李曉紅 陳家旭 孔鵬云 肖艷芬 楊力強(qiáng)

(1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)，南寧，530200； 2 北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京，100029)

逍遙散對(duì)肝郁脾虛證大鼠下丘腦基因表達(dá)譜的影響

李曉紅1陳家旭2孔鵬云1肖艷芬1楊力強(qiáng)1

(1 廣西中醫(yī)藥大學(xué)，南寧，530200； 2 北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京，100029)

目的：在全基因組水平上系統(tǒng)探討逍遙散對(duì)慢性束縛應(yīng)激肝郁脾虛證大鼠下丘腦基因表達(dá)譜的影響及其抗應(yīng)激調(diào)節(jié)機(jī)制。方法：采用Agilent大鼠全基因組表達(dá)譜芯片檢測(cè)慢性束縛應(yīng)激肝郁脾虛證大鼠模型(每天束縛3 h，連續(xù)21 d)正常組、模型組、逍遙散組(大、中、小劑量)下丘腦基因表達(dá)的差異，篩選出組間兩兩比較的差異基因表達(dá)譜，并利用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)差異基因表達(dá)譜進(jìn)行GO功能分析、信號(hào)通路分析。結(jié)果：模型組、逍遙散大、中、小劑量組具有不同的差異基因表達(dá)譜，多條生物過(guò)程和信號(hào)通路的功能被顯著上調(diào)或下調(diào)，其中模型組、逍遙散大、中、小劑量組差異基因參與的顯著生物過(guò)程分別有909、712、516、1322個(gè)功能基因群，參與的顯著信號(hào)通路分別有60、57、41、90條。結(jié)論：肝郁脾虛證具有下丘腦差異表達(dá)基因組學(xué)背景，逍遙散大、中、小劑量對(duì)肝郁脾虛證大鼠下丘腦眾多差異表達(dá)基因及功能改變的信號(hào)通路、生物過(guò)程均有一定的干預(yù)作用，大劑量和中劑量結(jié)果顯示優(yōu)于小劑量。

逍遙散；肝郁脾虛證；下丘腦；基因表達(dá)譜

基因芯片是目前發(fā)展最為成熟的生物芯片，近年來(lái)，在中醫(yī)藥研究中基因芯片技術(shù)已廣泛應(yīng)用于中醫(yī)證候、體質(zhì)、中藥復(fù)方作用機(jī)制、中藥有效成分篩選等領(lǐng)域[1]。肝郁脾虛證是肝失疏泄、脾失健運(yùn)所致的中醫(yī)證候，是臨床上的常見(jiàn)證型。逍遙散最早記載于《太平惠民和劑局方》，由柴胡、白芍、白術(shù)、茯苓、當(dāng)歸、甘草、生姜、薄荷8味藥物組成，是治療肝郁脾虛證的經(jīng)典名方，也是中醫(yī)治療情志病的經(jīng)典方劑之一,廣泛應(yīng)用于精神科和神經(jīng)科疾病如抑郁癥、焦慮癥、心臟神經(jīng)官能癥、睡眠障礙等的治療中[2-4]。慢性應(yīng)激可以導(dǎo)致抑郁癥已成為公認(rèn)事實(shí)，有抑郁癥史自殺患者的行為表現(xiàn)與慢性應(yīng)激引發(fā)癥狀非常一致，肝郁脾虛是抑郁癥最常見(jiàn)證型[5-6]，是抑郁癥中醫(yī)核心病機(jī)[7]。因此，為了進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)和闡明肝郁脾虛證的生物學(xué)基礎(chǔ)及逍遙散防治肝郁脾虛證、抑郁癥及抗慢性應(yīng)激的作用機(jī)制，本研究應(yīng)用Agilent大鼠基因表達(dá)譜芯片，觀察了逍遙散大中小劑量對(duì)慢性束縛應(yīng)激肝郁脾虛證大鼠中樞下丘腦差異基因表達(dá)譜的影響?，F(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物與分組 SD雄性大鼠75只，體質(zhì)量(200±20)g，購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(桂)2009-0002]，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后按體質(zhì)量隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、逍遙散大、中、小劑量組，每組15只。光照節(jié)律12L：12D(6：00—18：00)，飼養(yǎng)于普通級(jí)動(dòng)物房，室內(nèi)溫度保持為(22±2)℃，相對(duì)濕度保持為30%，大鼠喂常規(guī)飼料及飲用水。

