王爽　杜娟　李尚偉

摘要：本研究采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，將CmTreⅡ （膜結(jié)合型海藻糖酶基因一個(gè)靶位點(diǎn)）導(dǎo)入粳稻中花 11 號(hào)中，利用 CmTreⅡ-dsRNA （含有膜結(jié)合型海藻糖酶基因一個(gè)靶位點(diǎn)的雙鏈RNA）的沉默效應(yīng)，沉默稻縱卷葉螟的膜結(jié)合型海藻糖酶，最終獲得一批抗蟲(chóng)性較好的轉(zhuǎn)基因純合株系。研究中進(jìn)一步檢測(cè)了這些株系的室外卷葉率、白葉率以及室內(nèi)抗蟲(chóng)性。采用實(shí)時(shí)熒光定量 PCR（RT-qPCR）檢測(cè)轉(zhuǎn)基因水稻室內(nèi)抗蟲(chóng)性 CmTre2 基因的相對(duì)表達(dá)量。通過(guò) RT-PCR 技術(shù)檢測(cè)了轉(zhuǎn) CmTreⅡ 基因水稻的遺傳性。結(jié)果顯示：在室外抗蟲(chóng)性試驗(yàn)中，稻縱卷葉螟對(duì)水稻的取食量明顯下降，轉(zhuǎn) CmTreⅡ 基因水稻的卷葉率和白葉率分別為 1340% 和 1247%，相比對(duì)照組分別下降了 1132% 和 1010%；在室內(nèi)抗蟲(chóng)性試驗(yàn)中，RT-qPCR 檢測(cè)結(jié)果表明，稻縱卷葉螟在取食轉(zhuǎn) CmTreⅡ 基因水稻的 96h后，CmTre2 基因的相對(duì)表達(dá)量比對(duì)照組下降了 2900%；7d后，實(shí)驗(yàn)組的死亡率為 5667%，相比對(duì)照組增加了 4667%。在遺傳性試驗(yàn)中，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn) CmTreⅡ 基因水稻的遺傳性良好。因此本研究成功鑒定了轉(zhuǎn) CmTreⅡ 基因水稻對(duì)稻縱卷葉螟的抗蟲(chóng)性以及遺傳性。

關(guān)鍵詞：稻縱卷葉螟；轉(zhuǎn)基因；抗蟲(chóng)性；膜結(jié)合型海藻糖酶；RNA干擾

中圖分類(lèi)號(hào)：Q9581；S4433（273）

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1008-0457（2017）02-0040-06國(guó)際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2017.02.008

Abstract：The CmTre2 gene， CmTreII， was introduced into the rice （Chinese Flower 11） by agrobacterium-mediated genetic transformation technology. A number of good insect resistance transgenic plants were obtained by using the silencing effect of CmTre II – dsRNAn to silent the membrane - bound trehalase of Cnaphalocrocis medinalis. The rate of white leaves and the identification of insect resistance were further investigated. The relative expression of CmTre2 gene in transgenic rice was detected by real-time fluorescence quantitative PCR （RT-qPCR）. At the same time， RT-PCR technology was adopted to detect the genetic characteristics of transgenic CmTreⅡ gene rice. The results showed that in the outdoor insect resistance experiments， the feeding amount by C. medinalis of transgenic CmTreⅡ gene rice decreased significantly. The leaf roll rate and white leaf rate of transgenic CmTreⅡ gene rice were 1340% and 1247%， respectively， which were a decrease of 1132% and 1010%， respectively， compared to the control group. In the indoor experiment of insect resistance， RT-qPCR results showed that， after 96 hours of C. medinalis feeding on transgenic CmTreⅡ gene rice， the relative expression of CmTre2 was decreased by 29% of the control group. After 7 days of feeding on transgenic CmTreⅡ gene rice， the mortality rate of insects was 5667%， an increase of 46.67% compared to the control group. In the genetic test， the genetic characteristics of the transgenic CmTreⅡ gene rice was detected. This study successfully identified the pest resistance and genetics of transgenic CmTreⅡ gene rice.

