胡光源，林 琳，汪地強(qiáng)，王 莉

(貴州茅臺(tái)酒股份有限公司技術(shù)中心，貴州 仁懷 564501)

應(yīng)用多級(jí)液液微萃取結(jié)合氣質(zhì)聯(lián)用定量白酒中的角鯊烯

胡光源，林 琳，汪地強(qiáng)，王 莉*

(貴州茅臺(tái)酒股份有限公司技術(shù)中心，貴州 仁懷 564501)

將多級(jí)液液微萃取與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)相結(jié)合建立了白酒中微量角鯊烯的快速定量方法。將白酒稀釋后，用戊烷-乙醚混合溶劑(1∶3，體積比)進(jìn)行多級(jí)微萃取，有機(jī)相濃縮后氣質(zhì)聯(lián)用分析。結(jié)果顯示，角鯊烯在0.62～159.88 μg/L范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.995 5，角鯊烯的檢出限為0.17 μg/L，當(dāng)加標(biāo)濃度為2,20,40 μg/L時(shí)回收率分別為78.1%,85.0%和103.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為12.1%,8.9%和7.0%。該方法具有簡(jiǎn)便快速、準(zhǔn)確靈敏、萃取效率高、有機(jī)溶劑消耗少等優(yōu)點(diǎn)，適合白酒中痕量角鯊烯的定量分析。

角鯊烯；白酒；多級(jí)液液微萃?。粴庀嗌V-質(zhì)譜聯(lián)用；定量分析

白酒獨(dú)特的固態(tài)多微釀造及固態(tài)蒸餾工藝賦予了其豐富的呈香呈味物質(zhì)和生物活性成分。與世界上其它蒸餾酒相比，中國(guó)白酒的呈香呈味物質(zhì)最為豐富[1]。然而，白酒作為傳統(tǒng)發(fā)酵食品，其生物活性相關(guān)成分的研究較少。目前，已檢測(cè)到白酒中的生物活性成分有四甲基吡嗪[2-3]、萜烯類物質(zhì)[4-5]、酚類物質(zhì)[6]、5-羥甲基糠醛[1]、愈創(chuàng)木酚[7]、脂肽類化合物等[8]。

圖1 角鯊烯的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structrue of squalene

角鯊烯(Squalene)，又稱鯊烯，三十碳六烯，其化學(xué)名為2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四碳六烯，分子式為C30H50，分子量為410，結(jié)構(gòu)如圖1所示。角鯊烯為含有6個(gè)雙鍵的三萜化合物，其結(jié)構(gòu)高度不飽和使之具有抗氧化性。Reddy等[9-10]發(fā)現(xiàn)角鯊烯具有抗癌、抗腫瘤、抗氧化等生物活性，能減緩皮膚老化進(jìn)程，減少身體的勞累感、加強(qiáng)免疫系統(tǒng)能力等功效，是一種典型且實(shí)用的生物活性物質(zhì)。角鯊烯主要存在于植物[11-12]、鯊魚肝油[9]、保健食品和大米中[13-14]，關(guān)于白酒中角鯊烯的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。由于白酒固態(tài)蒸餾的特殊性，其中存在少量的難揮發(fā)性物質(zhì)，而角鯊烯難揮發(fā)，且在白酒中極其微量，分析檢測(cè)難度大。預(yù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采用直接進(jìn)樣、頂空進(jìn)樣、固相微萃取、攪拌棒吸附萃取均不能實(shí)現(xiàn)其在白酒中的定性、定量分析。液液萃取可以較大程度地富集待檢樣品中的痕量物質(zhì)，但其操作步驟繁瑣，使用有機(jī)溶劑量大，待檢樣品需求量大，檢測(cè)成本較高，定量檢測(cè)效率較低，不宜作為定量方法。而分散液液微萃取避免了液液萃取的一些缺點(diǎn)，在食品分析領(lǐng)域應(yīng)用日益廣泛[15-16]，但其需使用一定量的有毒分散劑。

