，陸生生態(tài)型是其它幾種生態(tài)型演化的基礎(chǔ)。

2.2 膜蕨科rbcL基因正選擇位點(diǎn)的鑒定和空間位置

利用PAML4軟件計(jì)算各種模型的參數(shù)值（表2，表3）。在95%水平上，模型M2a鑒定出5個(gè)氨基酸位點(diǎn)（125I、227L、231A、304S和351L）受到正向選擇，而模型M8鑒定出有6個(gè)氨基酸位點(diǎn)（125I、227L、231A、258F、304S和351L）受到正向選擇。

為了更精確地定位上述6個(gè)氨基酸正選擇位點(diǎn)的空間位置，采用參考序列（煙草Rubisco大亞基，登錄號為CAA77361）作為基準(zhǔn)進(jìn)行比對，結(jié)果顯示125I、227L、231A、258F、304S和351L六個(gè)正選擇位點(diǎn)分別對應(yīng)于煙草Rubisco大亞基的149Q、251I、255V、282H、328S和375L。用raswin軟件（Roger et al，1995）將這六個(gè)位點(diǎn)標(biāo)定在Rubisco晶體結(jié)構(gòu)圖中，其中125I位于Rubisco大亞基N末端的環(huán)上，227L和231A位于羧基末端α/β桶結(jié)構(gòu)域的第3個(gè)α螺旋上，258F位于第4個(gè)α螺旋上，304S位于α/β桶中的環(huán)6上，對維持Rubisco功能有重要作用。351S在α/β桶的第7個(gè)β折疊上（圖2）。

2.3 Rubisco大亞基內(nèi)部氨基酸位點(diǎn)之間共進(jìn)化分析

為了研究Rubisco大亞基內(nèi)部氨基酸位點(diǎn)之間的關(guān)系，用CAPS v1.0軟件進(jìn)行共進(jìn)化分析，共鑒定出39組（35個(gè)氨基酸）共進(jìn)化位點(diǎn)（圖3），為確定這些位點(diǎn)在Rubisco大亞基內(nèi)部的分布，同樣用raswin軟件進(jìn)行標(biāo)定，結(jié)果顯示其中位點(diǎn)在α螺旋上的占46%，14%的位點(diǎn)在β折疊上。其中大部分位點(diǎn)間伴隨著疏水性共進(jìn)化、分子量共進(jìn)化和疏水性兼分子量共進(jìn)化（P < 0.01）。另外，用CAPS v1.0的亞程序，在去掉一些明顯具有系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的分支后，所得結(jié)果也是39組結(jié)構(gòu)和功能共進(jìn)化位點(diǎn)。

3討論

本研究雖然構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹的目的是為隨后計(jì)算的需要，但仍能給出一些頗具系統(tǒng)分類意義的信息。首先，從系統(tǒng)樹上可以看出，膜蕨科主要分為兩大類群：既瓶蕨屬和膜蕨屬，這與傳統(tǒng)分類學(xué)是一致的。其次，對于假脈蕨屬的分類問題一直存在爭論，雖然本研究數(shù)據(jù)有限，不同屬之間種類數(shù)量的差異比較大，但我們?nèi)匀唤ㄗh將假脈蕨屬歸為瓶蕨屬這一大類。此外，鑒于膜蕨科植物生態(tài)型的多樣性，我們對其演化關(guān)系進(jìn)行了初步分析，結(jié)果與以往的化石證據(jù)一致（Axsmith et al，2001；Dubuisson et al，2003），即陸生生態(tài)型是其它生態(tài)型演化的基礎(chǔ)。與此同時(shí)，Pryer et al（2004）提出，最近幾次的最熱事件可能是造成生態(tài)型多樣性的原因。

