劉標　易鳴　張依裕　王振　程朝友　楊德文　程均華　付正仙　王進

摘要：為了更好地保護和開發(fā)利用威寧綿羊這一優(yōu)良地方品種，本實驗利用威寧綿羊構(gòu)建DNA池，設計4對引物擴增威寧綿羊IGF-1基因外顯子及部分內(nèi)含子序列。將PCR產(chǎn)物純化并進行雙向測序，通過DNAStar生物軟件分析確定多態(tài)性位點。利用在線生物信息學軟件分析多態(tài)位點對IGF-1基因RNA的二級結(jié)構(gòu)、類胰島素生長因子1的二級和三級結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明，在擴增的IGF-1基因中篩選到3個SNPs：Intron1-A4387C、Exon2-T87C、Exon4-A27T，其中Exon4-A27T為錯義突變，導致編碼的精氨酸（Arg）變?yōu)榻z氨酸（Ser）；Exon2-T87C多態(tài)位點均未改變氨基酸的編碼，為同義突變；Intron1-A4387C在內(nèi)含子區(qū)，不參與氨基酸編碼。

關(guān)鍵詞：威寧綿羊；IGF-1基因；SNPs

中圖分類號：Q812

文獻標識碼：A

文章編號：1008-0457（2017）02-00082-04國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2017.02.018

Abstract：In order to protect and utilize the fine local variety， DNA pool of Weining sheep was constructed. 4 primers were designed to amplify exon and intron sequences of IGF-1 gene in Weining sheep . Products of PCR were purified and bidirectional sequenced to determine the SNPs. Influence of polymorphic sites on the RNA secondary and tertiary structure of IGF-1 gene was analyzed by online bioinformatics software. The result showed that 3 SNPs were detected in IGF-1 gene， namely Exon2-T87C， a synonymous mutation； Exon4-A27T， a missense mutation which changed the code of Arg into Ser； and Intron1-A4387C， a noncoding mutation in the intron.

Key words：Weining sheep； IGF-1 gene； SNPs

威寧綿羊的主產(chǎn)區(qū)為貴州省威寧縣，有悠久的飼養(yǎng)歷史，屬藏系山谷型粗毛綿羊。威寧綿羊體質(zhì)結(jié)實，個體矮小，生長速度慢，繁殖能力差，生產(chǎn)性能低下。因此，對威寧綿羊的育種工作，特別是分子輔助育種對威寧綿羊的保護和開發(fā)利用具有重要意義。

類胰島素生長因子（IGF）與胰島素原相似，是一種單鏈多肽，包括IGF-1和IGF-2。IGF-1能夠促進動物的生長，并且對胎兒的生長也有一定的作用，Breier B H等[1]研究發(fā)現(xiàn)，IGF-1基因缺失會使小鼠初生重下降。前人研究發(fā)現(xiàn)人類IGF-1基因5′調(diào)控區(qū)多態(tài)性與高度近視、身高肥胖和疾病的發(fā)生具有顯著相關(guān)性[2-4]。王明輝[5]通過研究IGF1-FoxO通路發(fā)現(xiàn)基因間的互作效應會對豬的生長性狀產(chǎn)生影響。張春香[6]通過對山羊IGF-1基因的多態(tài)性研究發(fā)現(xiàn)該基因的多態(tài)性顯著影響山羊的初生重和周歲體重。孫偉[7]以不同發(fā)育時期的湖羊為研究對象，采用熒光定量PCR技術(shù)對湖羊背最長肌中IGF-1基因的表達變化進行探究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IGF-1基因和湖羊背最長肌肌纖維的密度之間呈顯著負相關(guān)。

本實驗構(gòu)建威寧綿羊DNA池[8] （Sham P， 2002），篩選類胰島素生長因子1基因的SNP位點，并對多態(tài)位點作生物信息學分析，利用軟件估算等位基因頻率，研究SNP位點對類胰島素生長因子1基因的mRNA二級結(jié)構(gòu)和類胰島素生長因子結(jié)構(gòu)的影響，為后續(xù)實驗研究類胰島素生長因子1對威寧綿羊生長發(fā)育和生產(chǎn)性能的影響提供一定的參考。

1材料與方法

11實驗材料

實驗用到的動物是貴州省畢節(jié)市威寧縣綿羊，共采取了80只威寧綿羊血樣，采樣后低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

12DNA池的構(gòu)建

本實驗提取威寧綿羊血樣DNA所用的材料是生物公司提供的Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒，下一步進行電泳用自己配制的1%瓊脂糖凝膠，目的是檢驗DNA的提取是否達到預估的效果。在完成DNA的提取及電泳后，接下來測定所提取的DNA的濃度，用光度計儀（核心原理是：超微量紫外分光）對所提取的DNA進行檢測，檢查完濃度后將其濃度稀釋到100ng/μL備用，取3μL混合均勻的威寧綿羊DNA樣品構(gòu)建DNA池。

13目的片段的擴增

在NCBI數(shù)據(jù)庫中查詢到GenBank登錄號：NC_0194601為綿羊類胰島素生長因子1基因的DNA序列，引物的設計是利用生物軟件Primer 50做出了4對特異性引物，并送到生物公司進行合成，引物信息見表1。PCR反應體系為30μL：15μL 2×Es Taq Master Mix （含染料），3 μL模板DNA （Template DNA），72μL雙蒸水，上、下游引物各為24μL。進行PCR反應所用儀器是TC-512 PCR儀，PCR擴增條件：95攝氏度預變性5min；95攝氏度變性30s，分別在各對特異性引物對應的最適溫度（627℃），30μLs的時間退火，72攝氏度延伸一分鐘，循環(huán)次數(shù)為35，結(jié)束后循環(huán)溫度不變終止延伸5分鐘，4攝氏度溫度保存?zhèn)溆谩?/p>