本文依據(jù)液液萃取的原理，通過(guò)降低酒樣中乙醇濃度，優(yōu)化萃取劑的種類、比例和使用體積，優(yōu)化不同萃取級(jí)數(shù)，同時(shí)采用渦旋振蕩提高萃取效率，氮吹濃縮提高目標(biāo)物的濃度，減少了酒樣用量及有機(jī)溶劑用量，建立了白酒中角鯊烯的快速定量方法，旨在更加深入的挖掘傳統(tǒng)白酒中生物活性成分。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

角鯊烯(98%，美國(guó)Sigma公司)；乙醚、戊烷、氯化鈉(分析純，上海國(guó)藥集團(tuán))。

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀7890A-5975C(Agilent公司,USA)；毛細(xì)管色譜柱：DB-FFAP(J&W Scientific,Folsom,CA,USA),DB-5MS(Agilent Technology,Santa Clara,CA,USA)。

酒樣：以不同香型不同品牌的白酒為研究對(duì)象，包括12個(gè)醬香型白酒、12個(gè)濃香型白酒、8個(gè)清香型白酒及9個(gè)其它香型白酒。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 多級(jí)液液微萃取 將10 mL待測(cè)白酒樣品稀釋至一定酒度，取稀釋后的酒樣于樣品瓶中，加適量NaCl過(guò)飽和，再加一定量的萃取劑，迅速旋緊瓶蓋，渦旋振蕩1 min，靜置分層后，吸取有機(jī)相0.5 mL于液相小瓶中；萃取后的樣品再加一定量的萃取劑進(jìn)行下一級(jí)的液液微萃取，以此類推。根據(jù)角鯊烯的性質(zhì)，結(jié)合液液微萃取的原理，分別對(duì)酒樣乙醇濃度、萃取劑種類及比例、萃取劑體積、萃取級(jí)數(shù)以及色譜柱參數(shù)等進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.2 儀器條件 氣相色譜(GC)條件：氣相色譜進(jìn)樣口溫度為280 ℃，毛細(xì)管色譜柱為DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，載氣為He，流速1 mL/min；氣相色譜的升溫條件為：160 ℃不保持，以10 ℃/min升溫至280 ℃，恒溫5 min，共17 min；MS條件：EI電離源，離子源溫度230 ℃，電子能量70 eV，采用為SIM模式定量，定量離子為69。

質(zhì)譜(MS)條件：電子電離源(Electron ionization,EI)，電子轟擊能量70 eV，離子源溫度230 ℃，掃描范圍35.00～500.00 u，質(zhì)譜譜庫(kù)為 NIST 14a.L。

1.2.3 角鯊烯的定性與定量分析 采用 NIST 14a.L Database(Agilent Technologies Inc.)中標(biāo)準(zhǔn)譜圖和實(shí)物標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)，對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行定性分析。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：吸取一定濃度的角鯊烯溶液加入到模擬白酒中，并用等體積的模擬白酒進(jìn)行逐級(jí)稀釋后，配制成一系列濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次對(duì)每一濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液按優(yōu)化后的方法進(jìn)行多級(jí)萃取，獲得有機(jī)相，濃縮后進(jìn)行GC-MS分析，并以角鯊烯不同系列濃度為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的峰面積為橫坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

酒樣測(cè)定：將待測(cè)酒樣按優(yōu)化后的方法進(jìn)行多級(jí)萃取，獲得有機(jī)相，吸取1 μL有機(jī)相進(jìn)GC-MS分析。

1.2.4 回收率的測(cè)定 將不同濃度的角鯊烯加入模擬酒樣中，測(cè)定不同濃度的加標(biāo)回收率。測(cè)定實(shí)物酒樣中角鯊烯的回收率時(shí)，每種香型白酒選擇1個(gè)代表酒樣進(jìn)行實(shí)物加標(biāo)回收率驗(yàn)證，每個(gè)酒樣平行測(cè)定3次，計(jì)算不同香型白酒中角鯊烯的加標(biāo)回收率。

