王亭曄 李曉娟 周雪明 潘秋霞 陳家旭

(北京中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院，北京，100029)

慢性束縛應激抑郁癥大鼠海馬Belin-1、LC3的表達變化及逍遙散的調節(jié)作用

王亭曄 李曉娟 周雪明 潘秋霞 陳家旭

(北京中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院，北京，100029)

目的：觀察慢性束縛應激抑郁癥大鼠模型中海馬自噬標志蛋白Belin-1及LC3的表達變化情況，探討逍遙散對其的調節(jié)作用。方法：20只Wistar大鼠隨機分為4組(n=5):正常組、模型組、逍遙散組、氟西汀組。采用21 d慢性束縛應激方法建立抑郁癥大鼠模型，利用免疫組織化學方法檢測大鼠海馬CA3區(qū)Belin-1、LC3表達情況。結果：Belin-1、LC3在各組中較正常組均有較明顯的表達(P<0.05)。與模型組相比，逍遙散能明顯下調Belin-1、LC3的表達(P<0.05)。結論：慢性束縛應激抑郁癥大鼠海馬自噬相關蛋白Belin-1、LC3表達有變化，提示自噬可能是抑郁癥發(fā)病機制之一，且逍遙散治療抑郁癥的機制可能與調節(jié)自噬標志蛋白Belin-1、LC3有關。

逍遙散；抑郁癥；自噬；Beclin-1;LCA

隨著社會壓力的增加，抑郁癥的患病率也逐年增加，抑郁癥現已成為臨床常見的精神疾病之一。抑郁癥屬于中醫(yī)郁證、百合病等的范疇，臨床表現以情緒低落為主要特征，嚴重時甚至伴隨幻覺妄想和自殺傾向。世界衛(wèi)生組織于2001年將重度抑郁癥(Major Depressive Disorder，MDD)列為導致生活殘疾的第一大原因。臨床及基礎研究對于抑郁癥的相關機制、治療方法也逐漸深入。近年研究表明抑郁癥患者大腦中海馬、杏仁核等部位出現明顯的萎縮、體積縮小現象。已有研究提出自噬與抑郁癥之間具有聯(lián)系，海馬部位的萎縮及海馬神經元的凋亡可能與自噬有關[1-4]。自噬(autophagy)是一種自我消滅的機制(self-eating mechanism)，對于聚集的蛋白質以及功能失調細胞器是關鍵的清潔機制[5]。在維持細胞內環(huán)境穩(wěn)態(tài)中起著十分關鍵的作用。自噬對于大多數組織細胞均有重要作用，其在中樞神經系統(tǒng)中也發(fā)揮著重要作用。LC3與Beclin-1是2種具有代表性的自噬標志蛋白，LC3參與自噬體膜的形成[6]，Beclin 1則是細胞自噬的一個關鍵調控因子，是自噬體形成不可或缺的條件[7]。逍遙散作為中醫(yī)傳統(tǒng)方劑，在治療抑郁癥方面也具有較好的療效，對其治療抑郁癥的相關機制研究也多見報道[8-9]，現已成為治療抑郁癥的常用方劑。

我們課題組在前期研究中通過慢性束縛應激，成功建立了抑郁癥大鼠模型的造模方法，且具有較好的穩(wěn)定性[10]。本實驗通過慢性束縛應激方法建立抑郁癥大鼠模型，觀察抑郁癥大鼠海馬自噬標志蛋白Belin-1、LC3的表達變化以及中藥復方逍遙散對其的調節(jié)作用，探討慢性束縛應激抑郁癥大鼠海馬相關自噬蛋白表達變化，為揭示抑郁癥的發(fā)病機制及逍遙散的治療機制提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級雄性Wistar大鼠20只，4周齡，體質量(170±20)g。購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物合格證號：SCXK(京)2012-0001，實驗在北京中醫(yī)藥大學屏障環(huán)境動物實驗室進行[SYXK(京)2011-0024]。

1.1.2 試劑與儀器 試劑：PBS溶液(Solarbio)，4%多聚甲醛溶液(0.1 μmol/L的PBS溶液配制，pH為7.4)，Anti-Beclin 1 antibody ab62557，Anti-LC3A/B anti body ab58610(abcam)；抗體稀釋液(北京中杉金橋生物技術有限公司)；羊抗兔二抗工作液(北京中杉金橋生物技術有限公司);二甲苯(北京化工廠)，無水乙醇(北京化工廠)。

儀器：大鼠束縛架：自制T型束縛臺：底座寬10 cm、長20 cm、厚2.8 cm，上端束縛臺長22 cm，最寬處6.6 cm，前端有固定頭部的小架和適合四肢放置的凹槽，上端束縛臺有兩條可調節(jié)的粘貼軟帶。顯微鏡Nikon E200(Nikon，Japan)，正置智能型顯微鏡及采集系統(tǒng)(奧林巴斯(中國)有限公司)

