韓曉偉，馮紅，馮建明，嚴玉平，張丹，鄭開顏，鄭玉光

1.河北中醫(yī)學(xué)院，河北 石家莊 050200；2.安國數(shù)字本草檢驗中心有限公司，河北 安國 071200

干旱脅迫對柴胡中柴胡皂苷合成途徑關(guān)鍵酶活性及柴胡皂苷含量的影響

韓曉偉1，馮紅2，馮建明1，嚴玉平1，張丹1，鄭開顏1，鄭玉光1

1.河北中醫(yī)學(xué)院，河北 石家莊 050200；2.安國數(shù)字本草檢驗中心有限公司，河北 安國 071200

目的 研究干旱脅迫對柴胡中柴胡皂苷合成途徑關(guān)鍵酶活性及皂苷含量的影響，從蛋白水平揭示柴胡對干旱脅迫的響應(yīng)。方法 通過盆栽控水試驗，設(shè)置土壤飽和含水量的70%～80%、60%～70%、40%～50%、20%～30%共4個水平栽培柴胡。采用酶聯(lián)免疫法檢測6個月和1年生柴胡根中4種柴胡皂苷合成途徑關(guān)鍵酶3-羥基-3-甲基-戊二酸單酰輔酶A還原酶（HMGR）、異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶（IPPI）、法尼基焦磷酸合酶（FPS）和β-香樹素合成酶（β-AS）的活性，采用HPLC檢測不同土壤飽和含水量情況下樣品中柴胡皂苷a、d的含量。結(jié)果 柴胡苗在飽和含水量40%～50%時4種酶的活性最高，在飽和含水量60%～70%、70%～80%時次之，在飽和含水量20%～30%時最低，柴胡皂苷a、d含量變化與酶活性變化趨勢相似。結(jié)論 40%～50%土壤飽和含水量能顯著提高柴胡皂苷合成途徑關(guān)鍵酶活性，且柴胡皂苷含量與酶活性之間呈顯著正相關(guān)，說明在干旱脅迫下，柴胡通過調(diào)節(jié)柴胡皂苷合成途徑關(guān)鍵酶活性來調(diào)節(jié)柴胡皂苷的合成，對干旱脅迫作出響應(yīng)。

干旱脅迫；柴胡；酶活性；柴胡皂苷

柴胡Bupleurum chinense DC.為傘形科柴胡屬植物，是《中華人民共和國藥典》規(guī)定的藥用柴胡主要來源之一[1]。柴胡所含的主要有效成分柴胡皂苷是一種齊墩果烷類型的三萜皂苷，主要為柴胡皂苷a和柴胡皂苷d。柴胡皂苷屬于次生代謝產(chǎn)物，是柴胡抵御脅迫的產(chǎn)物，也是主要的藥效成分[2-3]。柴胡皂苷合成的途徑主要由3部分組成[4]，首先合成前體物質(zhì)異戊烯焦磷酸（IPP）、二甲基丙烯基焦磷酸（DMAPP）、法呢基焦磷酸（FPP），在此基礎(chǔ)上合成2,3-角鯊烯氧化物環(huán)化合成齊墩果烷型或達瑪烷型三萜骨架，最后是三萜類骨架在細胞色素P450、糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷酶等酶的修飾下形成皂苷[5-6]。在上述過程中，HMG-CoA還原酶（HMGR）催化3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（HMG-CoA）生成甲羥戊酸（MVA），MVA在MVA激酶、磷酸MVA激酶和脫羧酶的作用下形成IPP，異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶（IPPI）催化IPP和DMAPP之間的可逆轉(zhuǎn)化，法呢基焦磷酸合酶（FPS）催化FPP的形成，β香樹脂合成酶（β-AS）催化形成β-香樹素[7]，這些酶均為柴胡皂苷合成途徑中關(guān)鍵的限速酶。

干旱是影響植物生長、生存和分布的重要環(huán)境因子之一。柴胡主要分布在我國干旱和半干旱地區(qū)，目前，隨著全球暖干化，干旱脅迫普遍存在，而且呈現(xiàn)出加劇的趨勢，因此，研究柴胡對干旱脅迫的響應(yīng)機理就顯得尤為重要。黃璐琦等[8]研究逆境脅迫對藥材的作用后提出了道地藥材形成的逆境效應(yīng)理論，即藥用植物在適度的逆境下可以提高其藥效成分的積累。近年來，國內(nèi)外對柴胡的研究主要集中在柴胡的藥理作用[9]、真?zhèn)舞b定[10-15]和栽培[16]等方面，而對柴胡干旱脅迫下的分子響應(yīng)機制研究較少，因此，本研究通過設(shè)置土壤的含水量人為模擬干旱條件，探討干旱脅迫對柴胡皂苷合成途徑關(guān)鍵酶活性的影響，從而為進一步研究干旱脅迫對柴胡皂苷積累的影響奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

