謝穎　陳媞　龍友華　李榮玉　尹顯慧　李明　吳小毛

摘要：為了探明根際微生物數(shù)量與除草劑污染之間的關(guān)系，研究了異丙甲草胺對(duì)煙草植地根際與非根際土壤微生物的種群動(dòng)態(tài)變化、土壤呼吸強(qiáng)度及酶活性的影響。結(jié)果表明：根際土壤中微生物數(shù)量、土壤呼吸強(qiáng)度和酶活性均高于非根際土壤。根際土壤微生物對(duì)異丙甲草胺的敏感程度依次為真菌〉細(xì)菌〉放線菌；除過(guò)氧化氫酶外，根際土壤脫氫酶、脲酶及磷酸酶的活性與對(duì)照土壤均存在顯著差異。第60 d，異丙甲草胺在根際土壤中的降解率為8050%，半衰期為2682d，比在非根際土壤中的降解速率提高了121倍，半衰期縮短了1776%。

關(guān)鍵詞：異丙甲草胺；根際；土壤微生物；呼吸強(qiáng)度；酶活性

中圖分類號(hào)：S4828+92

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1008-0457（2017）02-0013-06國(guó)際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2017.02.003

Abstract：In order to investigate the relationship between the herbicide contamination and the number of microorganisms in plant rhizosphere soil， the effect of metolachlor on the microbial number， the intensity of soil respiration and the enzyme activity in tobacco rhizosphere and non-rhizosphere soils were studied. The results showed that the number of rhizosphere microorganisms， the soil respiration intensity and the enzyme activity were higher in rhizosphere soil than non-rhizosphere soil. The sensitivity of microorganisms to metolachlor in rhizosphere soil was in the order of fungi > bacteria> actinomycetes. Except for catalase， there were significant differences between activities of dehydrogenase， urease and phosphatase in the rhizosphere soil and in the non-rhizosphere soil. At 60th day， the degradation rate of metolachlor was 8050% and its half-life was 2682 day in rhizosphere soil. The degradation rates of metolachlor in rhizosphere soil were 121 times of that in non-rhizosphere soil. The degradation half-life of metolachlor in the rhizosphere soil was 1776% shorter than that in the non-rhizosphere soil.

Key words：metolachlor； rhizosphere； soil microorganism； respiration rate； enzymatic activit

根際環(huán)境與根際微生物是植物降解有毒有害有機(jī)污染物的基礎(chǔ)，農(nóng)藥等有機(jī)污染物影響下的根際土壤與一般土壤在pH、養(yǎng)分組成狀況、微生物組成、酶活性等存在顯著的差別，這些都直接影響一年生單子葉及部分雙子葉雜草的防除時(shí)施用的接影響有機(jī)污染物在土壤-植物系統(tǒng)中的遷移和轉(zhuǎn)化行為[1]。

異丙甲草胺作為持效期較長(zhǎng)的酰胺類選擇性芽前除草劑，廣泛使用煙草、水稻、大豆田中一年生單子葉及部分雙子葉雜草的防除[2]。目前，已有異丙甲草胺的研究主要有異丙甲草胺對(duì)根際土壤微生物數(shù)量的影響及其在根際環(huán)境中的降解研究、異丙甲草胺對(duì)芹菜根際與非根際生物活性的影響、異丙甲草胺及其高效體對(duì)我國(guó)南方潮土微生物的影響、異丙甲草胺防除煙地雜草效果評(píng)價(jià)等，但未見(jiàn)異丙甲草胺對(duì)煙地根際微生物及土壤酶活性的影響的相關(guān)報(bào)道[3-6]。為此從異丙甲草胺對(duì)土壤微生物種群動(dòng)態(tài)變化及土壤呼吸作用，土壤根際與非根際酶活性以及其殘留等方面探討異丙甲草胺對(duì)土壤環(huán)境質(zhì)量的影響提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

11供試藥品

異丙甲草胺標(biāo)準(zhǔn)品（≥988%）購(gòu)自美國(guó)迪馬科技有限公司；72%異丙甲草胺乳油購(gòu)自江西日上化工有限公司；乙腈（色譜純）；純凈水（用前過(guò)045μm水系濾膜過(guò)濾）購(gòu)自杭州娃哈哈集團(tuán)。試驗(yàn)中其他藥品和試劑均為分析純。