1.2 方法

1.2.1 動物與分組 大鼠均在SPF級動物實驗室飼養(yǎng)。適應性飼養(yǎng)1周后，按照體重隨機分為4組：正常組、模型組、逍遙散組、氟西汀組，每組5只。

1.2.2 藥物制備 實驗所用逍遙散源于《太平惠民和劑局方》，按照原方比例購買柴胡、當歸、白芍、白術、茯苓、炙甘草、薄荷、生姜共4 200 g原藥材。上述藥材均購于北京同仁堂有限公司。嚴格按照制備工藝制成逍遙散干浸膏備用，使用時用生理鹽水按照所需濃度進行配制。鹽酸氟西汀膠囊(生產廠：Patheon France；分包裝廠：禮來蘇州制藥有限公司；批號：0955A)，規(guī)格20 mg/粒(成人用藥量為20 mg/d)，給藥時按大鼠用藥量進行換算。

1.2.3 模型制備 抑郁癥大鼠模型的建立采用本課題所建立的穩(wěn)定的21 d慢性束縛應激方法，即將模型組、逍遙散組及氟西汀組大鼠每日在隨機時間點進行束縛，每次3 h,連續(xù)束縛21 d，正常組不進行束縛，僅在相同的時間段內禁食禁水。

1.2.4 藥物干預 在慢性束縛應激造模開始后，逍遙散組大鼠每日灌服逍遙散，氟西汀組每日灌服鹽酸氟西汀，按人體用藥大鼠等效劑量換算后作為大鼠用藥量[9]。大鼠用逍遙散的量=6.17(系數)×生藥/60 kg(一般成人體質量)×藥物提取率(實際干粉量/實際生藥量)，計算得出本實驗中逍遙散組大鼠的給藥量為3.854 g/(kg·d)，1次/d，給藥體積為1 mL/100 g體質量。氟西汀組大鼠給藥量為。模型組與正常組大鼠灌服等量生理鹽水作為對照。

1.2.5 免疫組化檢測 各組大鼠在21 d束縛結束之后，隨機選取5只用4%多聚甲醛灌注固定后制備大腦石蠟切片。切片脫蠟、水化后，滴加3%H2O2去離子水室溫靜置10 min阻斷內源性過氧化物酶，用PBS溶液沖洗2 min×3次，進行抗原修復后PBS溶液浸泡3 min×3次，室溫下用羊血清孵育30 min。滴加一抗50 μL 4 ℃過夜，室溫復溫1 h后用PBS溶液沖洗3 min×3次；滴加二抗50 μL，室溫孵育10 min，PBS溶液沖洗3 min×3次。在顯微鏡下滴加DAB工作液顯色，鏡檢控制直至顯色滿意后流水沖洗終止顯色反應。將切片置于蘇木素中復染，常規(guī)脫水透明后封片。每只動物選取3張切片，每張切片隨機選取3個視野進行觀察。計數每個視野有棕黃色顆粒的陽性細胞，取其均值進行統(tǒng)計分析。

2 結果

2.1 大鼠海馬CA3區(qū)Beclin-1表達情況 實驗結果表明，除正常組外其他3組均可見Beclin1在大鼠海馬CA3區(qū)有明顯陽性表達，正常組有少量表達。與正常組相比，其他3組大鼠海馬CA3區(qū)Beclin 1表達增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組相比，逍遙散組與氟西汀組表達量有減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。具體見表1、圖1。

表1 大鼠海馬CA3區(qū)Beclin1陽性表達情況

注：與正常組相比，*P<0.05，與模型組相比，△P<0.05。

2.2 大鼠海馬CA3區(qū)LC3表達情況 實驗結果表明，除正常組外其他3組均可見LC3在大鼠海馬CA3區(qū)有陽性細胞表達，正常組有少量表達。與正常組相比，其他3組大鼠海馬CA3區(qū)LC3表達增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與模型組相比，逍遙散組與氟西汀組表達量有減少，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2、圖2。

圖1 大鼠海馬CA3區(qū)Beclin1免疫組化結果(×400)表2 大鼠海馬CA3區(qū)LC3陽性細胞數的比較

組別LC3A/B陽性細胞數(x±s)正常組10.25±1.26逍遙散組19.45±1.71*△模型組28.67±1.67*氟西汀組19.06±1.61*△

注：與正常組相比，*P<0.05，與模型組相比，△P<0.05。

圖2 大鼠海馬CA3區(qū)LC3A/B免疫組化結果(×400)