GL-20G-II型冷凍離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠；EPOCH酶標儀購自美國伯騰儀器公司；Eppendorf移液槍；MGC-P型光照培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；賽默飛OMS100烘箱；沃特世2695高效液相色譜系統(tǒng)。

植物HMGR、β-AS、FPS和IPPI酶聯(lián)免疫分析試劑盒（批號均為201512），上海酶聯(lián)生物科技有限公司；柴胡皂苷a對照品（批號110777-201510）、柴胡皂苷d對照品（批號110778-201510），中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，氨水、甲醇為分析純。

6個月和1年生柴胡幼苗，河北省邯鄲市涉縣農(nóng)牧局提供，經(jīng)河北中醫(yī)學(xué)院鄭玉光教授鑒定為北柴胡Bupleurum chinese DC.。

2 方法

2.1 植物材料的處理

選取生長良好整齊的柴胡苗，移栽到花盆中，花盆口徑29 cm、底徑19 cm、高20 cm、質(zhì)量295 g，每個花盆下有一塑料托盤。土壤為沙壤土、營養(yǎng)土和蛭石按1∶1∶1混合均勻。6個月和1年生柴胡幼苗分別于2015年12月和2016年5月移栽于盆中，每盆4穴，每穴2株。移栽后正常澆水，生長1個月后，選取正常生長、一致的幼苗作為供試材料。

采用單因素完全隨機區(qū)組試驗設(shè)計，分別設(shè)置土壤飽和含水量的70%～80%、60%～70%、40%～50%、20%～30%共4個水平，采用稱重法進行水分控制?？厮陂g每日17:00稱取盆重，補充失去的水分，使各處理保持設(shè)定的相對含水量。每處理設(shè)置3個重復(fù)，控水處理1個月后采集樣品測定各指標。

2.2 酶聯(lián)免疫法檢測4種酶活性

2.2.1 原理及方法 采用雙抗體夾心法測定樣品中HMGR、IPPI、FPS和β-AS的酶活性。以FPS為例，用純化的植物FPS抗體包被微孔板，制成固相抗體，向包被單抗的微孔中依次加入植物FPS，再與辣根過氧化物酶（HRP）標記的FPS抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標抗體復(fù)合物，經(jīng)過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色，顏色深淺與樣品中的植物FPS呈正相關(guān)。用酶標儀在450 nm波長處測定吸光度（OD）值，通過標準曲線計算樣品中植物FPS活性。HMGR、IPPI和β-AS活性測定方法與FPS相同。

2.2.2 粗酶的提取 將柴胡種苗從土壤中取出，用水沖洗數(shù)遍去除泥沙，再用吸水紙吸干多余水分，并去除莖葉部分，用電子天平準確稱量每棵柴胡種苗根部的質(zhì)量，按質(zhì)量體積比1∶18加入0.01 mol/L PBS（pH 7.15），冰浴研磨成勻漿，放置冰箱浸提2 h，4℃、10 000 r/min離心20 min，去除沉淀取上清，重復(fù)上述步驟，離心后取上清。

2.2.3 酶活性測定 將試劑盒提供的原倍標準品分別稀釋為60、30、15、7.5、3.75 IU/L。加樣：分別設(shè)空白孔（不加樣品及酶標試劑，其余操作相同）、標準孔、待測樣品孔。在酶標包被板上標準孔準確加樣50μL，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μL，再加待測樣品10μL（樣品最終稀釋度為5倍）。將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30 min。配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，重復(fù)5次，拍干。加酶：每孔加入酶標試劑50μL，空白孔除外。溫育（同上）。洗滌（同上）。顯色：每孔先加入顯色劑A50μL，再加入顯色劑B 50μL，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色10 min。終止：每孔加終止液50μL（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。測定：以空白孔調(diào)零，450 nm波長依序測量各孔OD值。測定應(yīng)在加終止液后15 min內(nèi)進行。

2.2.4 數(shù)據(jù)處理 以標準品濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，繪制標準曲線，計算直線回歸方程，將樣品的OD值代入方程，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。