2 結(jié)果與討論

2.1 多級(jí)液液微萃取方法的建立

2.1.1 酒樣中乙醇濃度的影響 白酒中的乙醇含量高，乙醇對(duì)目標(biāo)物的萃取干擾大。直接加有機(jī)溶劑萃取時(shí)，由于乙醇的影響，有機(jī)相與水相不能分層，目標(biāo)物的萃取分離效果差。因此實(shí)驗(yàn)首先降低酒樣中乙醇的濃度，分別將白酒樣品稀釋至5，10，15，20%vol的乙醇濃度，考察了乙醇濃度對(duì)角鯊烯提取的影響。結(jié)果顯示，隨著酒度降低，由于稀釋倍數(shù)增加，角鯊烯峰面積呈減小趨勢(shì)，而乙醇濃度為20%vol時(shí)，由于較高的乙醇濃度對(duì)角鯊烯的萃取存在競(jìng)爭(zhēng)性抑制，角鯊烯的萃取效率較乙醇濃度為15% vol時(shí)的萃取效果差。因此實(shí)驗(yàn)選擇將酒樣稀釋至15%vol對(duì)角鯊烯進(jìn)行萃取。

2.1.2 萃取溶劑的種類及比例 不同極性的萃取溶劑是影響目標(biāo)物提取的關(guān)鍵因素。于玲等[17]采用超聲輔助分散液液微萃取方法分析空氣中溴氰菊酯殘留時(shí)，考察了不同萃取劑種類對(duì)目標(biāo)物提取的影響，結(jié)果表明萃取劑的種類直接影響目標(biāo)物的提取效率，有效的萃取劑能使目標(biāo)物從水相中轉(zhuǎn)入有機(jī)相，并且萃取后分層效果明顯，可提高目標(biāo)物的萃取效率，這主要基于萃取的相似相溶原理。角鯊烯屬于不飽和三萜類化合物，具有非極性，根據(jù)相似相溶原理，選擇非極性的有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取。實(shí)驗(yàn)選擇白酒分析中常用的非極性萃取劑戊烷和乙醚，以及文獻(xiàn)報(bào)道提取植物等產(chǎn)品中角鯊烯的常用萃取劑正己烷，比較了單種溶劑與不同比例(3∶1,1∶1,1∶3)的戊烷-乙醚的混合溶劑對(duì)萃取的影響。結(jié)果顯示，正己烷、戊烷萃取白酒中角鯊烯的效果較差，且正己烷的毒性較強(qiáng)，因此不采用正己烷。而乙醚和戊烷的混合溶劑中，隨著乙醚比例的增加，萃取效率提高，采用戊烷-乙醚(1∶3)時(shí)萃取率趨于最大，但乙醚比例越高分層效果越差。綜合考慮，選擇戊烷-乙醚(1∶3)的有機(jī)溶劑作為萃取劑。

萃取劑體積對(duì)萃取效率也有較大的影響。實(shí)驗(yàn)選擇戊烷-乙醚(1∶3)混合溶劑進(jìn)行體積優(yōu)化，分別考察不同體積(0.5,1,2,3,4 mL)的萃取劑對(duì)萃取效果的影響。結(jié)果顯示，萃取劑體積為0.5 mL時(shí)峰面積最大，但此時(shí)有機(jī)相分層少，不易吸取有機(jī)相，精密度差。隨著萃取劑體積的增加，有機(jī)相分層效果好，提取的角鯊烯增加，但由于稀釋效應(yīng)大于提取效率，角鯊烯的峰面積呈下降趨勢(shì)。綜合考慮萃取效果及可操作性，選擇萃取劑的體積為1 mL。

2.1.3 萃取級(jí)數(shù) 由于角鯊烯微量存在于白酒中，為了準(zhǔn)確定量以及提高檢測(cè)靈敏度，考察了每次萃取角鯊烯的提取率。實(shí)驗(yàn)選擇戊烷-乙醚混合溶劑(1∶3)作為萃取劑，每次加入1 mL萃取劑，共萃取5次。結(jié)果顯示，隨著萃取次數(shù)的增加，越來(lái)越多的角鯊烯被提取，其中第1次萃取率為76.9%，第2次萃取率為17.2%，第3次為3.2%，第4次為2.2%，第5次為0.5%。從萃取率看出，戊烷-乙醚混合萃取劑(1∶3)提取酒樣中絕大部分角鯊烯主要集中在前兩次萃取，其提取率達(dá)94.1%。因此本實(shí)驗(yàn)選擇兩次萃取，這種多級(jí)微萃取的效果優(yōu)于單次萃取，同時(shí)輔以氮吹濃縮，可進(jìn)一步提高白酒中痕量角鯊烯的檢測(cè)靈敏度。

