龔露　鐘杰　高潔　佟碩秋　吳擁軍

摘要：以野生型煙草（Nicotiana tabacum）為試驗材料，采用RT-PCR克隆獲得CSN復合體亞基CSN4cDNA序列，基因登錄號為 KC866360。序列分析表明，CSN4基因ORF長為 1194bp，編碼398個氨基酸，蛋白分子質(zhì)量為4378kDa。將CSN4構建至原核表達載體，獲得重組子pET28a-CSN4/BL21（DE3），通過 Ni-IDA 親和層析純化目的蛋白，SDS-PAGE 和Western Blotting 檢測，結果顯示：025mM IPTG，15℃誘導16h獲得濃度為0476mg/mL、純度高達95%的CSN蛋白，為后續(xù)CSN4基因功能研究奠定了基礎。

關鍵詞：COP9信號復合體；基因克??；原核表達；親和純化

中圖分類號：Q78

文獻標識碼：A

文章編號：1008-0457（2017）02-0019-06國際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2017.02.004

Abstract：In this study， the COP9 signal complex subunit CSN4 cDNA sequence was cloned by RT-PCR amplification from the wild type Nicotiana tabacum， accession number KC866360 in GenBank database. Sequence analysis showed that the length of open reading frame of N. tabacum CSN4 gene was 1194bp， encoding 398 amino acids， and the molecular weight of the protein is 43.78kDa. The recombinant pET28a-CSN4/BL21 （DE3） had been obtained by cloning CSN4 gene into the prokaryotic expression vector pET28a. The target protein was purified by Ni- IDA affinity chromatography， and the results of SDS-PAGE and Western Blotting indicated that the recombinant strain was induced with 0.25mM IPTG at 15℃ for 16h， the target protein concentration was 0.476mg/mL and its purity was up to 95%， which was laid the foundation for further study protein-function.

Key words：COP9 signalosome； gene clone； prokaryotic expression； affinity purification

COP9（constitutively photomorphogennic 9）信號復合體（CSN）最早是在擬南芥光形態(tài)建成中發(fā)現(xiàn)，是植物光形態(tài)發(fā)生的一個負調(diào)節(jié)子[1]，CSN復合體由 8 個不同亞基組成，可依次命名為 CSN1-CSN8[2]。這一復合體亞基從多種生物中被克隆及分析，如家蠶、菊花、甘藍型油菜、蘋果、水稻等[3-7]。研究表明CSN是通過對SCF型E3-泛素連接酶（cullin蛋白）的去NEDD化來調(diào)控泛素降解系統(tǒng)[8-10]。CSN4的蛋白序列所含有的PCI （proteasome-COP9-initiation factor）結構域，可調(diào)節(jié)蛋白酶體的裝配、蛋白質(zhì)之間的相互作用以及植物激素的合成代謝，從而介導植物的抗蟲反應[11-14]。

實驗室前期在煙草中成功表達了ChIFN-γ（chicken interferon gamma）[15]，應用煙草全基因組表達譜芯片，篩選出轉(zhuǎn)基因煙草中的差異表達基因，通過GO及KEGG Pathway分析篩選與煙草抗蟲相關的候選基因，推測轉(zhuǎn)ChIFN-γ煙草的抗蟲機制可能主要基于類似JAK-STAT和MAPK的信號途徑調(diào)控下游特異性基因CSN4的表達引起依賴于JA或SA的植物防御反應，最終介導植物的抗病蟲反應[12]。有研究表明植物中CSN沉默減少傷口反應伴隨著茉莉酸（JA）的合成減少而水楊酸（SA）未改變，并且這些植物表現(xiàn)出對草食性幼蟲和腐殖真菌病原體灰葡萄孢的抗性降低，不僅對植物發(fā)育有影響，而且引起依賴JA植物防御反應[14]。

