高 紅，侯思琰

（1.天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學(xué)院，天津 300350；2.水利部海河水利委員會水資源保護(hù)科學(xué)研究所，天津 300170）

光合細(xì)菌對棉稈機(jī)械漿廢液的轉(zhuǎn)化條件研究

高 紅1，侯思琰2

（1.天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學(xué)院，天津 300350；2.水利部海河水利委員會水資源保護(hù)科學(xué)研究所，天津 300170）

造紙過程中產(chǎn)生的棉漿廢液是較難降解的高濃度有機(jī)廢水，但利用其作為培養(yǎng)光合細(xì)菌的基質(zhì)，生產(chǎn)有益微生物制劑，可實現(xiàn)循環(huán)經(jīng)濟(jì)。本文通過實驗，稀釋5倍的棉漿廢液，當(dāng)初始pH為7.0，培養(yǎng)溫度為30℃時，最有利于光合細(xì)菌的生長。5 %的接種量，培養(yǎng)16h可使光合細(xì)菌達(dá)到較大密度；利用熱風(fēng)循環(huán)烘干箱，可實現(xiàn)光合細(xì)菌液的固定化，載體與菌體質(zhì)量之比為1.5∶1。

棉桿機(jī)械漿；廢液；光合細(xì)菌；培養(yǎng)基；生長條件

中國是農(nóng)業(yè)大國，每年產(chǎn)生大量的棉稈廢棄物，棉稈本身的化學(xué)形態(tài)及纖維結(jié)構(gòu)使它成為一種較為優(yōu)質(zhì)的造紙原料，作為非木材纖維原料，棉稈在造紙工業(yè)中日益受到青睞。棉稈與APMP技術(shù)相結(jié)合已大規(guī)模應(yīng)用于瓦楞原紙的本色漿生產(chǎn)，既能夠緩解造紙資源緊缺，又達(dá)到廢棄物資源化的目的。但隨之而來的問題是APMP廢水屬于高濃度有機(jī)廢水，用普通的生化方法較難處理。常用的厭氧(UASB)-好氧(SBR)組合技術(shù)可使APMP廢水的CODCr去除率達(dá)90.3%，但仍未達(dá)到造紙工業(yè)廢水污染物排放標(biāo)準(zhǔn)[1-2]。

棉漿廢液中含有大量的纖維素及其分解產(chǎn)生的低分子量的半纖維素﹑甲醛﹑醋酸﹑乙酸﹑多糖﹑果膠﹑蛋白等多種營養(yǎng)物質(zhì)，是一種天然的微生物培養(yǎng)基。通過研究，利用這些營養(yǎng)成分作為培養(yǎng)光合細(xì)菌的基質(zhì)，生產(chǎn)出有益微生物制劑，可實現(xiàn)環(huán)境保護(hù)和循環(huán)經(jīng)濟(jì)的雙重效果。

1 實驗部分

1.1 主要儀器

QYC 200恒溫空氣搖床，SPECTRUM 756PC紫外分光光度計，X5-212顯微鏡，DELTA 320 pH計，SPX-150生物培養(yǎng)箱，CRMDX-280滅菌鍋。

1.2 實驗原料及實驗菌種來源

實驗研究的廢液取自河北省某造紙廠利用棉稈作為造紙原料的APMP制漿后的擠出液，CODCr為43000mg·L-1左右，pH值為8左右，色度在30000倍以上。實驗采用的光合細(xì)菌為實驗室保藏的紅假單孢菌。

2 試驗方法

2.1 實驗菌株的純化

按照稀釋平板分離法，將實驗室保藏的光合細(xì)菌液稀釋接種于平板上，于28～30℃﹑4000勒克斯(LX)的光源（相當(dāng)于60W的白熾燈）下光照培養(yǎng)，至長出菌落為止。在平板上選擇分離較好的有代表性的光合細(xì)菌單菌落接種斜面，同時作涂片檢查，進(jìn)一步劃線分離，或制成菌懸液再做稀釋分離，直至獲得純培養(yǎng)體。純化后的單菌落形態(tài)見表1。