實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步比較了角鯊烯在不同極性色譜柱上的分離效果。結(jié)果表明，角鯊烯在非極性DB-5MS柱和極性柱DB-FFAP上的峰面積相近，但其在非極性色譜柱上分離效果較好，利于準(zhǔn)確定量，因此選擇非極性的DB-5MS柱分析。

綜上，確定了分析酒樣中角鯊烯的最優(yōu)方法為：將10 mL白酒樣品稀釋至15%vol，采用1 mL戊烷-乙醚混合溶劑(體積比為1∶3)進(jìn)行多級(jí)萃取，并選用非極性的DB-5MS柱進(jìn)行分離。

2.2 分析方法的評(píng)價(jià)

根據(jù)優(yōu)化的方法進(jìn)行GC-MS分析，并對(duì)目標(biāo)峰進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)及NIST譜庫(kù)比對(duì)，確認(rèn)目標(biāo)峰為角鯊烯，從而使得白酒樣品中的角鯊烯得到有效檢出。圖2為多級(jí)液液微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法檢測(cè)白酒樣品中角鯊烯的總離子流圖。

將配制好的一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液按照上述條件進(jìn)行多級(jí)液液微萃取結(jié)合GC-MS分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以3倍信噪比時(shí)的濃度計(jì)算角鯊烯的檢出限(LOD)，以10倍信噪比時(shí)的濃度計(jì)算定量下限(LOQ)。結(jié)果表明，角鯊烯的線性回歸方程為y=0.000 6x-0.979，相關(guān)系數(shù)(r2)為0.995 5，線性范圍為0.62 ～159.88 μg/L，方法的線性范圍較寬，角鯊烯的檢出限為0.17 μg/L，定量下限為0.55 μg/L，適合白酒中痕量角鯊烯的定量檢測(cè)。

在優(yōu)化條件下，分別考察了加標(biāo)濃度為2,20,40 μg/L時(shí)的回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。測(cè)得平均加標(biāo)回收率分別為78.1%,85.0%和103.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為12.1%,8.9%和7.0%。方法的準(zhǔn)確度和精密度符合定量分析要求。

2.3 不同香型白酒中角鯊烯含量的測(cè)定

將不同香型的白酒樣品稀釋至15%vol，按上述建立的方法測(cè)定白酒中角鯊烯的含量。每種香型白酒選取1個(gè)酒樣做標(biāo)準(zhǔn)品加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，其中醬香型白酒中角鯊烯的加標(biāo)量為50 μg/L，濃香型白酒加標(biāo)量為5 μg/L，清香型白酒加標(biāo)量為20 μg/L，其它香型白酒加標(biāo)量為10 μg/L。計(jì)算此方法定量各香型白酒中角鯊烯的回收率，每個(gè)酒樣重復(fù)測(cè)定3次計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。表1結(jié)果顯示，不同香型白酒中角鯊烯的回收率為89.1%～117.6%，RSD均不大于13.8%，能夠滿足白酒中ng/L或μg/L級(jí)別的微量生物活性三萜角鯊烯的定量分析。

表1 不同香型白酒中角鯊烯的平均含量、回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 1 Average concentrations,recoveries and RSDs of squalene in different aroma-type Chinese liquors

圖3 不同香型白酒中角鯊烯含量差異圖Fig.3 Concentration of squalene in different aroma-type Chinese liquors