Key words：Cnaphalocrocis medinalis ； transgenosis ； insect resistance； the membrane - bound trehalase； RNAi

水稻是世界上最重要的糧食作物之一，全球近半數(shù)人以稻米為食，而我國(guó)又是世界上最大的稻米生產(chǎn)國(guó)和消費(fèi)國(guó)之一，全國(guó)有 65%以上的人口以稻米為主食。因此，水稻高產(chǎn)豐收對(duì)我國(guó)糧食安全至關(guān)重要。稻縱卷葉螟（Cnaphalocrocis medinalis）俗稱(chēng)卷葉蟲(chóng)、刮青蟲(chóng)、苞葉蟲(chóng)等，屬于鱗翅目（Lepidoptera）螟蛾科（Pyralidae），是對(duì)水稻危害較為嚴(yán)重的主要螟蟲(chóng)之一[1-3]，是一種典型的遷飛性害蟲(chóng)，在我國(guó)和國(guó)外都有廣泛的分布[1]。初孵幼蟲(chóng)取食心葉，二齡以上的幼蟲(chóng)綴絲縱卷水稻葉片成蟲(chóng)苞，幼蟲(chóng)匿居蟲(chóng)苞之中取食葉肉，使葉片僅留表皮，形成白色條斑，影響光合作用，造成稻千粒重降低，秕谷增加，一般導(dǎo)致水稻減產(chǎn)10%～20%，嚴(yán)重達(dá) 60%以上[4， 5]。

海藻糖酶是昆蟲(chóng)體內(nèi)幾丁質(zhì)合成通路的第一個(gè)酶，已經(jīng)有許多昆蟲(chóng)的海藻糖酶基因（Tre）被克隆。在隨后的科學(xué)研究中證實(shí)昆蟲(chóng)體內(nèi)存在兩種類(lèi)型的海藻糖酶，即可溶型海藻糖酶（Tre1）和膜結(jié)合型海藻糖酶（Tre2），它們的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)區(qū)別很大，其中，可溶型海藻糖酶主要存在于昆蟲(chóng)消化系統(tǒng)和循環(huán)系統(tǒng)中，然而膜結(jié)合型海藻糖酶主要存在于昆蟲(chóng)的肌肉中，其主要功能是水解食物中的海藻糖，從而為肌肉運(yùn)動(dòng)和取食階段中中腸的運(yùn)動(dòng)提供能量[6]。海藻糖廣泛存在于細(xì)菌、真菌、植物、昆蟲(chóng)以及其他無(wú)脊椎動(dòng)物中，但哺乳動(dòng)物沒(méi)有內(nèi)源性的海藻糖[7， 8]。同時(shí)鑒于它在昆蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育中的重要性，常常作為一個(gè)理想的殺蟲(chóng)劑作用靶標(biāo)。

RNA 干擾（RNA interference， RNAi）是指在進(jìn)化過(guò)程中高度保守的、由雙鏈 RNA （double-stranded RNA， dsRNA）誘發(fā)的、同源 mRNA 高效特異性降解的現(xiàn)象。RNAi 的本質(zhì)是轉(zhuǎn)錄后的基因沉默（post-transcriptional gene silencing， PTGS），發(fā)生沉默的基因的轉(zhuǎn)錄仍然正常進(jìn)行，但是轉(zhuǎn)錄的 mRNA 在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)生了序列特異性降解，從而導(dǎo)致基因不能正常表達(dá)成蛋白質(zhì)。

長(zhǎng)期以來(lái)稻縱卷葉螟主要通過(guò)農(nóng)藥進(jìn)行防治， 而農(nóng)藥的使用， 一則增加了成本， 二則污染了環(huán)境[9]。采用轉(zhuǎn)基因方法培育作物新品種， 大大縮短了育種周期， 提高了育種效率， 因此轉(zhuǎn)基因技術(shù)在作物改良中取得飛速的發(fā)展。

