張偉東 金 曦

(1 長春中醫(yī)藥大學，長春，130117； 2 長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，長春，130117)

實驗研究

平肝止痛顆粒對肝陽上亢型偏頭痛大鼠模型血漿中CGRP和5-HT影響

張偉東1金 曦2

(1 長春中醫(yī)藥大學，長春，130117； 2 長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，長春，130117)

目的：探討平肝止痛顆粒治療偏頭痛的作用機制，研究平肝止痛顆粒對肝陽上亢型偏頭痛大鼠模型血漿中降鈣素基因相關肽(Calcitonin Gene-related Peptide，CGRP)和五-羥色胺(Five-serotonin,5-HT)含量的影響。方法：采用皮下注射硝酸甘油(Nitroglycerin,NTG)注射劑復制實驗性偏頭痛大鼠模型，灌胃平肝止痛顆粒治療后，采用酶聯(lián)免疫法測定血漿CGRP和5-HT含量。結果：皮下注射硝酸甘油(NTG)注射劑偏頭痛大鼠模型血漿中CGRP含量與空白組比較有明顯升高，而5-HT含量與空白組比較有不同程度的升高。平肝止痛顆粒24 g生藥/kg，12 g生藥/kg，6 g生藥/kg劑量均可明顯降低偏頭痛模型大鼠血漿中CGRP、5-HT含量水平。討論：平肝止痛顆?？赡芡ㄟ^對血管活性物質CGRP與5-HT水平的調節(jié)，來改善血管的異常舒縮狀況，抑制神經(jīng)性炎性反應，從而達到緩解疼痛作用和對偏頭痛的治療作用。

偏頭痛；降鈣素基因相關肽(CGRP)；五-羥色胺(5-HT)；肝陽上亢型

偏頭痛是目前世界范圍內十大嚴重的慢性功能障礙性疾病之一。近年來,現(xiàn)代醫(yī)學對本病的研究雖取得了一定的進展，但大部分患者的疼痛都未能得到充分的控制，且各類西藥雖可起到一定的防治作用，但不良反應較大，遠期效果不盡如人意[1]。本實驗采用皮下注射硝酸甘油(NTG)注射劑復制實驗性大鼠偏頭痛動物模型，平肝止痛顆粒灌胃給藥，以探討平肝止痛顆粒對治療偏頭痛的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 Wistar大鼠，180～220 g，動物等級：清潔級，延邊大學實驗動物中心，生產(chǎn)單位動物許可證編號為：SCXK-(吉)2011-0007。昆明種小鼠，體重18～22 g，SPF級，購自長春生物制品研究所有限責任公司，生產(chǎn)單位動物質量許可證號：SCXK-(吉)2011-0003。

1.1.2 藥物 平肝止痛顆粒：棕色顆粒或粉末，含量：4.5 g生藥/g粉。由長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院腦病科實驗研究組提供；頭痛寧膠囊，規(guī)格：每粒裝0.4 g；陜西步長制藥有限公司，批號：150631；鹽酸氟桂利嗪膠囊，規(guī)格：每粒5 mg；天津創(chuàng)新藥業(yè)有限公司，批號：20150306。

1.1.3 試劑與儀器 造型藥物：附子(黑順片)，安徽盛海堂中藥飲片有限公司，發(fā)證日期：20150506；硝酸甘油注射液，河南潤弘制品股份有限公司產(chǎn)品，規(guī)格：1 mL/支，5 mg/mL。產(chǎn)品批號：1507012；甲醛：天津市福晨化學試劑廠，批號：20150625；冰醋酸北京化工廠，批號：20150311；戊巴比妥鈉，北京化學試劑公司，批號：020919。試劑盒：大鼠腦啡肽(ENK)ELISA檢測試劑盒、5-羥色胺(5-HT)ELISA檢測試劑盒、降鈣素基因相關肽(CGRP)ELISA檢測試劑盒、內皮素(ET)ELISA檢測試劑盒、一氧化氮(NO)ELISA檢測試劑盒、一氧化氮合成酶(NOS)ELISA檢測試劑盒為美國RD生物科學公司產(chǎn)品，上海源葉生物科技有限公司分裝，批號均為：20151001A。儀器：DNM酶標儀，北京普朗新技術有限公司。JA2003B千分之一天平，上海越平科學儀器有限公司產(chǎn)品。JJ200精密電子天平，Y-2000型電子天平，均為常熟雙杰測試儀器廠制造。低速冷凍離心機為安徽中科中佳科學儀器有限公司產(chǎn)品。DW-86L386海爾立式超低溫保存箱，青島海爾特殊電器有限公司。LYS-1A型多功能小鼠自主活動儀和YLS-6B智能熱板儀，均為濟南益延科技發(fā)展有限公司出品。