表1 本菌株純化后單菌落的形態(tài)Tab.1 The strains were purified single colony morphology

2.2 培養(yǎng)條件

在500mL三角燒瓶中進(jìn)行光合細(xì)菌的培養(yǎng)。將稀釋一定倍數(shù)的棉漿廢液和光合細(xì)菌培養(yǎng)基各100mL分別裝入三角燒瓶中，滅菌后調(diào)節(jié)pH值在7.0左右，接種光合細(xì)菌時母液OD660值為3.0。置于28℃﹑200 r·min-1的恒溫空氣搖床中振蕩培養(yǎng)，一定時間后分別用血球板作菌的計數(shù)。同時測定光合細(xì)菌培養(yǎng)基培養(yǎng)過程中660nm下菌懸液吸光度的OD660值。作出菌濃度隨時間變化的趨勢圖，即為該菌的生長曲線。

3 實驗結(jié)果與分析

3.1 選擇適宜的棉漿廢液稀釋倍數(shù)

實驗所用廢液為棉稈經(jīng)APMP機(jī)械制漿后的擠出液，過程中只加入了NaOH堿液，以降低棉稈原料中纖維與木質(zhì)素﹑半纖維素之間的結(jié)合強(qiáng)度，所以擠出廢液中仍保留有棉稈本身的大量天然營養(yǎng)物質(zhì)，這些成分非常適宜用作微生物培養(yǎng)基[3-4]。棉稈的主要化學(xué)成分見表2。

表2 棉稈的主要化學(xué)成分Tab.2 The main component of cotton stalk chemical

將棉漿廢液分別稀釋5﹑7.5﹑10﹑50﹑100倍后直接滅菌作培養(yǎng)基，接種5%光合細(xì)菌后，上搖床振蕩培養(yǎng)18h，血球板計數(shù)。不同稀釋倍數(shù)對光合細(xì)菌生長的影響如表3所示。

表3 不同稀釋倍數(shù)下光合細(xì)菌的生長情況Tab.3 The growth of photosynthetic bacteria in different dilutions

表3的數(shù)據(jù)表明，直接稀釋棉漿廢液作為培養(yǎng)基，光合細(xì)菌可以生長，說明棉漿廢液中的氮碳源及微量元素足以滿足光合細(xì)菌生長的需要。在稀釋5～100倍的范圍內(nèi)，稀釋倍數(shù)越小，越有利于光合細(xì)菌的生長。但由于棉漿廢液中有大量的不溶物存在，稀釋倍數(shù)過大則不利于光合細(xì)菌的生長，故在后面的實驗中選擇5倍的稀釋梯度。

3.2 光合細(xì)菌在兩種不同培養(yǎng)基中的生長曲線

兩種培養(yǎng)基中接種5 %的光合細(xì)菌，搖床振蕩培養(yǎng)。每隔4h用血球板計數(shù)棉漿液培養(yǎng)基中的菌數(shù)，測定光合細(xì)菌培養(yǎng)基的吸光度，做生長曲線，并在光合細(xì)菌培養(yǎng)基最大吸光度下做光合細(xì)菌的計數(shù)。兩種培養(yǎng)基中光合細(xì)菌的生長情況如圖1﹑圖2所示。

圖1 光合細(xì)菌培養(yǎng)基中菌的生長情況Fig.1 Photosynthetic bacteria culture medium of bacteria

圖2 棉漿廢液培養(yǎng)基中菌的生長情況Fig.2 Cotton pulp waste liquid culture medium of bacteria

圖1表明，在光合細(xì)菌培養(yǎng)基中，光合細(xì)菌在40h達(dá)到吸光度最大值，此時菌的密度最大，達(dá)到2×109個·mL-1。圖2表明，光合細(xì)菌在棉漿液中16h就已基本達(dá)到穩(wěn)定期，因此可以縮短光合細(xì)菌的培養(yǎng)時間，減少能耗。其穩(wěn)定期的菌數(shù)與光合細(xì)菌培養(yǎng)基吸光度達(dá)到最大值時的菌數(shù)相比增長約有1倍，并且對數(shù)增長期提前，穩(wěn)定期增長。資料表明[5]，有機(jī)酸以及糖類﹑維生素類物質(zhì)含量較高，可以補充培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分。同時，可以使培養(yǎng)基相對長時間地維持在適合紅假單胞菌屬生長的中性偏酸性環(huán)境中，這些對于光合細(xì)菌的生長都是有利的。

3.3 兩種培養(yǎng)基中pH的變化

光合細(xì)菌在兩種培養(yǎng)基中pH的變化情況如圖3所示。圖3表明，與光合細(xì)菌培養(yǎng)基相比，棉漿廢液在培養(yǎng)光合細(xì)菌過程中pH有一較大幅度的降低，至指數(shù)生長初期達(dá)最低點(pH=6.6)。這一變化可能是棉漿廢液中的糖類物質(zhì)被細(xì)菌轉(zhuǎn)化成有機(jī)酸，而后又被進(jìn)一步利用的結(jié)果。偏酸性環(huán)境有利于紅假單胞菌的生長。當(dāng)棉漿廢液組光合細(xì)菌生長接近穩(wěn)定期時，培養(yǎng)液中的pH值已與對照組相差無幾。