1.1.2 藥物 實(shí)驗(yàn)所用中藥復(fù)方選用《太平惠民和劑局方》中的逍遙散，組成藥物購(gòu)自廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，按鄧中甲[8]主編的第七版《方劑學(xué)》教材所載藥物組成比例：柴胡30 g、當(dāng)歸30 g、白芍30 g、白術(shù)30 g、茯苓30 g、炙甘草15 g、煨姜和薄荷少許(本次實(shí)驗(yàn)各用10 g)用水煎成湯劑，濃縮至含生藥量1.67 g/mL。

1.2 方法

1.2.1 模型制備 采用慢性束縛應(yīng)激結(jié)合孤養(yǎng)方法制作肝郁脾虛證大鼠模型，將模型組和逍遙散大、中、小劑量組大鼠進(jìn)行捆綁束縛并單籠飼養(yǎng)造模，每日于夜間18:00—6:00點(diǎn)束縛3 h，束縛時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)，連續(xù)21 d。

1.2.2 藥物干預(yù) 正常對(duì)照組大鼠群養(yǎng)不予束縛，自由進(jìn)食、飲水及自主活動(dòng)。自造模第1天開(kāi)始，每日在束縛前1 h給各組大鼠灌胃，逍遙散組大鼠灌服逍遙散中藥煎液，根據(jù)成人逍遙散每日用量，按體表面積換算成大鼠大劑量用藥量為16.7 g/(kg·d)，中劑量用藥量為8.35 g/(kg·d)，小劑量用藥量為4.175 g/(kg·d)，灌胃容積為1 mL/100 g體質(zhì)量，正常組、模型組大鼠每日灌服大劑量同等換算量的生理鹽水，造模期間根據(jù)大鼠體質(zhì)量調(diào)整給藥量。

1.2.3 取材 造模21 d結(jié)束后取材標(biāo)本，各組大鼠以2%戊巴比妥鈉腹腔注射進(jìn)行深度麻醉(40 mg/kg)，鍘刀斷頭，在超凈臺(tái)內(nèi)冰上剝離出完整大腦取下丘腦組織置凍存管中迅速放入液氮速凍，取材完畢將標(biāo)本放入-80 ℃冰箱保存用于基因芯片實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 基因芯片檢測(cè)下丘腦差異基因表達(dá)譜 每組選取3只大鼠的下丘腦標(biāo)本提取總RNA，使用NanoDrop ND-1000評(píng)估RNA的純度和濃度，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)變性凝膠電泳評(píng)估RNA完整性。總RNA質(zhì)檢后進(jìn)行芯片實(shí)驗(yàn)，芯片為Agilent Rat 4×44K Gene Expression Microarrays，RNA樣品標(biāo)記和芯片雜交根據(jù)Agilent One-Color Microarray-Based Gene Expression Analysis實(shí)驗(yàn)方案(Agilent Technology)執(zhí)行，由上?？党缮锕こ逃邢薰就瓿苫虮磉_(dá)譜檢測(cè)。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析 使用Agilent Feature Extraction軟件(v11.0.1.1)獲得芯片圖，并讀值，得到原始數(shù)據(jù)。使用GeneSpring GX v12.1軟件(Agilent Technologies)對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行Quantile標(biāo)準(zhǔn)化和隨后的數(shù)據(jù)處理。原始數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后經(jīng)過(guò)篩選高質(zhì)量探針進(jìn)行進(jìn)一步分析。2個(gè)樣品間差異表達(dá)基因通過(guò)Fold Change篩選，以Fold change>=2.0標(biāo)準(zhǔn)來(lái)確定差異表達(dá)基因。使用topGO[9]進(jìn)行差異基因的GO分析，使用標(biāo)準(zhǔn)的富集計(jì)算方法對(duì)差異基因進(jìn)行Pathway分析，Pathway來(lái)源于KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)。