2.3 HPLC測定柴胡皂苷a、d含量

皂苷含量測定條件參照2015年版《中華人民共和國藥典》，方法參照張宇等[4]步驟進行。

3 結(jié)果

3.1 干旱對柴胡皂苷a、d含量的影響

不同土壤飽和含水量處理的6月齡和1年生柴胡苗柴胡皂苷a、d含量見圖1。在干旱脅迫下，土壤飽和含水量為40%～50%時，6月齡和1年生柴胡苗柴胡皂苷a、d含量最高，土壤飽和含水量為60%～80%時次之，土壤飽和含水量為20%～30%時最低。說明適度干旱脅迫可以使柴胡皂苷a、d的積累量增加。

圖1 干旱脅迫對6月齡和1年生柴胡苗柴胡皂苷a、d含量的影響

3.2 干旱對柴胡皂苷合成途徑關(guān)鍵酶活性的影響

3.2.1 酶活性測定標準曲線 6月齡和1年生柴胡苗的FPS、β-AS、HMGR和IPPI酶活性檢測具有不同的標準曲線，回歸方程見表1。標準曲線的r2均為0.99左右，說明后續(xù)結(jié)果可信。

表1 6月齡和1年生柴胡苗中4種酶活性檢測回歸方程

3.2.2 酶活性測定結(jié)果 6月齡柴胡苗β-AS的酶活性最高，達到20 000 IU/g左右；IPPI的酶活性較低，只有250 IU/g左右。在干旱處理條件下，40%～50%土壤飽和含水量使FPS、β-AS、HMGR和IPPI的酶活性達到最高，而土壤飽和含水量在70%～80%與60%～70%的情況下FPS、β-AS、HMGR和IPPI的酶活性相差不大，而當(dāng)土壤飽和含水量降到20%～30%時，F(xiàn)PS、β-AS、HMGR和IPPI的酶活性明顯降低。結(jié)果見圖2。

1年生柴胡苗在干旱脅迫條件下，土壤飽和含水量40%～50%時，F(xiàn)PS、β-AS、HMGR和IPPI的酶活性較高，而土壤飽和含水量70%～80%與60%～70%的情況下酶活性相差不大，土壤飽和含水量20%～30%時，F(xiàn)PS、β-AS、HMGR和IPPI的酶活性較低。結(jié)果見圖3。

以上結(jié)果說明柴胡皂苷合成途徑關(guān)鍵酶FPS、β-AS、HMGR和IPPI的酶活性在適度干旱條件下較高，水分過多或過少都會對酶活性產(chǎn)生不良的影響。

3.3 柴胡皂苷含量與酶活性的相關(guān)性

采用SPSS19.0軟件分析不同處理下柴胡皂苷含量與HMGR、IPPI、FPS和β-AS酶活性的相關(guān)性，結(jié)果見表2、表3。6月齡苗的HMGR、IPPI、FPS和β-AS酶活性與柴胡皂苷a、d含量呈極顯著的正相關(guān)（P＜0.01）；1年生柴胡苗HMGR、IPPI、FPS和β-AS酶活性與柴胡皂苷a含量呈極顯著的正相關(guān)（P＜0.01），與柴胡皂苷d的表達呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。6月齡和1年生柴胡苗的HMGR、IPPI、FPS和β-AS酶活性之間均呈極顯著的正相關(guān)（P＜0.01），說明作為柴胡皂苷合成途徑的關(guān)鍵酶，每種酶的表達都與其下游酶活性相關(guān)，4種酶統(tǒng)一協(xié)調(diào)柴胡皂苷的合成過程。

圖2 干旱脅迫對6月齡柴胡苗HMGR、IPPI、FPS、β-AS酶活性的影響

圖3 干旱脅迫對1年生柴胡苗HMGR、IPPI、FPS、β-AS酶活性的影響

表2 6月齡苗HMGR、IPPI、FPS和β-AS酶活性與皂苷含量相關(guān)性分析

表3 1年生苗HMGR、IPPI、FPS和β-AS酶活性與皂苷含量相關(guān)性分析

4 討論

張宇等[4]發(fā)現(xiàn)干旱脅迫能使HMGR、IPPI、FPS和β-AS的基因表達量上升，而基因表達的產(chǎn)物就是酶類，但基因表達升高并不一定代表酶活性的升高，酶活性能更直接地反映干旱脅迫與柴胡皂苷之間的關(guān)系。本研究結(jié)果表明，6月齡柴胡苗的酶活性雖然較1年生柴胡苗的酶活性低很多，但在干旱處理下其變化趨勢是一致的。6月齡柴胡苗的HMGR酶活性約為1200 IU/g，而1年生柴胡苗的HMGR酶活性達到5000 IU/g，而且，無論是6月齡苗還是1年生苗其β-AS酶活性均明顯高于另外3種酶，1年生苗的β-AS酶活性達到80 000 IU/g，較其他3種酶活性高出1個數(shù)量級。這說明隨著外界溫度的升高，柴胡皂苷的合成也在加速，另外，β-AS作為最靠近終產(chǎn)物的酶類，其活性在某種程度上代表了柴胡皂苷合成的多少。