圖3 光合細(xì)菌在兩種培養(yǎng)基中pH的變化Fig.3 Photosynthetic bacteria in two kinds of medium pH change

3.4 不同接種量的影響

將棉漿廢液分別接種2%﹑5%﹑10%﹑15%的光合細(xì)菌，在搖床培養(yǎng)16h后用血球板作計數(shù)，不同接種量對光合細(xì)菌生長的影響如表4所示。表4的數(shù)據(jù)表明，接種量過小，會影響最終菌的濃度。在5%～15%之間隨著接種量提高，最終菌的濃度變化不大。故選擇5 %的接種量。

表4 不同接種量下光合細(xì)菌的生長情況Tab.4 The growth of photosynthetic bacteria of different inoculation quantity

3.5 不同初始pH值的影響

將光合細(xì)菌以相同的接種濃度接種于棉漿廢液培養(yǎng)基中，將初始pH值分別調(diào)節(jié)為6.0﹑6.5﹑7.0﹑7.5﹑8.5﹑9.5，28℃﹑黑暗﹑搖床振蕩培養(yǎng)，在1d﹑3d后測定pH值。不同初始pH值下光合細(xì)菌的生長情況如表5所示。

表5 不同初始pH下光合細(xì)菌的生長情況Tab.5 The growth of photosynthetic bacteria under different initial pH

菌液pH的升高可作為光合細(xì)菌生長繁殖的標(biāo)志，在初始pH為6.5～8.5的條件下試驗，菌株均能生長，初始pH為7.0時生長效率最高，初始pH為8.5時，菌液的pH上升緩慢，故用棉漿廢液培養(yǎng)光合細(xì)菌的最適pH為7.0左右。

3.6 最適生長溫度的測定

在不同溫度下振蕩培養(yǎng)20h后，用血球板計數(shù)菌株生長量。光合細(xì)菌隨溫度的生長情況如圖4所示。

圖4 光合細(xì)菌隨溫度的生長情況Fig.4 Photosynthetic bacteria with the growth temperature

圖4表明，溫度過低或過高都會影響光合細(xì)菌的生長繁殖情況。培養(yǎng)溫度在25～35℃范圍內(nèi)，菌株生長情況都較好，其中，30℃時菌株生長量達(dá)到最高，說明30℃是菌株的最適生長溫度。

3.7 不同充氧方式下棉漿廢液培養(yǎng)光合細(xì)菌的研究

在2.5L玻璃瓶中加入稀釋5倍的棉漿廢液，接種5%的光合細(xì)菌，微孔曝氣使溶氧達(dá)到8 mg·L-1。每4h測定光合細(xì)菌的生長情況。光合細(xì)菌在兩種充氧方式下的生長情況如圖5所示。

圖5 光合細(xì)菌在兩種充氧方式下的生長情況Fig.5 The growth of photosynthetic bacteria in two oxygen chargingmode

圖5表明，光合細(xì)菌在曝氣培養(yǎng)條件下更早進(jìn)入對數(shù)增長期，菌的濃度也比搖床培養(yǎng)的菌濃度大。16h菌的個數(shù)就達(dá)到5×109個·mL-1，這對工程中縮短培養(yǎng)光合細(xì)菌的時間，大規(guī)模培養(yǎng)光合細(xì)菌有非常重要的意義。

3.8 用載體固定棉漿廢液培養(yǎng)的光合細(xì)菌

生物物料加熱脫水常會引起熱損傷，使活菌大量失活[6]。因此，在少量菌種保藏時常采用冷凍脫水或低溫真空脫水。但若采用冷凍或低溫真空干燥的方法進(jìn)行工業(yè)規(guī)模的菌液脫水，會使產(chǎn)品的成本驟增。本試驗將光合細(xì)菌吸附于載體上，采用低溫?zé)峥諝庾鳛楦稍锝橘|(zhì)使菌液脫水。試驗以過10號篩后的鋸末作為載體，與棉漿廢液培養(yǎng)的光合細(xì)菌液（平均每mL含菌體40億）按照重量比1.5∶1，將菌液均勻噴灑在載體上。由于細(xì)鋸末為多孔性顆粒，故可吸附較多的菌液。將混合后的載體放入熱風(fēng)循環(huán)烘干箱中，設(shè)定溫度為40℃，并啟動風(fēng)機(jī)排濕，直至測得載體水分低于10%為止。取載劑于裝有無菌水的試管中充分振蕩，沉淀后取澄清液平板計數(shù)，每g載體中有活菌2×109個，說明干燥后菌體存活率達(dá)到75 %。

