田應(yīng)志　崔真華　牟慧蓉　錢(qián)成　黃蘭　封竣淇　羅衛(wèi)星

摘要：本研究旨在探討肝臟型脂肪酸結(jié)合蛋白（L-FABP）基因遺傳變異與貴州白山羊生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)性，以期得到能夠影響貴州白山羊各群體生長(zhǎng)性狀顯著效應(yīng)的分子遺傳標(biāo)記。試驗(yàn)采用DNA池、PCR-SSCP法結(jié)合PCR產(chǎn)物直接測(cè)序?qū)F州白山羊L-FABP 基因4個(gè)外顯子進(jìn)行SNPs篩選，并利用SPSS 180統(tǒng)計(jì)軟件分析H-FABP基因遺傳變異與生長(zhǎng)性狀間的相關(guān)性。多態(tài)位點(diǎn)檢測(cè)表明，貴州白山羊L-FABP基因內(nèi)含子兩處存在C4557T和A4575G兩個(gè)多態(tài)基因座；遺傳效應(yīng)分析表明，L-FABP基因C4557T和A4575G位點(diǎn)多態(tài)座位有利于提高貴州白山羊體重、體高、體斜長(zhǎng)和管?chē)渲谢蛐虲CGG有利于提高貴州白山羊成年母羊的體高和體斜長(zhǎng)；TTGG有利于提高貴州白山羊周歲母羊的體重和管?chē)?。研究結(jié)果初步推測(cè)L-FABP基因可能影響貴州白山羊部分生長(zhǎng)性狀的主效基因或與主效基因連鎖，其多態(tài)座位可能作為山羊生長(zhǎng)性狀選擇的有效遺傳標(biāo)記。

關(guān)鍵詞：貴州白山羊；L-FABP基因；遺傳變異；生長(zhǎng)性狀

中圖分類號(hào)：Q751；S827

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1008-0457（2017）02-0006-07國(guó)際DOI編碼：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2017.02.002

Abstract：The aim of this study was to explore the correlation between the genetic variation of L-FABP gene and the growth traits of Guizhou white goat in order to obtain molecular genetic markers that could affect the goats growth traits. The SNPs of four different exons of L-FABP genes of Guizhou white goat were screened by DNA pooling and PCR-SSCP combined with PCR product direct sequencing. The correlation between the genetic variation of L-FABP gene and the growth traits was analyzed by SPSS （18.0） software. Examination of the polymorphism loci showed that two SNPs （C4557T and A4575G） were presented in the Intron 2 of L-FABP gene. The effect analysis showed that the polymorphic loci of C4557T and A4575G sites of L-FABP gene can improve body weight， body height， body length and pipe circumference. The genotype CCGG can be in favour of improving body height and body length of adult ewes. The genotype TTGG can be in favour of improving body weight and pipe circumference in aging ewes. The results indicated that L-FABP gene would be a potential major gene or a gene linked to other major genes affecting goat growth traits； its polymorphic loci could be used as effective genetic markers for goat growth traits to guide the molecular breeding of goats.

Key words：Guizhou white goat； L-FABP gene； genetic variation； growth traits

肝臟型脂肪酸結(jié)合蛋白（Live fatty acid binding protein， L-FABP）是脂肪酸結(jié)合蛋白家族（Fatty acid binding proteins， FABPs）重要組成部分，又稱Z-蛋白，亞鐵血紅素蛋白，是一種與遺傳相關(guān)的脂肪酸連接蛋白家族成員，在哺乳動(dòng)物中，主要表達(dá)場(chǎng)所是肝臟組織和小腸，在人的腎臟中也有少量表達(dá)[1]。L-FABP基因由4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子組成，有127個(gè)氨基酸殘基和2個(gè)脂肪酸結(jié)合位點(diǎn)，分子量約為144 kDa[2]。L-FABP與FABPs家族成員間氨基酸序列的同源性達(dá)3870%，主要由核苷酸鏈的N端附近兩條短的α-螺旋和10條反平行的β-鏈正交的折疊組成，此外L-FABP 還具有一個(gè)特殊打開(kāi)的β-桶型結(jié)構(gòu)的蓋子，β-桶型結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性較強(qiáng)，其空間構(gòu)型不易發(fā)生化學(xué)修飾、大分子熒光物質(zhì)以及基因突變的改變[3]。因L-FABP表達(dá)場(chǎng)所主要在肝臟中，所以L-FABP 表達(dá)水平的改變可影響脂肪肝、肝硬化以及肝癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系，并有望作為肝損傷早期高敏感檢測(cè)指標(biāo)[4-7]。L-FABP還可通過(guò)脂肪酸來(lái)調(diào)控脂肪的沉積影響動(dòng)物生長(zhǎng)，該基因在畜牧生產(chǎn)領(lǐng)域的研究主要集中在其遺傳變異與豬肉質(zhì)性能和雞脂肪性狀及組織表達(dá)方面[8-10]。