6月齡和1年生柴胡苗對于干旱脅迫的響應(yīng)趨勢是一致的，在土壤飽和含水量為40%～50%時，F(xiàn)PS、β-AS、HMGR和IPPI的酶活性最高，土壤飽和含水量60%～70%與土壤飽和含水量70%～80%時的4種酶活性大致相當(dāng)，土壤飽和含水量40%～50%應(yīng)該是酶活性的最適水分。但是，干旱脅迫對于酶活性的增加是有限的，當(dāng)土壤飽和含水量降至20%～30%時，酶活性迅速降低。在干旱脅迫下，柴胡皂苷含量的變化趨勢與酶活性一致，說明柴胡皂苷含量的提高需要一定的干旱期。

另外，β-AS作為最靠近皂苷生成的酶，在干旱脅迫下其活性上調(diào)最明顯，4種酶的活性呈顯著正相關(guān)，說明上游酶類影響著下游酶類的表達，呈現(xiàn)逐級遞增的趨勢，積累到一定程度，就會表現(xiàn)為柴胡皂苷含量的增加。相關(guān)性分析也表明，4種酶的表達與柴胡皂苷的含量呈極顯著的正相關(guān)。由此可知，適度的干旱脅迫能夠促進柴胡皂苷合成途徑關(guān)鍵酶的表達，進而影響柴胡皂苷的積累。

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Effects of Drought Stress on Activity of Key Enzyme in Saikosaponin Biosynthesis Passway and Saponins Content in Bupleurum chinense

HAN Xiao-wei1,FENG Hong2,FENG Jian-ming1, YAN Yu-ping1,ZHANG Dan1,ZHENG Kai-yan1,ZHENG Yu-guang1
(1.Hebei University of Chinese Medicine, Shijiazhuang 050200,China;2.Anguo Digital Materia Medica Testing Center Co.,LTD.,Anguo 071200,China)

Objective To research the effects of drought stress on activity of key enzyme in saikosaponin biosynthesis and saponins content in Bupleurum chinense;To reveal response of Bupleurum chinense to drought stress from protein level.Methods Bupleurum chinense was cultivated in potted water control experiment with 70%–80%,60%–70%, 40%–50%and 20%–30%saturated soil water contents.The enzyme activities of 3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-coenzyme A reductase(HMGR),isoprenyl-based coke(IPPI),farnesyl pyrophosphate synthase(FPS)and β-carotenoid synthase(β-AS) of six months and one year old Bupleurum chinense were measured.The contents of saikosaponins a and d in samples of different soil water contents were determined by HPLC.Results When the saturated moisture was 40%–50%,the enzymatic activities of HMGR,IPPI,FPS and β-AS were the highest,followed by saturated moisture 60%–70%、70%–80%and 20%–30%.The trend of saikosaponin was similar to that of the activity of key enzyme.Conclusion 40%–50%soil saturated water content can significantly increase the activity of the key enzymes in the saikosaponin synthesis pathway.The saponin content and enzyme activity show a significant positive correlation,indicating that under drought stress,Bupleurum chinense regulates the synthesis of saikosaponin by regulating the key enzyme activity of saikosaponin synthesis pathway to respond drought stress.

drought stress;Bupleurum chinense;activity of enzyme;saikosaponin

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.05.017

R284.1

：A

：1005-5304(2017)05-0071-05

2016-10-20）

（

2017-01-04；編輯：陳靜）

河北省高等學(xué)校科學(xué)技術(shù)研究項目（QN2015073）；河北省中醫(yī)藥管理局科研計劃項目（2015081）；河北省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)體系中藥材創(chuàng)新團隊項目（7000120081）；河北中醫(yī)學(xué)院中藥學(xué)重點學(xué)科建設(shè)項目（7002016012019）

鄭玉光，E-mail：zyg314@163.com