12供試土壤

土壤采自貴州花溪烤煙種植試驗(yàn)地中，以烤煙K326煙株為中心15cm半徑范圍鏟出整個(gè)土塊，抖落大塊土壤后的煙株根系連同與之緊密黏附的土壤置于保鮮袋帶回實(shí)驗(yàn)室，仔細(xì)刷下并收集黏附于煙株根系的土壤，風(fēng)干，過(guò)1mm篩，作為煙株根際土壤。

13試驗(yàn)方法

分別稱取500g花溪植煙土壤于1000mL 燒杯中，加入1mL含異丙甲草胺的甲醇溶液，使其濃度分別為1、3、6、9、12mg/kg，待甲醇揮發(fā)后攪拌均勻，用無(wú)菌蒸餾水調(diào)節(jié)土壤濕度為田間最大持水量的60%，每個(gè)處理均設(shè)置3次重復(fù)，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照。土樣于25℃培養(yǎng)箱中恒溫黑暗培養(yǎng)1、3、7、14、21、30、45和60d后取樣測(cè)定真菌、細(xì)菌和放線菌數(shù)量、過(guò)氧化氫酶、脫氫酶、脲酶和磷酸酶的活性、土壤呼吸強(qiáng)度，及異丙甲草胺殘留量。在整個(gè)試驗(yàn)階段，適時(shí)補(bǔ)水保持土壤含水量不變。

14分析方法

土壤微生物計(jì)數(shù)采用固體平板梯度稀釋涂布培養(yǎng)計(jì)數(shù)法，細(xì)菌用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)，放線菌用改良高氏1號(hào)培養(yǎng)基培養(yǎng)，真菌用查彼克氏培養(yǎng)基培養(yǎng)；土壤呼吸強(qiáng)度采用直接吸收法（密閉法）滴定測(cè)定[7]；過(guò)氧化氫酶活性采用高錳酸鉀滴定法測(cè)定；脲酶活性采用靛酚藍(lán)比色法測(cè)定；由于供試土壤pH為632，故按中性磷酸酶測(cè)定方法測(cè)定土壤磷酸酶活性；脫氫酶采用三苯基四氮唑氯化物（TTC）比色法測(cè)定[8]。以上試驗(yàn)均采用室內(nèi)模擬方法，設(shè)4個(gè)對(duì)照，每個(gè)對(duì)照設(shè)3次重復(fù)，其中1個(gè)處理設(shè)為空白對(duì)照，取三次重復(fù)的平均值。

2結(jié)果與分析

21異丙甲草胺影響下根際土壤微生物區(qū)系的動(dòng)態(tài)變化

異丙甲草胺影響下根際土壤細(xì)菌數(shù)量的變化如圖1所示。由圖可知，在整個(gè)試驗(yàn)期內(nèi)，根際土細(xì)菌數(shù)量均高于非根際土；經(jīng)異丙甲草胺處理根際與非根際土壤，細(xì)菌的生長(zhǎng)開(kāi)始被抑制，然后被促進(jìn)。在試驗(yàn)前期（1～7d），與對(duì)照土壤相比，施用異丙甲草胺處理后，根際與非根際土壤細(xì)菌的生長(zhǎng)均受到抑制，在第1d時(shí)抑制作用達(dá)到最大值。隨后，各處理的抑制作用逐漸減弱，異丙甲草胺在第14d時(shí)對(duì)根際土壤細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制效應(yīng)消失，開(kāi)始促進(jìn)細(xì)菌生長(zhǎng)，且促進(jìn)效應(yīng)一直繼續(xù)到試驗(yàn)結(jié)束，并且細(xì)菌數(shù)量均顯著高于對(duì)照土壤（p<005）。經(jīng)異丙甲草胺處理根際土壤的細(xì)菌數(shù)量在21d到達(dá)最大值，其中處理根際土壤細(xì)菌數(shù)量比對(duì)照根際土壤的增加了2407%，而非根際土壤細(xì)菌數(shù)量比對(duì)照土壤的降低了993%。此時(shí)，處理根際土壤細(xì)菌數(shù)量是處理非根際土壤的109倍，即處理土壤的根際效應(yīng)R/S（每克根際土壤中所含的微生物數(shù)與非根際土壤的相應(yīng)值之比）為101，而對(duì)照土壤的根際效應(yīng)R/S為106，差異均達(dá)到顯著水平（p<005）。