本文旨在通過原核表達獲得CSN4活性蛋白，為進一步研究ChIFN-γ與CSN4蛋白的互作關系，從而為進一步闡明轉(zhuǎn)基因煙草ChIFN-γ調(diào)控的信號轉(zhuǎn)導途徑奠定基礎，對開發(fā)CSN4蛋白，提高煙草的抗蟲性及品質(zhì)意義顯著。

1材料與方法

11材料與試劑

幼苗期40d煙草（Nicotiana tabacum）由貴州省煙草科學研究院提供；表達宿主菌 BL21（DE3）、原核表達載體pET-28a購自默克（中國）公司；限制性切酶EcoRΙ、SalΙ、Taq 酶、DL2000 DNA Marker、Prime ScriptTM One Step RT-PCR Kit Ver2試劑盒購自 TaKaRa （大連）公司；RNAperp pure Plant Kit購于北京天根公司；T4 DNA Ligase enzyme、EZNATM Gel Extraction Kit、EZNATM Plasmid Mini Kit I 購自 Promega 公司；Protein Marker、Western Blotting Marker、Ni-IDA 瓊脂糖凝膠、鼠抗His單克隆抗體、羊抗鼠多克隆抗體購自德泰生物（南京）有限公司；Bradford 蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。

12試驗方法

121CSN4的克隆

參照試劑盒說明書提取煙草葉片總RNA，以總RNA為模板采用一步法RT-PCR直接擴增目的片段，回收純化構建到pGEM-T載體并轉(zhuǎn)化到Ecoli DH5α，經(jīng)菌落PCR與質(zhì)粒PCR鑒定為陽性的菌株送至寶生物工程大連有限公司測序。

122目的基因與原核表達載體的構建

應用Primer Premier 5軟件設計特異性引物：上游引物5′- CGGAATTCATGGAGAGCGCGTTCGCTAG3′（含EcoRΙ）段，下游引物5′- GCGTCGACTTATCAGACAGGAATAGCG3′（含Sal Ι），PCR 反應程序為 94℃ 4min；94℃ 1min、55℃ 1min、72℃ 15min，30 個循環(huán)；72℃延伸 10min，用EcoR Ι和SalΙ對pET28a和目的基因片段雙酶切，膠回收后連接轉(zhuǎn)化到感受態(tài)表達宿主菌BL21（DE3），涂布于含50mg/L Kan 的LB培養(yǎng)基，選取菌落PCR與質(zhì)粒 PCR鑒定為陽性的菌落進行雙酶切鑒定。

123重組菌株pET28a-CSN4的誘導表達

挑取單菌落接種到 4mL 含 50mg/ L Kan的LB液體培養(yǎng)基中，180rpm培養(yǎng)至 OD600為05～06時加入終濃度為025mM的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG），分別置于15℃和37℃誘導表達。

124SDS-PAGE檢測

取1mL誘導表達的重組菌株培養(yǎng)液，12000rpm 離心1min，去除上清液，加等量PBS 液重懸沉淀，12000rpm 離心1min，沉淀加入100μL SDS-PAGE 2×loading Buffer煮沸10min，12000rpm 離心1min，取15μL上清液上樣，100V電泳。

125目的蛋白的純化及濃度的測定

采用Ni-IDA 親和層析對目的蛋白進行純化，經(jīng)誘導后的全菌用50mM Tris（pH80），150mM NaCl 含 1% Triton X-100，1μg/mL Pepstatin A，1μg/mL Leupeptin 超聲裂解（超3s停8s，25min），同時以50mM Tris（pH80），150mM NaCl 緩沖液平衡 Ni-IDA 親和層析柱，再用不同咪唑濃度的洗脫緩沖液對目的蛋白進行洗脫，收集不同組分進行12% SDS-PAGE 電泳分析，Bradford法測定蛋白濃度。

126Western Blotting 檢測目的蛋白

SDS-PAGE電泳鑒定后的膠100V，80min轉(zhuǎn)移至 PVDF 膜上，用5% 脫脂奶粉室溫封閉1h，加入鼠抗 His 單克隆抗體作為一抗，室溫孵育1h，PBST 緩沖液洗滌4次，每次4min，用羊抗鼠多克隆抗體作為二抗，室溫反應1h，PBST 洗滌4次后化學發(fā)光顯影拍片保存。