2 結(jié)果

2.1 芯片散點(diǎn)圖 見(jiàn)圖1。

圖1 組間兩兩比較的樣本標(biāo)準(zhǔn)化后的散點(diǎn)分布圖

注：圖1a～圖1d為組間兩兩比較的樣本標(biāo)準(zhǔn)化后的散點(diǎn)分布圖，橫縱坐標(biāo)代表樣本，每個(gè)點(diǎn)代表基因表達(dá)情況，點(diǎn)在上面斜線以上為上調(diào)大于2倍的基因，代表縱坐標(biāo)的樣本相對(duì)高表達(dá)，點(diǎn)在斜線以下為下調(diào)大于2倍的基因，代表橫縱標(biāo)的樣本相對(duì)高表達(dá)，點(diǎn)離斜線越遠(yuǎn)說(shuō)明信號(hào)值越高，點(diǎn)在上下斜線中間的為無(wú)差異變化。

圖2 逍遙散大、中、小劑量組與模型組上調(diào)和下調(diào)基因交集結(jié)果圖

圖3 逍遙散大、中、小劑量組與模型組功能上調(diào)和下調(diào)的生物過(guò)程交集結(jié)果圖表1 逍遙散大、中、小劑量干預(yù)后模型組功能沒(méi)有逆轉(zhuǎn)的信號(hào)通路名稱

組別上調(diào)通路下調(diào)通路逍遙散大劑量組1.MAPKsignalingpathway(雙向調(diào)節(jié)通路)2.Calciumsignalingpathway(雙向調(diào)節(jié)通路)3.Leukocytetransendothelialmigration4.Circadianentrainment(雙向調(diào)節(jié)通路)1.Amphetamineaddiction2.Salivarysecretion逍遙散中劑量組1.Viralmyocarditis2.HTLV-Iinfection3.Allograftrejection4.Autoimmunethyroiddisease5.Epstein-BarrvirusinfectionAmphetamineaddiction逍遙散小劑量組1.Allograftrejection2.TypeIdiabetesmellitus3.Autoimmunethyroiddisease4.Graft-versus-hostdisease5.Naturalkillercellmediatedcytotoxicity6.Viralmyocarditis7.HTLV-Iinfection8.Regulationofactincytoskeleton9.MAPKsignalingpathway(雙向調(diào)節(jié)通路)10.Celladhesionmolecules(CAMs)11.Endocytosis12.Antigenprocessingandpresentation13.Phagosome14.Amoebiasis15.Epstein-Barrvirusinfection1.Retrogradeendocannabinoidsignaling2.Rap1signalingpathway3.MAPKsignalingpathway(雙向調(diào)節(jié)通路)4.MicroRNAsincancer5.Adrenergicsignalingincardiomyocytes6.Amphetamineaddiction7.GnRHsignalingpathway8.Proteoglycansincancer9.Calciumsignalingpathway(雙向調(diào)節(jié)通路)10.ErbBsignalingpathway11.Tcellreceptorsignalingpathway12.Circadianentrainment(雙向調(diào)節(jié)通路)13.Melanogenesis14.Salivarysecretion15.Long-termpotentiation16.Thyroidhormonesynthesis17.Arrhythmogenicrightventricularcardiomyopathy(ARVC)18.Thyroidhormonesignalingpathway19.Rap1signalingpathway20.Bacterialinvasionofepithelialcells