Rubisco的大亞基由N和C兩個(gè)結(jié)構(gòu)域組成。N結(jié)構(gòu)域從N末端開始，包括137個(gè)氨基酸，其中含有5股β折疊；C結(jié)構(gòu)域中含有豐富的α螺旋，其中以α/β桶狀結(jié)構(gòu)域（α/β barrel domain）最為重要，包括8個(gè)α螺旋和8個(gè)β折疊，彼此連接成8個(gè)環(huán)，形成了漏滴狀的活性中心，由兩個(gè)大亞基參與組成，Mg2+也參與其中（Knight et al，1990；Sopert et al，1988；Wan et al，2011）。本研究鑒定出的6個(gè)正向選擇位點(diǎn)中，227L和231A位于α/β桶結(jié)構(gòu)域的第3個(gè)α螺旋上，258F位于第4個(gè)α螺旋上，351S在α/β桶的第7個(gè)β折疊上。其中，位點(diǎn)231A側(cè)鏈由一個(gè)甲基構(gòu)成，相對較短，由此可以預(yù)留出更為寬闊的空間，便于進(jìn)行催化反應(yīng)（Persson et al，2001）。另外，α/β桶結(jié)構(gòu)域上的環(huán)6對Rubisco維持活性狀態(tài)非常關(guān)鍵（Chen Spreitzer，1989）。而本研究鑒定出的位點(diǎn)304S就位于環(huán)6上。至于位點(diǎn)125I，它并不位于酶活性中心區(qū)域，推測是在亞基間相互結(jié)合時(shí)起作用。這些被鑒定出的正向選擇位點(diǎn)可為后續(xù)的基因工程實(shí)驗(yàn)提供參考，推進(jìn)Rubisco催化機(jī)制研究的進(jìn)程（森林等，2010）。

為進(jìn)一步加深對Rubisco大亞基的了解，我們研究了Rubisco大亞基內(nèi)部氨基酸位點(diǎn)間的共進(jìn)化關(guān)系，結(jié)果顯示疏水性、分子量和疏水性兼分子量共進(jìn)化位點(diǎn)皆為39組，這可能與rbcL基因高度保守有關(guān)。為排除系統(tǒng)發(fā)育拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的影響，在去掉一些明顯具有系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的分支后，得到的結(jié)果也是39組共進(jìn)化位點(diǎn)，進(jìn)一步證明rbcL基因的高度保守性。另外，Rubisco活性中心的3個(gè)賴氨酸殘基（Lys175、Lys201和Lys334）高度保守且與Rubisco活性狀態(tài)密切相關(guān)（熊曉然等，2003）。本研究的共進(jìn)化位點(diǎn)中沒有這3個(gè)氨基酸，且在這3個(gè)位點(diǎn)8范圍內(nèi)并無發(fā)現(xiàn)任何其它氨基酸，說明在Rubisco大亞基空間結(jié)構(gòu)中并沒有其它氨基酸與這3個(gè)氨基酸相互作用，再次證明了這3個(gè)位點(diǎn)的高度保守性，不受其它氨基酸的影響，對維持Rubisco功能的正常工作起到重要作用。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)用paml檢測出的6個(gè)正選擇位點(diǎn)，除位點(diǎn)351L外都存在共進(jìn)化氨基酸位點(diǎn)。另外，這些與正選擇位點(diǎn)存在共進(jìn)化關(guān)系的氨基酸位點(diǎn)很少在α/β桶上，即不在活性中心，這可能是為了更好地維護(hù)Rubisco的功能而減少正選擇位點(diǎn)帶來的影響。與其它正選擇位點(diǎn)相比，與125I共進(jìn)化的位點(diǎn)只有3個(gè)，351L在Rubisco大亞基內(nèi)部沒有檢測出共進(jìn)化氨基酸位點(diǎn)，且這兩個(gè)氨基酸分別位于Rubisco大亞基結(jié)構(gòu)的C端和N端。我們推測與這兩個(gè)正選擇位點(diǎn)共進(jìn)化的氨基酸可能位于Rubisco小亞基上，這需要計(jì)算分子間共進(jìn)化來證明（Rubisco大、小亞基之間的共進(jìn)化），這是我們下一步研究的方向。

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