4 小結(jié)

1）采用棉漿廢液培養(yǎng)光合細(xì)菌，提高了光合細(xì)菌的菌株密度，促進(jìn)了光合細(xì)菌生長，便于濃縮﹑制造固體菌制劑，降低了廢水處理和菌體生產(chǎn)成本，為棉稈制漿廢液資源化利用提供了一條新思路。

2）光合細(xì)菌在稀釋一定倍數(shù)的棉漿廢液中可以生長，且總菌數(shù)有較大提高，對數(shù)增長期提前且穩(wěn)定期延長，縮短了培養(yǎng)周期。棉漿廢液中的有機(jī)酸和纖維素等為光合細(xì)菌提供了營養(yǎng)成分，這與中草藥的浸提液促進(jìn)光合細(xì)菌的生長原理相似[7]。此外，棉漿廢液中的有機(jī)酸均為弱酸，在培養(yǎng)液中起緩沖作用，有利于光合細(xì)菌的生長。

3）稀釋5倍的棉漿廢液，當(dāng)初始pH為7.0，培養(yǎng)溫度為30℃時最有利于光合細(xì)菌的生長；5 %的接種量，培養(yǎng)16h可使光合細(xì)菌達(dá)到較大密度，在工程上能縮短培養(yǎng)光合細(xì)菌的時間，減少能耗。

4）在2.5L玻璃瓶中曝氣培養(yǎng)光合細(xì)菌，16h后菌數(shù)達(dá)到5×109個·mL-1，微孔曝氣充氧方式可進(jìn)一步提高光合細(xì)菌的菌株密度。利用熱風(fēng)循環(huán)烘干箱，可實現(xiàn)光合細(xì)菌液的固定化，載體與菌體質(zhì)量之比為1.5∶1。

[1] 武書彬.造紙工業(yè)水污染控制與治理技術(shù)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2001.

[2] E.Scholten, T.Lukow, G.Auling, RM.Kroppenstedt, F.Rainey, H.Diekmann. Thauera mechernichensis sp.nov., an aerobic denitrifier from a leachate treatment plant[J]. Int-J-Syst-Bacteriology, 1999, 49(3): 1045-1051.

[3] 王菊華.中國造紙原料纖維特性及顯微圖譜[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，1999.

[4] 楊淑惠.植物纖維化學(xué)[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，2001.

[5] 許兵，周新婷，徐懷恕，等.幾種中草藥對光合細(xì)菌生長的促進(jìn)作用[J].青島海洋大學(xué)學(xué)報，1994，24(1)：47-51.

[6] 潘永康，龐金釗，李占勇.光合細(xì)菌液吸附于載體的振動流化床干燥[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，1995(1)：32-35.

[7] 莢榮，王怡平，洪旭華，等.中草藥在光合細(xì)菌開發(fā)中的應(yīng)用[J].中草藥，1999， 30(4)：293-295.

Photosynthetic Bacteria Transforming Conditions of Cotton Stalk Mechanical Pulp Wastewater

GAO Hong1, HOU Siyan2
(1.Tianjin Modern Vocational Technology College ,Tianjin 300350,China; 2.Research Institute of Water Resources Protection Science of Haihe River Resources Committee ,Tianjin 300170,China)

Cotton pulp wastewater was high concentration organic wastewater and diffcult degradation. Using it as a microbial culture photosynthetic bacteria and benefcialmicrobial agents, could realize the circular economy. Through the experiment, cotton pulp wastewater diluted 5 times, initial pH=7, temperature 30℃ was most conducive to the growth of photosynthetic bacteria. Inoculation 5%, 16h of culture could make the photosynthetic bacteria reach the higher density. Using hot air circulation drying box, immobilized photosynthetic bacteria liquid could be realized, carrier, and the biomass mass ratio was 1.5: 1.

cotton stalk mechanical pulp; wastewater; photosynthetic bacteria; medium; growth conditions

X 793

A

1671-9905(2017)04-0045-04

高紅（1981-），女，漢族，副教授，碩士，主要從事環(huán)境污染治理，E-mail：gh0121@126.com，Tel：13920631981

2017-02-23