2.2 差異表達(dá)基因 1)模型組與正常組比較差異表達(dá)基因(簡(jiǎn)稱模型組差異基因)：與正常組比較，模型組篩選出2 856個(gè)差異基因，其中1 653個(gè)上調(diào)基因，1 203個(gè)下調(diào)基因。

2)逍遙散組與模型組比較差異表達(dá)基因(簡(jiǎn)稱逍遙散組差異基因)：逍遙散大劑量組與模型組比較篩選出1 051個(gè)差異基因，其中506個(gè)上調(diào)基因，545個(gè)下調(diào)基因；逍遙散中劑量組與模型組比較篩選出837個(gè)差異基因，其中513個(gè)上調(diào)基因，324個(gè)下調(diào)基因；逍遙散小劑量組與模型組比較篩選出2 077個(gè)差異基因，其中767個(gè)上調(diào)基因，1 310個(gè)下調(diào)基因。

3)逍遙散組差異基因與模型組差異基因交集結(jié)果：逍遙散大、中、小劑量組的1 051、837、2 077個(gè)上下調(diào)差異基因分別與模型組2 856個(gè)上下調(diào)差異基因進(jìn)行交集，結(jié)果分別有45(上調(diào)22個(gè)，下調(diào)23個(gè))、64(上調(diào)46個(gè)，下調(diào)18個(gè))、224(上調(diào)43個(gè)，下調(diào)181個(gè))個(gè)共同差異基因仍為上調(diào)或下調(diào)表達(dá)，從共同差異基因數(shù)目看逍遙散小劑量沒(méi)有逆轉(zhuǎn)模型組差異表達(dá)的基因數(shù)目遠(yuǎn)多于中劑量和大劑量。圖2a～圖2f分別表示逍遙散大、中、小劑量組與模型組上調(diào)和下調(diào)基因交集結(jié)果。

2.3 差異表達(dá)基因GO功能分析結(jié)果 1)模型組差異基因參與的顯著生物過(guò)程涉及909個(gè)功能基因群，其中功能上調(diào)的生物過(guò)程有390條，主要集中在神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)分泌、系統(tǒng)過(guò)程、多細(xì)胞生物過(guò)程、膜去極化等方面；功能下調(diào)的生物過(guò)程有519條，主要集中在細(xì)胞組分組織或細(xì)胞水平的生物發(fā)生、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、正調(diào)節(jié)神經(jīng)發(fā)生、前腦發(fā)育、信號(hào)的預(yù)處理等方面。

2)逍遙散大劑量組差異基因參與的顯著生物過(guò)程涉及715個(gè)功能基因群，其中功能上調(diào)的生物過(guò)程有383條，主要集中在甘油脂分解代謝過(guò)程，調(diào)節(jié)運(yùn)輸、調(diào)節(jié)系統(tǒng)過(guò)程、肌細(xì)胞發(fā)育、血管重塑等方面；功能下調(diào)的生物過(guò)程有332條，主要集中在系統(tǒng)發(fā)育、多細(xì)胞生物體發(fā)育、解剖結(jié)構(gòu)發(fā)展、組織發(fā)育、對(duì)環(huán)磷腺苷(cAMP)的反應(yīng)等方面；逍遙散中劑量組差異基因參與的顯著生物過(guò)程涉及516個(gè)功能基因群，其中功能上調(diào)的生物過(guò)程有193條，主要集中在肌細(xì)胞發(fā)育、脂蛋白代謝過(guò)程、心室心肌細(xì)胞發(fā)育、蛋白質(zhì)自身磷酸化的正調(diào)節(jié)、蛋白脂質(zhì)化等方面；功能下調(diào)的生物過(guò)程有323條，主要集中在對(duì)有機(jī)物的反應(yīng)、對(duì)環(huán)磷腺苷(cAMP)的反應(yīng)、組織發(fā)育、細(xì)胞分裂、細(xì)胞單價(jià)無(wú)機(jī)陽(yáng)離子體內(nèi)平衡等方面。逍遙散小劑量組差異基因參與的顯著生物過(guò)程涉及1 322個(gè)功能基因群，其中功能上調(diào)的生物過(guò)程有347條，主要集中在調(diào)節(jié)心臟收縮、調(diào)節(jié)系統(tǒng)過(guò)程、細(xì)胞因子產(chǎn)生的正調(diào)節(jié)、脂蛋白代謝過(guò)程、鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)等方面；功能下調(diào)的生物過(guò)程有975條，主要集中在本土化、細(xì)胞過(guò)程的正調(diào)節(jié)、運(yùn)輸、主要代謝過(guò)程的調(diào)節(jié)、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育等方面。