關(guān)于L-FABP基因遺傳變異與貴州地方山羊品種的生長(zhǎng)性狀的相關(guān)研究則鮮見(jiàn)報(bào)道，本研究以貴州喀斯特地區(qū)獨(dú)特的地方優(yōu)良山羊品種—貴州白山羊?yàn)檠芯繉?duì)象，采用DNA池、PCR-SSCP法結(jié)合PCR產(chǎn)物直接測(cè)序檢測(cè)L-FABP基因外顯子的多態(tài)性，分析其遺傳變異與生長(zhǎng)性狀的相關(guān)性，為尋找L-FABP基因可能作為影響貴州白山羊生長(zhǎng)性狀的分子遺傳標(biāo)記提供依據(jù)。

1材料與方法

11試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用12～48月齡貴州白山羊成年羊223只（公羊?yàn)?3只，母羊?yàn)?00只），均來(lái)自貴州白山羊的中心產(chǎn)區(qū)—貴州省沿河縣新景鄉(xiāng)，飼養(yǎng)管理、營(yíng)養(yǎng)水平和免疫程序相同，健康無(wú)病。每只試羊頸靜脈采血8mL置于EDTA-K2抗凝真空采血管中，顛倒混勻，置于-20℃保存?zhèn)溆?。同時(shí)按要求詳實(shí)記錄每個(gè)個(gè)體體重、體高、體斜長(zhǎng)、胸圍和管?chē)?個(gè)生長(zhǎng)性狀指標(biāo)數(shù)據(jù)。

12血液基因組DNA的提取

本試驗(yàn)采用Ezup 柱式基因組DNA 抽提試劑盒（血液），采購(gòu)于生工生物工程（上海）股份有限公司，按說(shuō)明書(shū)詳細(xì)進(jìn)行試羊個(gè)體基因組DNA的提取。最后經(jīng)12%的瓊脂糖凝膠檢測(cè)，稀釋成終濃度為100～200ng/L，于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

13引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)NCBI中GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中山羊L-FABP基因（登錄號(hào)為NC_0223031，REGION： 4739238147397985）相關(guān)序列，利用NCBI中的 Premier -Blast 和Premier 50軟件針對(duì)該基因全部外顯子區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物，共設(shè)計(jì)5對(duì)引物（詳見(jiàn)表1），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

變性劑（98%去離子甲酰胺，25mmol/L EDTA，0025%二甲苯青，0025%溴酚藍(lán)），于100℃沸水浴中變性15min，置于-20℃冰箱中保存15min，同時(shí)將15%的非變性聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行250V電壓預(yù)電泳30min，待點(diǎn)樣完成先進(jìn)行250V電壓預(yù)電泳30min，后改為120V電壓電泳13～15h，最后銀染顯色判型，挑選不同基因型個(gè)體（各3個(gè)）的PCR產(chǎn)物送北京諾賽公司和上海英駿生物技術(shù)有限公司測(cè)序。

15數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析

PCR-SSCP數(shù)據(jù)分析：統(tǒng)計(jì)基因型頻率、等位基因頻率、多態(tài)信息含量、有效等位基因數(shù)和群體雜合度，并進(jìn)行卡方適合性檢驗(yàn)。采用SPSS 180軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和關(guān)聯(lián)分析，建立最小二乘線性模型：Y=μ+G+P+S+G*S + G*P+P*S+e，式中Y為性狀表型值，μ 為群體平均值，G為基因型效應(yīng)，P為群體效應(yīng)，S為性別效應(yīng)，G*S 為基因型和性別互作效應(yīng)， G*P為基因型和群體互作效應(yīng)，P*S為群體和性別互作效應(yīng)，e為殘差效應(yīng)。結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2結(jié)果與分析

21PCR產(chǎn)物檢測(cè)

用12%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，結(jié)果見(jiàn)圖1，擴(kuò)增片段整齊、單一無(wú)拖尾，大小與預(yù)期結(jié)果一致，表明引物特異性較好，可直接用于下一步試驗(yàn)。