目前，本實(shí)驗(yàn)室已獲得抗蟲(chóng)性以及遺傳性良好的轉(zhuǎn) CmTreⅡ 基因水稻，能成功抑制稻縱卷葉螟體內(nèi)的膜結(jié)合型海藻糖酶的表達(dá)，達(dá)到抗稻縱卷葉螟的目的。

11材料

111主要試劑與材料

總 RNA 提取采用的 TRIzol（Invitrogen）試劑購(gòu)自美國(guó) Thermo Fisher 公司；DL 2000 DNA marker、PrimeScriptRT-PCR Kit 及 LA TaqDNA 聚合酶均購(gòu)于大連 TaKaRa 公司；iTaq Universal SYBR Green Supermix 和C1000 Thermal Cycler 購(gòu)自美國(guó) Bio-Rad 公司；總DNA抽提采用的 EZNA Insect DNA Kit 試劑盒購(gòu)自 OMEGA 公司；PCR 耗材、離心管及其他常規(guī)試劑和耗材均購(gòu)于生工生物工程（上海）股份有限公司。引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

112供試水稻品種及農(nóng)桿菌菌種

本研究供試水稻品種為中花 11 號(hào)。農(nóng)桿菌菌種為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的含重組植物表達(dá)載體 p1301-CmTre2 的農(nóng)桿菌 LBA4404 基因工程菌。

113供試稻縱卷葉螟

供試?yán)ハx(chóng)為本實(shí)驗(yàn)室人工飼養(yǎng)的稻縱卷葉螟 3 齡幼蟲(chóng)，飼養(yǎng)條件為 26±1℃，相對(duì)濕度70%～80% ，光周期 14L∶10D ，取食植物為非轉(zhuǎn)基因水稻。

12實(shí)驗(yàn)方法

121RT-PCR 檢測(cè)引物設(shè)計(jì)

123室內(nèi)接蟲(chóng)

先將直管 （12cm×3cm）一端用包裹有棉花的細(xì)紗布封口。選擇同一批次發(fā)育良好的稻縱卷葉螟 3 齡幼蟲(chóng)為試蟲(chóng)，選擇轉(zhuǎn) CmTreⅡ 基因水稻三株分別標(biāo)記為 TreⅡ-15（1）、TreⅡ-15（2）和 TreⅡ-17，并剪取它們的新鮮葉片。將試蟲(chóng)接于已剪下的轉(zhuǎn) CmTreⅡ 基因水稻葉片上，并使其取食轉(zhuǎn) CmTreⅡ 基因水稻葉片，再用包裹有棉花的細(xì)紗布將葉片包裹住，放進(jìn)直管中并作為另一端的封口。直管放入人工氣候箱中，飼養(yǎng)條件為溫度 26±1℃，RH 70%～80%，光周期 14L∶10D。每隔 12h ，觀察幼蟲(chóng)取食、表型及存活情況。每個(gè)直管放置 15 頭3 齡稻縱卷葉螟（5 頭做 q PCR實(shí)驗(yàn)，10 頭觀察表型，記錄死亡情況），同株 3 片轉(zhuǎn)基因水稻葉片，直管兩頭定期噴水以減緩水稻變黃的速度，觀察記錄稻縱卷葉螟對(duì)水稻的取食情況以及其表型變化情況，并拍照，記錄。以非轉(zhuǎn) CmTreⅡ 基因水稻葉片作為對(duì)照。期間每2d更換一次新鮮水稻葉片。

124熒光定量 PCR（RT-qPCR）檢測(cè)室內(nèi)抗蟲(chóng)性沉默效應(yīng)檢測(cè)