1.2 方法

1.2.1 平肝止痛顆粒對熱板所致小鼠疼痛反應的影響 取雌性小鼠，放于熱板上篩選。以自小鼠放在熱板上至出現(xiàn)舔后足所用的時間(秒)，作為該鼠痛閾基礎值，取痛閾值在10～25 s的敏感、不跳躍小鼠60只，按痛閾值分6組，分別為正常對照組，頭痛寧組、平肝止痛顆粒高、中、低、低低劑量組。正常對照組灌胃10 mL/kg蒸餾水；頭痛寧組灌胃1.0 g/kg頭痛寧膠囊內容物；平肝止痛顆粒高、中、低、低低劑量組分別灌胃平肝止痛顆粒7.56、3.78、1.89、0.94 g/kg(34、17、8.5、4.25 g生藥/kg)。1次/d，連續(xù)7 d，末次給藥后1、2、3、4 h，測小鼠痛閾值。見表1。

1.2.2 平肝止痛顆粒對冰醋酸所致小鼠扭體反應次數(shù)的影響 取小鼠60只，隨機分6組，分別為正常對照組、陽性藥頭痛寧膠囊組、平肝止痛顆粒高、中、低、低低劑量組。正常對照組灌胃10 mL/kg蒸餾水；頭痛寧組灌胃1.0 g/kg頭痛寧膠囊內容物；平肝止痛顆粒高、中、低、低低劑量組分別灌胃平肝止痛顆粒7.56、3.78、1.89、0.94 g/kg(34、17、8.5、4.25 g生藥/kg)。1次/d，連續(xù)7 d，末次給藥后1 h，腹腔注射0.6%冰醋酸10 mL/kg，觀察并記錄15 min內小鼠的扭體反應次數(shù)。見表2。

1.2.3 平肝止痛顆粒對甲醛致小鼠疼痛反應的影響 取體重16～18 g雄性小鼠55只，隨機分5組，對照組，灌胃10 mL/kg蒸餾水，頭痛寧膠囊組，灌胃1.0 g/kg頭痛寧膠囊內容物，平肝止痛顆粒高、中、低劑量組，灌胃平肝止痛顆粒3.78、1.89、0.94 g/kg(37、8.5、4.25 g生藥/kg)。給藥2次/d，連續(xù)給藥3 d，末次給藥后1 h，每只小鼠左側足趾處進針，腳踝外皮側皮下注射5%甲醛溶液50 μL,立即觀察0～10 min和10～60 min 2個時間段內舔足次數(shù)。見表3。

1.2.4 平肝止痛顆粒對戊巴比妥鈉誘導小鼠睡眠時間的鎮(zhèn)靜影響 小鼠隨機分6組。正常對照組灌胃給予10 mg/kg蒸餾水；陽性中藥藥組灌胃給予1.0 g/kg頭痛寧膠囊；陽性西藥組灌胃6 mg/kg鹽酸氟桂利嗪膠囊內容物；平肝止痛顆粒高、中、低劑量組，分別灌胃更年安舒顆粒3.78、1.89、0.94 g/kg(相當于17、8.5、4.25 g生藥/kg)。1次/d，連續(xù)7 d。末次給藥后1 h，各組分別腹腔注射戊巴比妥鈉55.0 mg/kg，記錄給予戊巴比妥鈉時間、翻正反射消失的時間和翻正反射恢復的時間。以給予戊巴比妥鈉至翻正反射消失的時間為入睡潛伏期，從翻正反射消失至恢復時間為睡眠持續(xù)時間。實驗在室溫(24±1)℃，安靜環(huán)境下進行。見表4。