3)逍遙散組生物過(guò)程與模型組生物過(guò)程交集結(jié)果：逍遙散大、中、小劑量組的715、516、1 322條功能上調(diào)和下調(diào)的生物過(guò)程分別與模型組909條功能上調(diào)和下調(diào)的生物過(guò)程進(jìn)行交集，結(jié)果分別有146(上調(diào)78條、下調(diào)68條，其中有62條為雙向調(diào)節(jié))、103(上調(diào)35條、下調(diào)68條，其中有40條為雙向調(diào)節(jié))、419(上調(diào)62條、下調(diào)357條，其中99條為雙向調(diào)節(jié))條相同生物過(guò)程的功能仍為上調(diào)或下調(diào)表達(dá)，從交集部分相同的生物過(guò)程看逍遙散小劑量組沒(méi)有逆轉(zhuǎn)模型組功能改變的生物過(guò)程遠(yuǎn)多于大劑量和中劑量。圖3a～圖3f分別表示逍遙散大、中、小劑量組與模型組功能上調(diào)和下調(diào)的生物過(guò)程交集結(jié)果。

2.4 差異基因信號(hào)通路(Pathway)結(jié)果 1)模型組差異基因參與的顯著通路共有60條，其中上調(diào)通路29條，主要表現(xiàn)在MAPK信號(hào)通路、抗原加工與提呈、內(nèi)吞、EB病毒感染、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性等通路功能的改變；下調(diào)通路31條，主要表現(xiàn)在MAPK信號(hào)通路、促性腺激素釋放激素(GnRH)信號(hào)通路、鈣信號(hào)通路、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子信號(hào)通路、甲狀腺激素合成、胰腺分泌等通路功能的改變。

2)逍遙散大劑量組差異基因參與的顯著通路共有57條，其中上調(diào)通路31條，主要表現(xiàn)在致心律失常性右心室心肌病、肥厚性心肌病(HCM)、緊密連接、甘油代謝、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)信號(hào)通路等通路功能的改變；下調(diào)通路26條，主要表現(xiàn)在移植物抗宿主病、抗原加工與提呈、I型糖尿病、安非他明成癮、同種異體移植排斥等通路功能的改變；逍遙散中劑量組差異基因參與的顯著通路共有41條，其中上調(diào)通路13條，主要表現(xiàn)在病毒性心肌炎、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、酮體的合成和降解、碳代謝、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)信號(hào)通路等通路功能的改變；下調(diào)通路28條，主要表現(xiàn)在細(xì)胞黏附分子、抗原加工與提呈、吞噬體、病毒性心肌炎、人類T淋巴細(xì)胞白血病病毒Ⅰ型(HTLV-1)感染等通路功能的改變；逍遙散小劑量組差異基因參與的顯著通路共有90條，其中上調(diào)通路30條，主要表現(xiàn)在同種異體移植排斥、I型糖尿病、自身免疫性甲狀腺疾病、移植物抗宿主病、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性等通路功能的改變；下調(diào)通路60條，主要表現(xiàn)在逆行內(nèi)源性大麻素信號(hào)、粘著斑、嗎啡成癮、Rap1信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路等通路功能的改變。