為在分子水平檢測(cè) RNAi 的效率，在稻縱卷葉螟 3 齡幼蟲(chóng)取食轉(zhuǎn) CmTreⅡ 基因水稻的 7 d后，分別收集空白對(duì)照組（即取食非轉(zhuǎn) CmTreⅡ 基因水稻的稻縱卷葉螟）、實(shí)驗(yàn)組（即取食轉(zhuǎn) CmTreⅡ 基因水稻的稻縱卷葉螟）各 2 頭存活的個(gè)體，分別提取其總 RNA，取 1μL RNA 反轉(zhuǎn)錄成各自的 cDNA 第一鏈。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為 20μL：Oligo（dT）18 Primer 2μL； Water， nuclease-free 10 μL； 5*Reaction Buffer 4μL； Rio Lock RNase Inhibitor 1μL（20U/μL）； 10Mm dNTP Mix 2μL； Revert Aid M-MuLVRT 1μL（200U/μL）。以稻縱卷葉螟看家基因 CmActin 為內(nèi)參基因，在 C1000 PCR 儀（Bio-Rad）上進(jìn)行熒光定量 PCR （RT-qPCR），檢測(cè) CmTre2 的表達(dá)水平，以空白組作為對(duì)照。q RT-PCR 反應(yīng)體系為 20μL：iTaq universal SYBRGreen supermix 10μL；上游引物 05μL （20μmol /L）；下游引物05μL （20μmol /L）；模板 c DNA 1μL，dd H2O 8μL。實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 采用三步法標(biāo)準(zhǔn)程序：第一步為 95℃ 預(yù)變性 1min，第二步為 95℃ 變性 10s，第三步為 60℃ 退火 20s，共進(jìn)行 40 個(gè)循環(huán)。反應(yīng)后進(jìn)行溶解曲線(xiàn)分析，以排除非特異性 PCR 產(chǎn)物的污染。設(shè) 3 次生物學(xué)重復(fù)。以 actin 作為內(nèi)參基因進(jìn)行相對(duì)定量。采用 Origin Pro 8軟件中 Pair Sample T-test 進(jìn)行 T 檢驗(yàn)，顯著性檢驗(yàn)水平 P < 005。

125死亡率與校正死亡率

為檢測(cè)干擾目標(biāo)基因后對(duì)稻縱卷葉螟的影響，在接蟲(chóng) 7 d 后，分別統(tǒng)計(jì)直管中取食轉(zhuǎn) CmTreⅡ 基因水稻的稻縱卷葉螟和取食非轉(zhuǎn) CmTreⅡ 基因水稻的稻縱卷葉螟的死亡情況，并計(jì)算其校正死亡率。死亡率計(jì)算公式為：死亡率（%）=死亡蟲(chóng)數(shù)/總蟲(chóng)數(shù)×100%；校正死亡率計(jì)算公式為：校正死亡率（%）=（處理組死亡率-對(duì)照組死亡率）/（1-對(duì)照組死亡率）×100%。采用 Origin Pro 8軟件中 Hypothesis Testing 中的 Pair Sample t-Test 進(jìn)行 T 檢驗(yàn)，顯著性檢驗(yàn)水平 P < 005。

126室外抗蟲(chóng)性卷葉率和白葉率檢測(cè)

轉(zhuǎn) CmTreⅡ 基因水稻對(duì)低齡幼蟲(chóng)具有較強(qiáng)的殺蟲(chóng)活性，對(duì)高齡幼蟲(chóng)也有一定的抗性， 其表現(xiàn)形式之一為拒食作用。本研究采用田間活體成株法進(jìn)行轉(zhuǎn)基因水稻 RNA 干擾效應(yīng)檢測(cè)[10]。但有研究報(bào)道指出，采用活體成株法進(jìn)行接蟲(chóng)鑒定后，有可能致使部分植株不能正常結(jié)實(shí)和留種，甚至導(dǎo)致植株枯死[11]。所以，本研究以稻縱卷葉螟 3 齡幼蟲(chóng)為試蟲(chóng)，從 70 株轉(zhuǎn) CmTreⅡ 基因水稻中挑選 25 株罩網(wǎng)進(jìn)行檢測(cè)（其余 45 株作為保種用）。田間種植 5 行，每行種植 5 株。在水稻生長(zhǎng)至分蘗盛期（7 月下旬），進(jìn)行人工接蟲(chóng)：將稻縱卷葉螟 3 齡幼蟲(chóng)接于所挑選轉(zhuǎn) CmTreⅡ 基因水稻植株葉片上，使其取食轉(zhuǎn) CmTreⅡ 基因水稻葉片。15d后，計(jì)算其卷葉率和白葉率。以 25 株非轉(zhuǎn) CmTreⅡ 基因水稻葉片作為對(duì)照。