從圖2可以看出，異丙甲草胺對(duì)根際與非根際土壤真菌的生長(zhǎng)一直表現(xiàn)為促進(jìn)作用，30～60d內(nèi)，真菌數(shù)量均顯著高于對(duì)照土壤。異丙甲草胺處理土壤真菌數(shù)量在14d時(shí)均到達(dá)最大值，其中根際土壤真菌數(shù)量比對(duì)照土壤增加了3098%，相應(yīng)的非根際土壤真菌數(shù)量比對(duì)照土壤增加了2600%，此時(shí)處理土壤的根際效應(yīng)R/S也達(dá)到峰值為112，對(duì)照土壤的根際效應(yīng)R/S為108，差異達(dá)到顯著水平（p<005）。在整個(gè)試驗(yàn)周期內(nèi)，無(wú)論是處理土壤還是對(duì)照土壤，根際土中的真菌數(shù)量均要高于非根際土，但在試驗(yàn)后期（45～60d），根際與非根際土壤的真菌數(shù)量之間不存在顯著差異。

異丙甲草胺毒害下根際土壤放線菌數(shù)量的變化見(jiàn)圖3。在培養(yǎng)期間，根際土壤放線菌數(shù)量均高于非根際土壤；異丙甲草胺對(duì)放線菌生長(zhǎng)的影響為抑制-恢復(fù)-刺激。處理后1～14d，與對(duì)照土壤相比，異丙甲草胺處理下的放線菌生長(zhǎng)受到抑制，1d時(shí)抑制作用最大，根際土壤的最大抑制率為1460%，非根際土壤的抑制率為1441%。異丙甲草胺處理土壤根際土壤的放線菌數(shù)量在14d時(shí)達(dá)到峰值，此時(shí)，處理土壤的根際效應(yīng)R/S也達(dá)到最大值為107，差異也達(dá)顯著水平（p<005）。14d后抑制作用逐漸減弱，異丙甲草胺處理的根際土壤放線菌數(shù)量在21d時(shí)恢復(fù)到對(duì)照水平，30d時(shí)開(kāi)始促進(jìn)放線菌生長(zhǎng)，且促進(jìn)作用一直繼續(xù)到試驗(yàn)結(jié)束，但差異不顯著。在整個(gè)試驗(yàn)周期內(nèi)，無(wú)論是處理土壤還是對(duì)照土壤，根際土中的放線菌數(shù)量均要高于非根際土。

22異丙甲草胺影響下根際土壤呼吸的動(dòng)態(tài)變化

異丙甲草胺對(duì)根際土壤呼吸的影響如圖4所示。由此可知，與非根際土相似，施用異丙甲草胺對(duì)根際土壤呼吸均有一定的刺激作用，在3d時(shí)，土壤呼吸強(qiáng)度達(dá)到了最高值，異丙甲草胺處理的根際土壤呼吸強(qiáng)度比對(duì)照土壤和對(duì)照非根際土增加了1994%，相應(yīng)的非根際土壤呼吸強(qiáng)度比對(duì)照土壤的增加了1589%，處理根際比處理非根際土增加了1595%，即處理土壤的根際效應(yīng)R/S為116，對(duì)照土壤的根際效應(yīng)R/S為112，差異均達(dá)到顯著水平（p<005）。隨后異丙甲草胺對(duì)根際土壤呼吸的刺激作用逐漸減弱。經(jīng)異丙甲草胺處理根際土壤的呼吸在7～60d內(nèi)繼續(xù)保持刺激狀態(tài)，而非根際土壤的呼吸強(qiáng)度在45d時(shí)基本與對(duì)照持平。在整個(gè)試驗(yàn)周期內(nèi)，根際土壤呼吸強(qiáng)度均高于非根際土壤。

23異丙甲草胺影響下根際土壤酶活性的動(dòng)態(tài)響應(yīng)