22PCR產(chǎn)物與SSCP檢測(cè)結(jié)果

如圖2所示，在貴州白山羊引物L(fēng)5的PCR 產(chǎn)物中分別檢測(cè)到C4557T和A4575G兩個(gè)多態(tài)座位，其余引物PCR 產(chǎn)物中未發(fā)現(xiàn)多態(tài)位點(diǎn)。根據(jù)DNA混合池所發(fā)現(xiàn)的C4557T位點(diǎn)和A4575G位點(diǎn)（位于內(nèi)含子2處），設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，用于下一步進(jìn)行PCR-SSCP試驗(yàn)，檢測(cè)群體中每個(gè)個(gè)體突變位點(diǎn)處基因型（圖3所示），在試驗(yàn)群體中檢測(cè)到2類等位基因，分別為C和T 及A和G，共出現(xiàn)6種合并基因型，分別為CCGG、CTGG、CTAG、CCAA、CTAA和TTGG，其中CCGG為A基因型，CTGG為B基因型，CTAG為C基因型，CCAA為D基因型，CTAA為E基因型，TTGG為F基因型，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序峰圖詳見(jiàn)圖4。

23L-FABP基因C4557T和A4575G變異位點(diǎn)群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

統(tǒng)計(jì)分析C4557T和A4575G位點(diǎn)在貴州白山羊公母羊群和全群中的遺傳結(jié)構(gòu)，如表2所示，對(duì)于L-FABP基因C4557T位點(diǎn)，三個(gè)群體（全群、♀和♂）均以C為優(yōu)勢(shì)等位基因，其等位基因頻率分別為06592、06700和05653，C4557T位點(diǎn)在三個(gè)試驗(yàn)群體中的多態(tài)信息含量PIC表現(xiàn)均為中度多態(tài)（025005），而公羊群X2檢驗(yàn)顯示該基因型分布處于Hardy-Weinberg 非平衡狀態(tài)（P<005）。

對(duì)于L-FABP基因A4575G位點(diǎn)，該位點(diǎn)存在3種基因型，除公羊基因型分布表現(xiàn)為GG>AG>AA外，其余分布表現(xiàn)為AA>GG>AG。母羊群和全群中，A為優(yōu)勢(shì)等位基因，等位基因頻率分別為05269和05400，公羊群中，G為優(yōu)勢(shì)等位基因，等位基因頻率為05870；純合度較為接近，A4575G位點(diǎn)在三個(gè)試驗(yàn)群體中的多態(tài)信息含量PIC表現(xiàn)均為中度多態(tài)（025005），在公羊群中分布處于Hardy-Weinberg 非平衡狀態(tài)（P<005）。

24SNPs位點(diǎn)各效應(yīng)對(duì)生長(zhǎng)性狀的影響

根據(jù)固定效應(yīng)模型分析（表3），L-FABP 基因C4557T位點(diǎn)僅在體斜長(zhǎng)中不存在性別效應(yīng)（P>005），其余指標(biāo)均存在性別效應(yīng)（P<005），各指標(biāo)無(wú)基因型效應(yīng)和基因型和群體互作效應(yīng)（P>005）；A4575G位點(diǎn)在體重和體斜長(zhǎng)中無(wú)性別效應(yīng)（P>005），其余指標(biāo)均存在性別效應(yīng)（P>005），總體上各指標(biāo)均不存在基因型和性別與群體互作效應(yīng)（P>005）。

25L-FABP基因C4557T和A4575G位點(diǎn)多態(tài)座位效應(yīng)分析

L-FABP基因C4557T和A4575G位點(diǎn)多態(tài)座位效應(yīng)分析結(jié)果（表4）：該基因多態(tài)座位共得到6種不同的基因型，其中成年羊（♂）基因型CCGG、TTGG和周歲羊（♂）TTGG樣本個(gè)數(shù)為1，相關(guān)分析時(shí)不予以考慮，而相關(guān)分析中無(wú)周歲羊（♂）和成年羊（♂）基因型CTAG和CCAA，結(jié)果顯示，不同多態(tài)座位與貴州白山羊各生長(zhǎng)指標(biāo)間差異顯著或差異極顯著（P<005， 001）。成年羊（♀）基因型CCGG個(gè)體的體高和體斜長(zhǎng)以及CTAA個(gè)體的體斜長(zhǎng)極顯著和顯著高于CCAA個(gè)體（P<005，001），而CCGG個(gè)體體斜長(zhǎng)比CTAA個(gè)體高；而CCAA個(gè)體管?chē)@著低于CTAG和CTGG個(gè)體；其余指標(biāo)均差異不顯著且成年羊（♂）各基因型的各個(gè)指標(biāo)均差異不顯著（P>005）。周歲羊（♀） TTGG型個(gè)體的體重極顯著高于CCGG個(gè)體（P< 001），顯著高于CCAA個(gè)體（P<005），而CCGG個(gè)體的體高和胸圍顯著低于CTAG個(gè)體，其管?chē)@著低于CTAA和TTGG，各基因型對(duì)體斜長(zhǎng)差異不顯著（P>005）。周歲羊（♂）基因型CTGG個(gè)體的胸圍和CTAA個(gè)體的管?chē)@著高于CCGG個(gè)體（P<005），其余指標(biāo)均差異不顯著（P>005）。