127轉(zhuǎn)CmTreⅡ 基因抗蟲(chóng)水稻的遺傳性檢測(cè)

采用 EZNA Insect DNA Kit DNA 抽提試劑盒，分株提取轉(zhuǎn) CmTreⅡ 基因水稻的子 1 代水稻和非轉(zhuǎn) CmTreⅡ 基因水稻的子 1 代水稻的基因組 DNA。分別以各自的 DNA 為模板，以 Tre2-IF 和 Tre2-IR （表 1）為引物，對(duì)目的片段 CmTreⅡ 進(jìn)行PCR擴(kuò)增。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2結(jié)果與分析

21稻縱卷葉螟幼蟲(chóng)總 RNA 的提取

用 TRIzol（Invitrogen）分別提取取食轉(zhuǎn) CmTreⅡ 基因水稻葉片的稻縱卷葉螟和取食非轉(zhuǎn) CmTreⅡ 基因水稻葉片的稻縱卷葉螟各 5 頭的總 RNA，1% 凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果顯示 28S 和 18S 這兩條帶清晰且明亮，沒(méi)有出現(xiàn)拖尾和彌散帶的現(xiàn)象（圖 1），表明所提取 RNA 的完整度較好，沒(méi)有發(fā)生降解。紫外分光光度計(jì)測(cè)定其 A260/A280 為 193，說(shuō)明提取的總 RNA 質(zhì)量符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

22測(cè)室內(nèi)抗蟲(chóng)性沉默效應(yīng) RT-qPCR 檢測(cè)

RT-qPCR 檢測(cè)結(jié)果表明，在稻縱卷葉螟 3 齡幼蟲(chóng)取食轉(zhuǎn) CmTreⅡ 基因水稻葉片和取食非轉(zhuǎn) CmTreⅡ 基因水稻葉片 96h后，CmTre2 的表達(dá)水平顯著下降（圖 2）。CmTre2 的表達(dá)量相比空白對(duì)照下降了 2900%。CmTre2 的表達(dá)量在實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間差異顯著。結(jié)果表明轉(zhuǎn) CmTreⅡ 基因水稻葉片對(duì)稻縱卷葉螟體內(nèi)的CmTre2基因具有明顯的沉默效應(yīng)。

23死亡率與校正死亡率

在接蟲(chóng)7d后，取食轉(zhuǎn) CmTreⅡ 基因水稻葉片和取食非轉(zhuǎn) CmTreⅡ 基因水稻葉片的稻縱卷葉螟的死亡率分別為 5667% 和 10%，相較于空白對(duì)照組，增加了 4667%；校正死亡率為 5185% （表 3）。結(jié)果表明 RNA 干擾效應(yīng)相當(dāng)明顯，轉(zhuǎn) CmTreⅡ 基因水稻對(duì)稻縱卷葉螟產(chǎn)生嚴(yán)重的致死效應(yīng)。

24室外水稻卷葉率和白葉率檢測(cè)