1.2.5 平肝止痛顆粒對皮下注射NTG偏頭痛大鼠模型外周血CGRP與5-HT含量的影響 按照隨機性原則分為7組，每組10只：正常對照組、模型組大鼠、鹽酸氟桂利嗪膠囊組、頭痛寧組、平肝止痛顆粒高劑量組、平肝止痛顆粒中劑量組、平肝止痛顆粒低劑量組。按照臨床成人日用劑量為35 g/60 kg體重。連續(xù)給藥7 d，正常對照組和模型組灌胃等體積的蒸餾水。末次給藥1 h后按10 mg/kg皮下注射NTG注射液復制偏頭痛動物模型，空白組注射等量生理鹽水。造模后3～5 min，大鼠出現(xiàn)雙耳發(fā)紅、前肢頻繁撓頭、后爪拍臉、爬籠等現(xiàn)象，并持續(xù)約3 h，之后活動減少出現(xiàn)蜷臥現(xiàn)象，表明模型復制成功。見表5。每組選取8只模型成功大鼠，造模后4 h，10%的水合氯醛麻醉，分別取大鼠腹主動脈血3 mL和2 mL注入含10%EDTA-Na2 30 μL和抑肽酶10 μL(含100 U/mL)的離心試管中，輕微搖動使其混勻，于4 ℃、3 000 r/min離心10 min分離血漿。于-80 ℃超低溫冰箱中儲存?zhèn)溆谩y定前，使樣本置于冰水中復融，混勻后，再次4 ℃、3 000 r/min，離心5 min，取上清液按試劑盒說明書分別測定血漿內CGRP、5-HT的含量。見表6。

2 結果

2.1 平肝止痛顆粒對KM小鼠鎮(zhèn)痛作用的影響 實驗結果表明，平肝止痛顆粒提取物能有效減少醋酸誘發(fā)的小鼠扭體次數(shù)，并與劑量有一定的相關性，以高、中劑量鎮(zhèn)痛效果更為顯著。見表1、表2。

表1 平肝止痛顆粒對熱板所致小鼠疼痛反應的影響±s)

平肝止痛顆粒4個劑量組和陽性藥頭痛寧膠囊組對熱板所致的小鼠疼痛閾值均無明顯影響。

表2 平肝止痛顆粒對冰醋酸所致的小鼠扭體反應次數(shù)的影響±s)

平肝止痛顆粒高、中劑量組和頭痛寧膠囊組均能顯著減少冰醋酸引起的小鼠扭體反應次數(shù)。與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3平肝止痛顆粒對甲醛致小鼠疼痛反應的影響±s)

頭痛寧膠囊和平肝止痛顆粒高、中、低劑量組對第一個時相內，小鼠舔足次數(shù)無明顯影響；頭痛寧膠囊和平肝止痛顆粒中、低劑量組能顯著或明顯減少第二個時相內舔足次數(shù)，與對照組比較明顯有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。

2.2 平肝止痛顆粒對KM小鼠鎮(zhèn)靜作用的影響實驗結果表明，硝酸甘油造模后小鼠靜止時間縮短，與空白組比較有統(tǒng)計學意義，平肝止痛顆粒能有效增加動物不動的時間，并以高劑量鎮(zhèn)靜效果更顯著。見表4。

表4 平肝止痛顆粒對小鼠睡眠時間的影響±s)

平肝止痛顆粒高、中個劑量組和頭痛寧膠囊組有延長小鼠睡眠時間趨勢，與對照組比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。鹽酸氟桂利嗪膠囊，能夠縮短小鼠睡眠時間，與對照組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.3 平肝止痛顆粒對皮下注射NTG偏頭痛模型大鼠血漿中CGRP、5-HT含量的影響 皮下注射硝酸甘油注射液后，模型組CGRP含量明顯高于正常對照組，二組之間比較(P<0.05或P<0.01)；平肝止痛顆粒高、中、低劑量組均能明顯減少CGRP含量，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001，P<0.01，P<0.05)。頭痛寧和平肝止痛顆粒高、中、低劑量組可以減少5-HT含量，與模型組比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。見表5、表6。

與正常對照組比較，模型組大鼠撓頭次數(shù)顯著增加，表示模型成立。平肝止痛顆粒高劑量組顯著減少大鼠撓頭次數(shù)，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