3 討論

正常細胞的生長發(fā)育需要一個對蛋白質合成和降解之間的平衡進行調節(jié)的過程，真核細胞具有2種主要的降解途徑：泛素蛋白酶體途徑和自噬(Autophagy)途徑。自噬可分為大自噬(Macroautophagy)、小自噬(Microautophagy)、分子伴侶介導的自噬(Chaperon-mediated Autophagy，CMA)等類型[11]。不同類型的自噬其發(fā)生過程不同,參與的蛋白分子也不同，Belin-1、LC3是自噬過程中2種常見的自噬體標志物[6]。Beclin 1是酵母自噬相關基因Atg6/Vps30的哺乳動物同源基因，是首個被鑒定的介導哺乳動物自噬的基因，其最主要的作用在于調控自噬體膜的合成[12]。LC3參與了自噬體膜的形成，包括2種可相互轉化的形式即LC3-I和LC3-II。細胞內新合成的LC3經過加工，成為胞質可溶形式的LC3-I，后者經泛素化加工修飾，與自噬體膜表面的PE結合，成為膜結合形式的LC3-II。LC3-II定位于前自噬體和自噬體，是自噬體的標志分子，隨自噬體膜的增多而增加[13]。MAP1LC3A、MAP1LC3B、MAP1LC3C是大鼠Map1LC3的3種亞型，這3種亞型在不同的人類組織中存在不同的表達模式，研究表明MAP1LC3的3種亞型在翻譯后修飾中存在差異[14]。針對抑郁癥發(fā)病機制的相關研究表明抑郁癥患者存在海馬神經元凋亡的情況，自噬能對應激狀態(tài)下的神經元起到保護作用，實驗研究表明在化學誘導的長期抑郁癥細胞模型中存在LC3-II這一自噬標志物的上調[15]?？挂钟羲幇⒚滋媪?AMI)和選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑西酞普蘭(CIT)能增加自噬標志物LC3-II和Beclin1在抑郁癥患者體內的表達[16]。

已有文獻報道證明發(fā)生抑郁癥時海馬神經元接受的應激能導致自噬發(fā)生[17]，且氟西汀能下調慢性不可預知應激(CUMS)抑郁大鼠細胞自噬關鍵基因Beclin1和LC3的mRNA及蛋白表達[18]。提示自噬現象與抑郁癥的發(fā)生關系緊密在本實驗中，通過慢性束縛應激造模方法建立抑郁癥大鼠模型，采用氟西汀作為陽性對照藥驗證抑郁癥模型。在成功建立慢性束縛應激抑郁癥大鼠模型后，采用逍遙散干預。實驗結果證明在慢性束縛應激抑郁癥大鼠海馬CA3區(qū)2個自噬標志蛋白Beclin-1、LC3表達均較正常組明顯增多，說明在抑郁癥大鼠海馬存在自噬現象，提示自噬可能是抑郁癥的發(fā)病機制之一，且Beclin1和LC3在其海馬自噬中發(fā)揮作用。在課題組前期研究已發(fā)現中藥傳統(tǒng)方劑逍遙散對于抑郁癥有較好的治療效果，試驗中采用逍遙散干預治療之后發(fā)現逍遙散能下調慢性束縛應激抑郁癥大鼠海馬CA3區(qū)Beclin-1和LC3的表達，提示逍遙散治療抑郁癥的機制可能是通過調節(jié)2個自噬標志蛋白從而抑制自噬現象。然而本實驗仍有不足之處，未通過電鏡觀察海馬神經元超微結構改變直觀地觀察模型大鼠海馬部位的神經元凋亡以及自噬現象。同時在本實驗基礎上運用RT-PCT及Western Blotting測定海馬Belin-1、LC3基因及蛋白表達變化情況能更清晰地從多角度多層次說明自噬相關蛋白Belin-1、LC3在慢性束縛應激抑郁癥大鼠海馬中的變化，從而揭示其與自噬在抑郁癥發(fā)病機制中的作用。希望在今后的工作中能進一步完善研究。

[1]Amico F，Meisenzahl E，Koutsouleris N，et al.Structural MRI correlates for vulnerability and resilience to major depressive disorder[J].J Psychiatry Neurosci，2011，36(1)：15-22.

[2]A Neumeister，S Wood，O Bonne,et al.Reduced hippocampal volume in unmedicated，remitted patients with major depression versus control subjects[J].Biol Psychiatry，2005，57(8)：935-937.

[3]Villanueva，R.Neurobiology of major depressive disorder[J].Neural Plast，2013，2013：873278.

[4]Ahdidan，J，LB Hviid，MM Chakravarty,et al.Longitudinal MR study of brain structure and hippocampus volume in major depressive disorder[J].Acta Psychiatr Scand，2011，123(3)：211-219.