14序列分析

PCR產(chǎn)物送到立菲生物技術(shù)有限公司進行測序，比對測序結(jié)果、分析確定多態(tài)位點使用DNAstar軟件。

15測序圖峰高測量及等位基因頻率估算

多態(tài)位點等位基因估算公式：Pi=Hi/（H1+H2）

式中i=1、2，Pi代表多態(tài)位點的各等位基因頻率，H1和H2分別代表測序峰圖上此多態(tài)位點各等位基因?qū)姆宓母叨取?/p>

16IGF-1基因的RNA二級結(jié)構(gòu)預測及蛋白結(jié)構(gòu)分析

RNA的二級結(jié)構(gòu)：http：//rnatbiunivieacat/cgi-bin/RNAfoldcgi

蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)：https：//npsa-prabiibcpfr/cgi-bin/npsa_automatpl？page=npsa_sopmahtml

蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)：http：//wwwsbgbioicacuk/phyre2/html/pagecgi？id=index

2結(jié)果與分析

21DNA池的PCR產(chǎn)物測序

將由4對引物特異性擴增出威寧綿羊IGF-1基因的目的序列送立菲生物技術(shù)有限公司經(jīng)膠回收純化后雙向測序，測序結(jié)果與綿羊IGF-1基因DNA序列（GenBank登錄號：NC_0194601）對比，確定為綿羊IGF-1基因序列。利用生物軟件分析共發(fā)現(xiàn)3個多態(tài)位點，以類胰島素生長因子1基因每一個外顯子第1位堿基計數(shù)為1，多態(tài)位點分別為：Intron1-A4387C、Exon2-T87C、Exon4-A27T，見圖1。這些SNPs是否在不同綿羊品種中普遍存在，需要進一步研究。SNPs能否造成威寧綿羊生長性能變化也需后續(xù)實驗進行研究。

22SNPs等位基因頻率估算

對威寧綿羊IGF-1基因三個多態(tài)位點的等位基因峰高用生物軟件進行測量，各等位基因多態(tài)位點頻率應用公式進行估算，所得估算結(jié)果呈現(xiàn)在表2中。由此可看出，不同SNP位點等位基因頻率有較大的差異。

23突變前后IGF-1的RNA二級結(jié)構(gòu)分析

對突變前后IGF-1基因RNA二級結(jié)構(gòu)利用在線軟件進行了檢測，分析和整理檢測結(jié)果，其中顯示為：所檢測的多態(tài)位點并沒有使RNA的二級結(jié)構(gòu)有顯著的變化情況。但導致RNA二級結(jié)構(gòu)最小自由能減小的是突變位點，結(jié)果中-64580 kcal/mol是由-64490kcal/mol所變。影響其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性可能是自由能的改變所致，因而改變后來蛋白質(zhì)的翻譯過程以及其相關(guān)功能的表達，由圖2可知。

24突變前后蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)分析

采用在線軟件預測威寧綿羊IGF-1基因突變前后蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果顯示：突變前后蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)未發(fā)生變化。

24突變前后蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)分析

利用在線預測軟件對威寧綿羊類胰島素生長因子1突變前后的三級結(jié)構(gòu)進預測分析，結(jié)果表明多態(tài)位點未導致威寧綿羊的類胰島素生長因子1三級結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著改變（圖3）。

3討論

類胰島素生長因子1分子結(jié)構(gòu)與胰島素分子類似，生物學功能和胰島素相似。Wang[9]以中國西南地區(qū)的十幾個山羊品種為試驗動物進行研究，研究結(jié)果顯示古蘭馬羊 IGF-1基因微5′側(cè)翼區(qū)的多態(tài)和產(chǎn)羔數(shù)顯著相關(guān)，對初生重的影響未達到顯著水平。曹海洋[10]通過對IGF-1基因與小尾寒羊體尺、產(chǎn)羔數(shù)及血液理化性質(zhì)等性狀的關(guān)聯(lián)分析研究發(fā)現(xiàn)，IGF-1基因和這些性狀有顯著關(guān)聯(lián)效應，認為IGF-1基因能夠作為小尾寒羊生產(chǎn)性狀的分子標記。因此，對威寧綿羊類胰島素生長因子1基因的研究有望改變威寧綿羊生產(chǎn)性能差，綿羊個體之間差距大的情況，對威寧綿羊種質(zhì)資源的保護和育種提供幫助。

本次研究在威寧綿羊IGF-1基因中檢測得到3個多態(tài)性位點： Intron1-A4387C、Exon2-T87C、Exon4-A27T，其中Exon4-A27T為錯義突變，導致編碼的精氨酸（Arg）變?yōu)榻z氨酸（Ser）；Exon2-T87C多態(tài)位點均未改變氨基酸的編碼，為同義突變；Intron1-A4387C在內(nèi)含子區(qū)，不參與氨基酸編碼。通過對四個SNP位點的等位基因頻率的比較發(fā)現(xiàn)，不同SNP位點等位基因頻率有較大的差異。Exon2-T87C、Exon4-A27T位點導致IGF-1基因RNA二級結(jié)構(gòu)自由能發(fā)生變化，可能影響RNA結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，從而影響蛋白質(zhì)的翻譯過程，錯義突變位點Exon4-A27T未導致蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變。

參考文獻：

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