表5 平肝止痛顆粒對附子和硝酸甘油所致肝陽上亢大鼠撓頭潛伏期和不同時間段撓頭次數(shù)±s)

注：*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

表6 平肝止痛顆粒對附子和硝酸甘油所致肝陽上亢大鼠血漿中CGRP、5-HT含量的影響

注：*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

平肝止痛顆粒高、中、低劑量組均能明顯減少CGRP含量，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001，P<0.01，P<0.05)。頭痛寧和平肝止痛顆粒高、中、低劑量組可以減少5-HT含量，尤其是平肝止痛顆粒中劑量組和頭痛寧膠囊組，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。

3 討論

偏頭痛的發(fā)作涉及復雜的神經(jīng)血管病變，在偏頭痛的發(fā)作過程中，始終存在著顱內外血管的舒縮障礙，鄭琴、何秋[2-3]等人認為：偏頭痛的發(fā)作與患者血漿中血管活性物質CGRP、5-HT含量異常，顱內血管舒縮功能失衡，從而引起偏頭痛的發(fā)作。CGRP具有強烈的擴張血管作用，是目前所知的最強的血管擴張物質，主要分布在中樞和外周神經(jīng)及動脈、靜脈的血管上。張洪濤[4]等人認為：CGRP是由37個氨基酸組成的由降鈣素基因表達的生物活性多肽，具有強烈的舒張血管的作用，廣泛分布于神經(jīng)和心血管系統(tǒng)，同時對抗交感神經(jīng)興奮，對側支循環(huán)開放具有促進作用。在一種新的神經(jīng)源性炎性反應模型中已證實CGRP:能調節(jié)腦血流并介導硬腦膜的神經(jīng)源性炎性反應，從而在偏頭痛的病理生理中起關鍵作用[5]。朱博馳[6]認為偏頭痛的發(fā)作與腦膜釋放神經(jīng)肽導致神經(jīng)源性炎性反應密切相關，這些神經(jīng)肽包括CGRP和P物質等。這些物質的釋放引起血管舒張，導致血漿蛋白外滲和肥大細胞脫顆粒。趙斌等人[7]與國內外大多數(shù)研究結果一致，都認為偏頭痛患者血漿5-HT水平明顯升高,原因可能是偏頭痛發(fā)作期間,血小板活化增加,釋放過多的5-HT入血，導致血漿5-HT水平升高。血內5-HT的暫時升高可以引起血管壁無菌性炎性反應和通透性增加,在5-HT含量低水平時,其縮血管作用降低,5-HTD受體興奮血管擴張，導致頭痛發(fā)作。同時李朝霞，歐陽俊搖等人也認為CGRP是一種血管活性多肽，是迄今為止在人和哺乳動物內發(fā)現(xiàn)的一種最強的擴血管物質，其釋放受內毒素、前列腺素、緩激肽等炎性因子和遞質的調節(jié)，具有擴張血管、降低動脈血壓的作用。鄭淑美認為從神經(jīng)學說考慮，偏頭痛相伴隨的腦血流量變化，并不是血管本身由血中物質變化而產(chǎn)生的舒縮，而是通過神經(jīng)系統(tǒng)為中介產(chǎn)生的，兒茶酚胺、組胺、血管活性肽，前列環(huán)素和內源性阿片物質與偏頭痛的發(fā)生皆有關系，其中5-HT具有重要作用。楊菲認為偏頭痛的發(fā)生是抗原攝入促發(fā)了免疫反應，1980年Wilson認為偏頭痛發(fā)作時常伴過敏癥狀，對患者過敏原測試發(fā)現(xiàn)牛奶及其乳制品，水果等易過敏。其引證資料發(fā)現(xiàn)一些生物活性遞質(如5-HT、組胺等)均可在I型免疫反應中釋放，因此偏頭痛的發(fā)生是抗原攝入促發(fā)了免疫反應，隨之生物活性遞質持續(xù)釋放，當抗原影響到腦部即發(fā)生偏頭痛及其伴隨癥狀。崔晨，耿琦認為通過干預5-HT、CGRP、調控神經(jīng)動作電位等，可緩解偏頭痛發(fā)作。因此，調節(jié)血漿CGRP、5-HT水平是治療偏頭痛的一個關鍵點。