施用異丙甲草胺后，根際與非根際土壤過(guò)氧化氫酶活性的響應(yīng)如圖5所示。在整個(gè)試驗(yàn)期內(nèi)，各處理根際土壤的過(guò)氧化氫酶活性均高于對(duì)照土壤；異丙甲草胺處理根際土壤的過(guò)氧化氫酶活性呈現(xiàn)激活-恢復(fù)的變化趨勢(shì)。在試驗(yàn)前期（1～14d），各處理對(duì)土壤過(guò)氧化氫酶活性均有一定的激活作用，激活作用均在1d時(shí)最為強(qiáng)烈，異丙甲草胺處理后，根際土壤過(guò)氧化氫酶活性比對(duì)照土增加了3024%，相應(yīng)的非根際土壤酶活性僅增加2064%，處理土壤的根際效應(yīng)R/S為115，而對(duì)照土壤的根際效應(yīng)R/S為105。顯著性分析表明，各處理的激活作用逐漸減弱，至第21d時(shí)，激活效應(yīng)消失，均表現(xiàn)為抑制作用，異丙甲草胺處理非根際土壤的酶活性在21d時(shí)也顯著低于對(duì)照土壤，30d左右異丙甲草胺對(duì)根際與非根際土壤酶活性的抑制作用消失，過(guò)氧化氫酶受到第二次激活，且激活效應(yīng)一直繼續(xù)到試驗(yàn)結(jié)束，但酶活性與對(duì)照土壤不存在顯著差異（p<005）。

圖6可以看出，在試驗(yàn)的各個(gè)時(shí)期，無(wú)論是對(duì)照土樣，還是處理土樣，根際土的脫氫酶活性均比同期的非根際土壤酶活性要高。與非根際土相似，在整個(gè)培養(yǎng)期間，經(jīng)異丙甲草胺處理后，根際土壤脫氫酶活性的變化為激活-抑制-恢復(fù)-激活。在試驗(yàn)初期（1～3d），除草劑對(duì)土壤脫氫酶活性均有一定的激活作用，激活作用和根際效應(yīng)在3d時(shí)達(dá)到峰值，施用異丙甲草胺的根際土壤脫氫酶活性為對(duì)照土壤的10973%，相應(yīng)的非根際土壤酶活性為對(duì)照土壤的10437%，處理土壤和對(duì)照土壤的根際效應(yīng)R/S為113，差異均達(dá)顯著水平（p<005）。3d后，各處理對(duì)脫氫酶的刺激作用逐漸降低，異丙甲草胺處理根際與非根際土壤的酶活性均在7d時(shí)恢復(fù)至對(duì)照水平，在14d時(shí)被顯著抑制（p<005），30d時(shí)酶活性恢復(fù)至正常水平，45d時(shí)脫氫酶受到第二次激活，且酶活性顯著高于對(duì)照土壤，并一直繼續(xù)至試驗(yàn)結(jié)束。

異丙甲草胺對(duì)根際與非根際土壤脲酶活性的影響見(jiàn)圖7。經(jīng)異丙甲草胺處理后，根際土壤脲酶活性的變化如圖7所示，與非根際土壤相似，在整個(gè)試驗(yàn)期間，異丙甲草胺對(duì)土壤脲酶活性的影響呈現(xiàn)先抑制、后恢復(fù)、再激活的變化動(dòng)態(tài)。異丙甲草胺對(duì)根際土壤脲酶活性的抑制作用在7d時(shí)達(dá)到最大值，處理根際土壤脲酶活性比對(duì)照土壤降低了684%，相應(yīng)的處理非根際土壤酶活性比對(duì)照土壤的降低了651%，此時(shí)異丙甲草胺處理土壤根際效應(yīng)R/S也達(dá)到峰值為109，且相應(yīng)對(duì)照的根際效應(yīng)與R/S為108，均存在顯著差異（p<005）。7d后異丙甲草胺對(duì)土壤酶活性的抑制作用逐漸降低，21d時(shí)均恢復(fù)至對(duì)照水平，并在45d時(shí)高于對(duì)照土壤。在整個(gè)試驗(yàn)期內(nèi)，無(wú)論是處理土壤還是對(duì)照土壤，根際土樣脲酶活性均要高于非根際土樣。

異丙甲草胺影響下根際土壤磷酸酶活性的變化見(jiàn)圖8。從圖可以看出，培養(yǎng)期間，根際土磷酸酶活性均高于同期的非根際土。在試驗(yàn)前期（1～21d），與非根際土壤相似，除草劑處理下的根際土壤磷酸酶均受到抑制，7d時(shí)，抑制效應(yīng)達(dá)到峰值，異丙甲草胺處理根際土壤的磷酸酶活性為對(duì)照土壤的8477%，相應(yīng)的非根際土壤酶活性為對(duì)照土壤的8362%，而處理根際土壤酶活性為處理非根際土壤的11284%，即處理土壤的根際效應(yīng)R/S為113，而對(duì)照土壤的根際效應(yīng)R/S為111，存在顯著差異（p<005）。14d后異丙甲草胺對(duì)根際土壤磷酸酶的抑制作用逐漸減弱，在30d時(shí)恢復(fù)至對(duì)照水平，異丙甲草胺處理土壤的酶活性于45d后高于對(duì)照土壤，60d時(shí)差異均達(dá)顯著水平（p<005）。