在室外接蟲(chóng) 1 個(gè)月以后，轉(zhuǎn) CmTreⅡ 基因水稻葉片和非轉(zhuǎn) CmTreⅡ 基因水稻葉片的卷葉率分別為 1340% 和 2472%，相對(duì)于空白對(duì)照組，減少了 1132%；白葉率分別為 1247% 和 2257%，相較于對(duì)空白照組，減少了 1010% （表 4）。結(jié)果表明 RNA 干擾效應(yīng)相當(dāng)明顯，稻縱卷葉螟選擇性拒食轉(zhuǎn) CmTreⅡ 基因水稻。

25轉(zhuǎn) CmTreⅡ 基因抗蟲(chóng)水稻的遺傳性檢測(cè)

在轉(zhuǎn) CmTreⅡ 基因水稻的子 1 代水稻的 DNA 基因組中成功的擴(kuò)增出了目的片段 CmTreⅡ 基因片段；而非轉(zhuǎn) CmTreⅡ 基因水稻的子 1 代水稻的DNA基因組中未能成功的擴(kuò)增出目的片段 CmTreⅡ 基因片段。根據(jù)1% 瓊脂糖凝膠電泳的結(jié)果表明：轉(zhuǎn) CmTreⅡ 基因水稻的遺傳性良好。

3結(jié)論與討論

本文研究的是轉(zhuǎn) CmTreⅡ 基因水稻的抗蟲(chóng)性。經(jīng)過(guò)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn) CmTreⅡ 基因水稻的抗蟲(chóng)性明顯優(yōu)于對(duì)照組，在室內(nèi)抗蟲(chóng)性試驗(yàn)中，RT-qPCR 檢測(cè)結(jié)果表明，稻縱卷葉螟在取食轉(zhuǎn) CmTreⅡ 基因水稻的 96 小時(shí)后，CmTre2 基因的相對(duì)表達(dá)量比對(duì)照組下降了 2900%；7d后，實(shí)驗(yàn)組的死亡率為 5667%，相比對(duì)照組增加了 4667%。這與之前Mao等[12]對(duì)棉鈴蟲(chóng)等作物相應(yīng)基因的沉默效應(yīng)研究相吻合。如：Baum 等[13]研究發(fā)現(xiàn)含有表達(dá)液泡 ATP 酶基因 ds RNA 的轉(zhuǎn)基因玉米，可以明顯抵御玉米根螢葉甲對(duì)玉米的危害，使玉米根部遭受破壞的程度明顯減輕；Mao 等[12]研究發(fā)現(xiàn)棉鈴蟲(chóng)取食含有表達(dá)其 P450 基因（CYP6AE14）ds RNA 轉(zhuǎn)基因棉花后，棉鈴蟲(chóng) P450 基因的表達(dá)量明顯降低，害蟲(chóng)的食欲顯著降低，生長(zhǎng)發(fā)育變緩，最后死亡。目前RNAi 技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用到昆蟲(chóng)抗藥性功能基因分析、昆蟲(chóng)表觀遺傳學(xué)分析等領(lǐng)域。而在害蟲(chóng)防治領(lǐng)域，RNAi 技術(shù)研究的主要任務(wù)是通過(guò)抑制功能基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而降低害蟲(chóng)的適應(yīng)度甚至可以致死害蟲(chóng)。該技術(shù)針對(duì)性強(qiáng)，對(duì)作物和人畜無(wú)害，具有較大的應(yīng)用潛力。隨著轉(zhuǎn)基因植物研究的不斷深入，轉(zhuǎn)基因植物以其明顯的抗蟲(chóng)優(yōu)勢(shì)在研究上占據(jù)愈來(lái)愈重要的地位，越來(lái)越多的人研究 ds RNA 轉(zhuǎn)基因植物。

本研究采用的轉(zhuǎn) CmTreⅡ 基因水稻抗蟲(chóng)性室內(nèi)鑒定方法是以 3 齡幼蟲(chóng)校正死亡率為指標(biāo)，來(lái)評(píng)判轉(zhuǎn) CmTreⅡ 基因水稻抗蟲(chóng)性，比以往單純以幼蟲(chóng)死亡率為指標(biāo)更能客觀地反映參試材料的特性。