平肝止痛顆粒是吉林省名醫(yī)、腦病科專家金潤泉教授臨床應用30余年，治療肝陽上亢型偏頭痛的經(jīng)驗方。由水牛角、夏枯草、藳本、蔓荊子、梔子、川芎、當歸、黃芩、生地黃、延胡索組成。具有平肝潛陽，通絡止痛的作用。主要用于治療肝陽上亢型偏頭痛。

平肝止痛顆粒對皮下注射NTG偏頭痛大鼠模型血漿中CGRP、5-HT含量的影響本實驗研究表明，大鼠注射硝酸甘油注射液后，血漿中CGRP、5-HT含量明顯升高，平肝止痛顆粒高、中、低劑量組大鼠血中CGRP、5-HT含量均明顯降低，表明平肝止痛顆?？梢越档拖跛岣视椭缕^痛大鼠模型血漿中的CGRP、5-HT的激活水平，CGRP具有擴張腦血管的作用，同時CGRP能夠產(chǎn)生血管的炎性病變，含量越高，作用越強，而5-HT只有在含量較高的情況下具有收縮腦血管的作用，同時5-HT能夠抑制CGRP的釋放，然而5-HTD受體興奮血管擴張，導致頭痛發(fā)作，顯然降低5-HT的含量可以緩解偏頭痛的發(fā)生。因此平肝止痛顆粒通過對CGRP和5-HT含量的影響從而抑制腦血管異常擴張，抑制血漿的外滲、血小板活化等所導致的神經(jīng)源性炎性反應，而達到緩解偏頭痛的作用。平肝止痛顆粒具有良好的鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜作用，其中以大劑量鎮(zhèn)痛效果較好，中劑量鎮(zhèn)靜效果較好，表明平肝止痛顆粒也可以通過鎮(zhèn)痛與鎮(zhèn)靜達到緩解與治療偏頭痛的效果。

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(2016-06-07收稿 責任編輯：徐穎)

Effect of Pingganzhitong Granules on CGRP and 5-HT in Plasma of Rats with Hyperactivity of liver-yang and Migraine

Zhang Weidong1, Jin Xi2

(1ChangchunUniversityofChineseMedicine,Changchun130117,China; 2TheAffiliatedHospitalofChangchunUniversityofChineseMedicine,Changchun130117,China)

Objective:To discuss the mechanism of Pingganzhitong granules in the treatment of migraine and study its effect on the content of calcitonin gene-related peptide (CGRP) and 5-hydroxytryptamine (5-HT) in the plasma of rats with hyperactivity of liver-yang and migraine. Methods:The subcutaneous injection of nitroglycerin was performed to duplicate the rate model of experimental migraine. After the irrigation of Pingganzhitong granules, the enzyme-linked immunosorbent assay was employed to detect the content of CGRP and 5-HT in the plasma. Results:After the subcutaneous injection of nitroglycerin (NTG) in rat model of migraine, the content of CGRP in the plasma was significantly increased compared with the control group, while the content of 5-HT was increased to a certain higher extent compared with the control group. The dosage of Pingganzhitong granules with 24 g crude drugs /kg, 12 g crude drugs /kg and 6 g crude drugs /kg could significantly reduce the content of CGRP and 5-HT in the plasma of rat model of migraine. Conclusion:By regulating the content of vasoactive substances of CGRP and 5-HT, the Pingganzhitong granules can improve the abnormal vasodilation, inhibit the neurogenic inflammation and thus relieve the pain and achieve the treatment of migraine.

Migraine; Calcitonin Gene-related Peptide (CGRP); 5-hydroxytryptamine (5-HT); Hyperactivity of liver-yang

吉林省科技廳課題(編號：20150204046YY)

張偉東(1989.03—)，男，醫(yī)學碩士，長春中醫(yī)藥大學2014級碩士研究生，研究方向：中醫(yī)腦病，E-mail:zhangweidong345789@foxmail.com

金曦(1968.04—)，女，醫(yī)學博士，主任醫(yī)師，碩士研究生導師，長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院腦病科，研究方向：中醫(yī)腦病，E-mail:1521957360@qq.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.03.035