24異丙甲草胺在根際土壤中的降解動(dòng)態(tài)

異丙甲草胺在根際土壤與非根際土壤中的降解動(dòng)態(tài)如圖9所示。試驗(yàn)初期（1～3d），異丙甲草胺在土壤中的降解不明顯，有一個(gè)延遲期，可能是因?yàn)橥寥乐形⑸飳?duì)外來(lái)污染物有一個(gè)馴化或適應(yīng)過(guò)程。第7d開(kāi)始，異丙甲草胺降解速度加快，尤其是在根際土壤中，在第60d，根際土壤中異丙甲草胺的降解率為8050%，而在非根際土壤中的降解率僅為7383%，差異均達(dá)到顯著水平（p<005）。異丙甲草胺在根際土壤中的降解也可用一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程模擬（表1），根際土壤中異丙甲草胺的降解速率常數(shù)為00259，相應(yīng)的半衰期為2682d；非根際土壤中異丙甲草胺的降解速率常數(shù)為00213，其半衰期為325d。與非根際土壤相比，根際土壤中異丙甲草胺的降解速率提高了121倍，半衰期縮短了1776%。

3結(jié)論

（1）在整個(gè)試驗(yàn)周期內(nèi)，異丙甲草胺影響下根際土壤中三大類群微生物的數(shù)量均高于非根際土壤微生物，這與異丙甲草胺對(duì)根際土壤微生物數(shù)量的影響及其在根際環(huán)境中的降解研究結(jié)果相符。真菌對(duì)異丙甲草胺最為敏感，細(xì)菌次之，放線菌則具有一定的抗性。培養(yǎng)期間，經(jīng)處理后的土壤的細(xì)菌和放線菌的生長(zhǎng)呈現(xiàn)出抑制、恢復(fù)或激活的變化動(dòng)態(tài)。

（2）施用異丙甲草胺對(duì)根際土壤呼吸均有一定的刺激作用，在3d時(shí)，土壤呼吸強(qiáng)度達(dá)到了最高值，隨后異丙甲草胺對(duì)根際土壤呼吸的刺激作用逐漸減弱，在隨后的7～60d繼續(xù)保持刺激狀態(tài)，而非根際土壤的呼吸強(qiáng)度在45d時(shí)基本與對(duì)照持平。在整個(gè)試驗(yàn)周期內(nèi)，根際土壤呼吸強(qiáng)度均高于非根際土壤。這與異丙甲草胺及其高效體對(duì)潮土微生物的影響結(jié)果相近[9]。

（3）本研究表明，無(wú)論是處理土壤還是對(duì)照土壤，根際土樣中四種酶的活性均要高于非根際土壤。異丙甲草胺對(duì)土壤過(guò)氧化氫酶和磷酸酶活性的影響表現(xiàn)為激活-抑制-恢復(fù)的變化動(dòng)態(tài)，且對(duì)過(guò)氧化氫酶激活或抑制程度與濃度成正比。對(duì)脫氫酶活性的影響呈現(xiàn)為激活-抑制-恢復(fù)-激活，這與試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)68mg/kg和68mg/kg的Rac-異丙甲草胺及S-異丙甲草胺對(duì)脫氫酶活性的影響為先激活、后抑制、再激活的研究結(jié)果相近[10]；土壤脲酶活性變化則呈現(xiàn)“抑制-激活-恢復(fù)-抑制”趨勢(shì)，這與丁草胺對(duì)脲酶活性的影響大致相符[11]。

（4）研究表明，從第7 d開(kāi)始，異丙甲草胺降解速度在根際土壤中高于非根際土壤中，第60d，根際土壤中異丙甲草胺的降解率為8050%，而在非根際土壤中的降解率僅為7383%，差異均達(dá)到顯著水平（p<005）。根際有機(jī)污染物消解加快與根際區(qū)微生物數(shù)量及活性改變關(guān)系密切[12-14]。

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