對(duì)不同香型白酒中的角鯊烯含量進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，角鯊烯在不同香型白酒中含量分布存在差異，具有一定的香型特征。從各香型白酒角鯊烯的箱線圖得出(圖3)，醬香型白酒中的角鯊烯含量最高，平均值達(dá)49.07 μg/L；其次是清香型白酒，其平均含量和中位數(shù)在20 μg/L左右；再次是其它香型白酒，其平均含量和中位數(shù)在10 μg/L左右；濃香型白酒中的角鯊烯含量最少，其平均含量和中位數(shù)在5 μg/L左右。

根據(jù)圖3對(duì)角鯊烯在同一香型不同品牌白酒中的含量特點(diǎn)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，醬香型白酒中角鯊烯的含量范圍分布最廣，為4.10～112.65 μg/L；其余香型白酒的角鯊烯含量范圍稍窄，清香型白酒中角鯊烯含量范圍為5.13～34.61 μg/L，濃香型白酒中角鯊烯含量范圍為0.71～21.78 μg/L，其它香型白酒中角鯊烯含量范圍為1.59～17.72 μg/L。表明角鯊烯在同一香型不同品牌白酒之間存在較大差異。

3 結(jié) 論

本文采用多級(jí)液液微萃取結(jié)合GC-MS聯(lián)用技術(shù)分析白酒中的微量角鯊烯，并對(duì)多級(jí)液液微萃取的相關(guān)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，得到了最優(yōu)分析條件。將方法用于角鯊烯的檢測(cè)，得其線性系數(shù)為0.995 5，檢出限低至0.17 μg/L，當(dāng)加標(biāo)濃度為2,20,40 μg/L時(shí)加標(biāo)回收率分別為78.1%,85.0%和103.5%，RSD分別為12.1%,8.9%和7.0%，分析參數(shù)能滿足白酒中微量生物活性三萜角鯊烯的定量分析。

采用建立的定量方法分析不同香型不同品牌白酒中的角鯊烯含量，結(jié)果表明角鯊烯在不同香型白酒中的含量分布存在較大差異，且在同一香型不同品牌白酒中的含量差異也較大，其中醬香型白酒中的角鯊烯含量最高，其次是清香型白酒，而濃香型白酒中的角鯊烯相對(duì)較少。相關(guān)研究可為白酒中角鯊烯等物質(zhì)的分析檢測(cè)提供方法參考，也為挖掘傳統(tǒng)白酒中生物活性物質(zhì)提供思路借鑒，同時(shí)也進(jìn)一步確證了傳統(tǒng)白酒中存在微量的難揮發(fā)性的大分子物質(zhì)。

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Quantitation of Squalene in Chinese Liquor Using Multistage Liquid-Liquid Microextraction Coupled with Gas Chromatography-Mass Spectrometry

HU Guang-yuan,LIN Lin,WANG Di-qiang,WANG Li*

(Technique Center of Kweichow Moutai Co.Ltd.,Renhuai 564501，China)

A multistage liquid-liquid microextraction(LLME) coupled with GC-MS method was developed to determine squalene in Chinese liquor.After diluting the liquor sample,a multistage microextraction was carried out using pentane-diethyl ether mixture(1∶3,by volume),then the organic phase was concentrated with nitrogen,and analyzed by GC-MS.The result indicated that squalene had a good linearity in the range of 0.62-159.88 μg/L,with a correlation coefficient of 0.995 5.The detection limit of squalene was as low as 0.17 μg/L.The average recoveries of squalene at spiked levels of 2,20,40 μg/L were 78.1%,85.0%,103.5%,respectively,with relative deviations of 12.1%,8.9%,7.0%,respectively.With the advantages of simplicity,accuracy,high extraction efficiency and low consumption of organic solvent,this method was suitable for the quantitative analysis of squalene in Chinese liquor.

squalene;Chinese liquor;multistage LLME;GC-MS;quantitation analysis

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.04.016

2016-08-21；

2016-11-27

O657.63；O624.13

A

1004-4957(2017)04-0534-05

*通訊作者：王 莉，碩士，工程技術(shù)應(yīng)用研究員，研究方向：白酒風(fēng)味與品質(zhì)，Tel：0851-2386504，E-mail:eileenjn@126.com