[5]Mizushima N.and M.Komatsu，Autophagy：renovation of cells and tissues[J].Cell，2011，147(4)：728-741.

[6]朱琪，林芳.自噬的分子標志物[J].藥學學報，2016(1)：33-38.

[7]Matsunaga K1，Saitoh T，Tabata K，et al.Two Beclin 1-binding proteins，Atg14L and Rubicon，reciprocally regulate autophagy at different stages[J].Nat Cell Biol，2009，11(4)：385-396.

[8]Liang Y.，XL Guo，JX Chen,et al.Effects of the chinese traditional prescription xiaoyaosan decoction on chronic immobilization stress-induced changes in behavior and ultrastructure in rat hippocampus[J].Evid Based Complement Alternat Med，2013，2013：984797.

[9]Zhou Y.，L Lu，Z Li,et al.Antidepressant-like effects of the fractions of Xiaoyaosan on rat model of chronic unpredictable mild stress[J].J Ethnopharmacol，2011，137(1)：236-244.

[10]岳利峰,丁杰，陳家旭，等，肝郁脾虛證大鼠模型的建立與評價[J].北京中醫(yī)藥大學學報，2008，31(6)：396-400.

[11]Yorimitsu，T.and D.J.Klionsky.Autophagy：molecular machinery for self-eating[J].Cell Death Differ，2005，12(Suppl 2)：1542-1552.

[12]張雨晴,張麗慧，魏爾清，等.Beclin 1在凋亡和自噬中的調節(jié)作用[J].中國生物化學與分子生物學報，2015,31(4)：331-338.

[13]Dancourt，J.，T.J.Melia.Lipidation of the autophagy proteins LC3 and GABARAP is a membrane-curvature dependent process[J].Autophagy，2014，10(8)：1470-1471.

[14]H He，Y Dang，F Dai，et al.Post-translational modifications of three members of the human MAP1LC3 family and detection of a novel type of modification for MAP1LC3B[J].J Biol Chem，2003，278(31)：29278-29287.

[15]Jia，J.，Le W.Molecular network of neuronal autophagy in the pathophysiology and treatment of depression[J].Neurosci Bull，2015，31(4)：427-434.

[16]J Zschocke，N Zimmermann，B Berning，et al.Antidepressant drugs diversely affect autophagy pathways in astrocytes and neurons——dissociation from cholesterol homeostasis[J].Neuropsychopharmacology，2011，36(8)：1754-1768.

[17]M Shehata，H Matsumura，R Okubo-Suzuki,et al.Neuronal stimulation induces autophagy in hippocampal neurons that is involved in AMPA receptor degradation after chemical long-term depression[J].J Neurosci，2012，32(30)：10413-10422.

[18]沈忠飛，王志堅，潘巍巍，等.氟西汀調控CUMS抑郁大鼠海馬突觸重塑[J].中國病理生理雜志，2016，32(9)：1642-1647.

(2017-02-20收稿 責任編輯：洪志強)

Effects of Xiaoyaosan Decoction on the expression of Belin-1 and LC3 inhippocampus of rats with depression induced by chronic restraint stress

Wang Tingye, Li Xiaojuan, Zhou Xueming, Pan Qiuxia, Chen Jiaxu

(SchoolofBasicMedicalScience,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China)

Objective:To observe the effects of Xiaoyaosan Decoction on the expression of Belin-1 and LC3 in hippocampus of rats with depression induced by chronic restraint stress. Methods:A total of 20 Wistar rats were randomly divided into 4 groups：the control group, the model group, the Xiaoyaosan (XYS) group and the fluoxetine group. Depression model was established by 21-day chronic restraint stress, and the expression of Belin-1 and LC3 in CA3 of rats′ hippocampus was detected by immunohistochemistry. Results:There is significant differences between the control group and other groups (P<0.05). Xiaoyaosan Decoction could down-regulated the expression of Belin-1 and LC3 (P<0.05). Conclusion:The expression of Belin-1 and LC3 in hippocampus of rats with depression induced by chronic restraint stress indicated that autophagy may be part of the mechanism of depression. The effect of Xiaoyaosan Decoction on depression could be related to the regulation of Belin-1 and LC3.

Xiaoyaosan Decoction; Depression; Autophagy; Beclin-1; LCA

國家自然科學基金項目(編號：81473597；81630104)；北京市自然科學基金項目(編號7152093)

陳家旭，男，教授，博士研究生導師，北京市朝陽區(qū)北三環(huán)東路11號北京中醫(yī)藥大學中醫(yī)學院中醫(yī)診斷系83號信箱，郵編：100029，Tel：(010)64286656，E-mail：chenjx@bucm.edu.cn

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10.3969/j.issn.1673-7202.2017.03.007