本研究還采用了室外田間試驗(yàn)來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn) CmTreⅡ 基因水稻的抗蟲(chóng)性。在室外抗蟲(chóng)性試驗(yàn)中，稻縱卷葉螟對(duì)水稻的取食量明顯下降，轉(zhuǎn) CmTreⅡ 基因水稻的卷葉率和白葉率分別為 1340% 和 1247%，相比對(duì)照組分別下降了 1132% 和 1010%；目前，對(duì)轉(zhuǎn) CmTreⅡ 基因水稻的室內(nèi)抗性評(píng)價(jià)多以幼蟲(chóng)死亡率為指標(biāo)。田間試驗(yàn)工作具有可靠性、真實(shí)性、科學(xué)性的高度統(tǒng)一的優(yōu)點(diǎn)。田間試驗(yàn)過(guò)程是驗(yàn)證轉(zhuǎn) CmTreⅡ 基因水稻的環(huán)境適應(yīng)性的過(guò)程，特別是對(duì)特定土壤、肥料、環(huán)境、特殊氣候的適應(yīng)性，可以進(jìn)一步確定轉(zhuǎn) CmTreⅡ 基因水稻的生產(chǎn)利用價(jià)值。而田間試驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)者的實(shí)驗(yàn)要求也很高，同時(shí)田間試驗(yàn)也不如室內(nèi)試驗(yàn)易于控制管理。在具體操作方面田間試驗(yàn)也需要注意許多問(wèn)題，如：土地肥力不勻會(huì)造成試驗(yàn)各小區(qū)差異較大；試驗(yàn)地選址不合理，因?yàn)橹車(chē)h(huán)境問(wèn)題形成小氣候?qū)ζ贩N試驗(yàn)結(jié)果也會(huì)造成影響，最終影響試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性；因此，合理布局，選好試驗(yàn)地也比較重要，試驗(yàn)地要有代表性能夠代表當(dāng)?shù)氐淖匀粭l件與農(nóng)業(yè)條件。同時(shí)也要求地勢(shì)開(kāi)闊或集中連片、肥力均勻、能灌能排、交通便利。本研究選擇的貴州省貴陽(yáng)市惠水縣的農(nóng)用田地，其自然條件與農(nóng)業(yè)條件均具有代表性，土地肥力均勻，能灌能排、交通便利等要求均達(dá)到了標(biāo)準(zhǔn)。

RNA干擾與其他基因沉默現(xiàn)象不同的是在植物和線(xiàn)蟲(chóng)中，RNA干擾具有傳遞性，可在細(xì)胞之間傳播，此現(xiàn)象被稱(chēng)作系統(tǒng)性RNA干擾（Systemic RNAi）。在某些昆蟲(chóng)中，RNAi也具有系統(tǒng)性，即RNAi信號(hào)可通過(guò)細(xì)胞之間的傳遞而到達(dá)整個(gè)生物體，甚至傳遞給后代。有關(guān)昆蟲(chóng) RNAi系統(tǒng)性信號(hào)傳播的研究發(fā)現(xiàn)，不同昆蟲(chóng)的RNAi信號(hào)傳播能力存在差異，其系統(tǒng)性反應(yīng)也有所不同。在某些昆蟲(chóng)如赤擬谷盜 Tribolium castaeum 和蟋蟀 Gryllus bimaculatus 之中發(fā)現(xiàn)，對(duì)親本實(shí)施 RNAi 在其子代中仍可觀察到基因沉默現(xiàn)象[14， 15]。本研究只是驗(yàn)證了轉(zhuǎn) CmTreⅡ 基因水稻的遺傳性，下一步本實(shí)驗(yàn)室還要針對(duì)取食了轉(zhuǎn) CmTreⅡ 基因水稻的稻縱卷葉螟的子代是否還會(huì)出現(xiàn)膜結(jié)合型海藻糖酶表達(dá)量降低的現(xiàn)象進(jìn)行研究。

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