3討論與結(jié)論

31L-FABP基因多態(tài)性檢測(cè)及其遺傳結(jié)構(gòu)分析

以貴州白山羊?yàn)樵囼?yàn)對(duì)象進(jìn)行DNA池篩選多態(tài)位點(diǎn)的文獻(xiàn)已有報(bào)導(dǎo)，包括不同基因的多態(tài)性與貴州白山羊的生長(zhǎng)性狀、肉質(zhì)性狀和血液免疫指標(biāo)的關(guān)聯(lián)性研究[11-15]。本試驗(yàn)研究在貴州白山羊L-FABP基因共4個(gè)外顯子處進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)，結(jié)果未在L-FABP基因外顯子處篩選出SNPs，而在Intron2處發(fā)現(xiàn)C4557T和A4575G兩個(gè)多態(tài)基因座位；在C4557T和A4575G位點(diǎn)處，試驗(yàn)群體的有效等位基因數(shù)均接近2，表明所對(duì)應(yīng)的等位基因在群體中分布均勻，三個(gè)試驗(yàn)群體位點(diǎn)均處于中度多態(tài)。在母羊和全群中分布均符合Hardy-Weinberg平衡，而公羊群中分布則處于Hardy-Weinberg非平衡狀態(tài)，這可能是由于公羊群選種和選配不平衡，受遷徙因素的影響較大；也有可能是公羊受到高度選擇的原因，導(dǎo)致公羊群體偏離了Hardy-Weinberg平衡規(guī)律。

32L-FABP基因多態(tài)性與山羊生長(zhǎng)性狀的關(guān)聯(lián)分析

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)L-FABP基因的SNP位點(diǎn)在內(nèi)含子區(qū)域，但其不同基因型對(duì)貴州白山羊生長(zhǎng)性狀仍有關(guān)聯(lián)，說(shuō)明該基因較為保守，外顯子區(qū)較難出現(xiàn)突變，而內(nèi)含子序列對(duì)基因表達(dá)調(diào)控的作用也尚未被闡明，但有可能作為調(diào)控元件影響基因表達(dá)水平。對(duì)L-FABP基因進(jìn)行固定效應(yīng)模型分析，發(fā)現(xiàn)其多態(tài)位點(diǎn)均存在群體效應(yīng)，而除體斜長(zhǎng)外，其余指標(biāo)均存在性別和群體互作效應(yīng)，可進(jìn)行下一步相關(guān)性分析。對(duì)L-FABP基因 C4557T和A4575G位點(diǎn)多態(tài)座位效應(yīng)分析顯示：成年母羊的不同基因型對(duì)體高、體斜長(zhǎng)和管?chē)笜?biāo)均差異極顯著或顯著，而體重是衡量山羊生長(zhǎng)發(fā)育狀況的重要指標(biāo)，各基因型對(duì)體重和胸圍指標(biāo)差異不顯著，由此可以推測(cè)因各基因型對(duì)胸圍指標(biāo)呈差異不顯著間接影響了體重指標(biāo)；周歲母羊的各基因型對(duì)其體重、體高、胸圍和管?chē)町悩O顯著或顯著，由此可以驗(yàn)證上面的推測(cè)結(jié)果，表明各基因型的體重和胸圍之間存在一定的關(guān)聯(lián)性。本研究中成年母羊、周歲母羊和公羊的各基因型對(duì)管?chē)町愶@著，由此可以推測(cè)管?chē)鷮?duì)成年母羊、周歲公羊和母羊的生長(zhǎng)有重要影響。

由結(jié)果可知，L-FABP基因基因型CCGG有利于提高成年貴州白山羊母羊的體高和體斜長(zhǎng)，基因型TTGG為有利于提高周歲貴州白山羊母羊的體重和管?chē)?，該基因型?duì)山羊生長(zhǎng)性能具有促進(jìn)作用，可作為促進(jìn)山羊生長(zhǎng)候選基因型應(yīng)用于貴州白山羊生長(zhǎng)性能輔助選育。

致謝：本研究對(duì)相關(guān)部門(mén)的支持表示衷心的感謝！

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