2結果與分析

21CSN4的克隆

提取煙草葉片總RNA（見泳道2），一步法RT-PCR擴增目的片段后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖1。1號泳道擴增出多條DNA條帶，但箭頭處出現(xiàn)與預期大小相符的擴增條帶。

膠回收目的DNA并構建至pMD18-T載體，菌落PCR與質(zhì)粒PCR驗證結果見圖2。結果表明在12kb處出現(xiàn)了與預期大小一致的特異性擴增條帶，測序顯示其長度是1194bp，編碼398個氨基酸，BLAST比對與番茄CSN4的序列同源性和蛋白同源性分別為94%和96%，說明克隆CSN4基因正確。

242包涵體通過親和層析純化CSN4 蛋白

包涵體經(jīng)洗滌溶解后，用不同濃度咪唑的平衡緩沖液洗脫目標蛋白，并收集每個洗脫組分進行SDS-PAGE分析檢測，結果見圖6。

26蛋白濃度的測定

采用Bradford測定蛋白濃度，以BSA作為標準蛋白質(zhì)，根據(jù)不同濃度在A595的吸光值繪制標準曲線回歸方程：Y=12285X2+06871X+00466，R2=09988，目的蛋白樣品的濃度達0476mg/mL，為CSN4基因功能研究奠定基礎。

3結論與討論

本研究克隆獲得基因CSN4 cDNA序列，基因登陸號為 KC866360序列，構建原核表達載體pET28a-CSN4/ BL21（DE3）并成功表達，純化包涵體蛋白獲得純度較高的目的蛋白。Western blotting初步證明該融合蛋白就是帶有His標簽的CSN4蛋白，為后續(xù)應用蛋白互作技術驗證在轉(zhuǎn)ChIFN-γ煙草中ChIFN-γ調(diào)控的信號轉(zhuǎn)導途徑中CSN4與ChIFN-γ的關系奠定基礎。

基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯在原核表達系統(tǒng)中是同步進行的，當?shù)鞍椎姆g速率過快而無充足的時間進行折疊時易堆積在一起形成包涵體[17-18]；另外包涵體的形成還與蛋白本身的性質(zhì)有關，疏水分布較多更容易形成包涵體。洗滌溶解后的包涵體經(jīng)His鎳柱純化（咪唑洗脫濃度分別為50、100、500mM），Ni親和層析柱可對帶有His標記的蛋白質(zhì)特異結合，蛋白在純化過程中易受到蛋白酶的攻擊而降解，SDS-PAGE檢測到50、100、500mM濃度的咪唑洗脫液洗脫出來的蛋白都有明顯的降解條帶，50、100mM咪唑的洗脫出的蛋白濃度沒有在500mM咪唑處的蛋白濃度高，在500mM咪唑處可洗脫獲得較高濃度蛋白。

ChIFN-γ作為一種動物來源的基因，其在植物體內(nèi)成功表達，并引起一系列植物表觀性狀的改變，對ChIFN-γ在植物體中介導的信號轉(zhuǎn)導途徑的研究具有重要意義。轉(zhuǎn)ChIFN-γ煙草的抗蟲性可能是由于ChIFN-γ激活了多種轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控與次級代謝物合成相關基因的表達，從而使轉(zhuǎn)基因植物表現(xiàn)出一定的抗蟲性。由于ChIFN-γ為動物來源抗病基因，能與動物細胞膜上特定的受體相結合而激活一系列的免疫反應。但轉(zhuǎn)入植物后，轉(zhuǎn)基因植株均表現(xiàn)出一定的抗蟲性，所以對ChIFN-γ是否直接作用于目的基因的研究，可進一步闡釋其抗蟲機制，對促進現(xiàn)代綠色循環(huán)農(nóng)業(yè)的高效發(fā)展具有重要意義。

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