3)逍遙散組信號(hào)通路與模型組信號(hào)通路交集結(jié)果：逍遙散大、中、小劑量組的57、41、90條顯著通路分別與模型組60條顯著通路進(jìn)行交集，結(jié)果分別有6(其中3條為雙向調(diào)節(jié)通路)、6、35(其中4條為雙向調(diào)節(jié)通路)條共同通路的功能仍為激活或抑制，從交集部分相同的信號(hào)通路看逍遙散小劑量組沒(méi)有逆轉(zhuǎn)模型組功能改變的顯著信號(hào)通路遠(yuǎn)多于中劑量和大劑量。由于篇幅原因，交集圖省略，表1列出逍遙散大、中、小劑量干預(yù)后模型組功能沒(méi)有逆轉(zhuǎn)的信號(hào)通路名稱。

3 討論

中醫(yī)學(xué)的發(fā)展以臨床療效為基石，以整體觀念和辨證論治為理論和思維特色。中藥復(fù)方是中醫(yī)治病的主要臨床應(yīng)用形式，其進(jìn)入機(jī)體后，通過(guò)多成分、多途徑、多靶點(diǎn)的協(xié)同整合作用發(fā)揮了單味藥無(wú)法獲得的治療效果[10]。證候是中醫(yī)學(xué)認(rèn)識(shí)疾病、臨床診療和療效判定的核心基礎(chǔ)。證候作為一種有規(guī)律的病理表現(xiàn)或一種功能表現(xiàn)，必然有其內(nèi)在的物質(zhì)結(jié)構(gòu)來(lái)支配它，以往的研究表明反映中醫(yī)證候規(guī)律的“物質(zhì)基礎(chǔ)”不僅是一些特征性物質(zhì)，而且可能是“組”“群”“譜”集成的形式[11-13]。系統(tǒng)生物學(xué)是當(dāng)前生命復(fù)雜體系研究比較公認(rèn)的科學(xué)思維方式和研究手段，中醫(yī)學(xué)的整體觀、辨證論治和方劑配伍等理論與系統(tǒng)生物學(xué)的意旨有相同之處。基因芯片技術(shù)是系統(tǒng)生物學(xué)的主要技術(shù)平臺(tái)之一，根據(jù)芯片的功能可以分為基因表達(dá)譜芯片和DNA測(cè)序芯片?；蛐酒哂懈咄浚⑿蟹治龅奶攸c(diǎn)，能夠在同一時(shí)間內(nèi)并行分析大量的基因，進(jìn)行大信息量的篩選與檢測(cè)分析，優(yōu)于其他傳統(tǒng)的技術(shù)方法，因而能整體宏觀地研究生物體基因的表達(dá)及功能。生物信息學(xué)主要研究?jī)?nèi)容是與生物基因組研究相關(guān)的生物信息的獲取、加工、儲(chǔ)存、分配、分析和解釋，其實(shí)質(zhì)就是利用計(jì)算機(jī)科學(xué)和網(wǎng)絡(luò)技術(shù)來(lái)解決生物學(xué)問(wèn)題?；蛐酒梢源笠?guī)模地篩選藥物，能夠在藥物和基因之間架起橋梁，從基因水平研究和解釋藥物的作用機(jī)制和藥物的不良反應(yīng)[14]。因此，運(yùn)用基因芯片獲得中醫(yī)證候及中藥復(fù)方的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)，通過(guò)生物信息學(xué)方法的處理，有望從基因水平闡釋證候的分子生物學(xué)基礎(chǔ)及中藥復(fù)方的作用機(jī)制。

本研究應(yīng)用Agilent大鼠全基因組表達(dá)譜芯片篩選了慢性束縛應(yīng)激肝郁脾虛證模型大鼠及逍遙散大、中、小劑量干預(yù)大鼠下丘腦差異基因表達(dá)譜，并應(yīng)用生物信息學(xué)方法對(duì)差異基因表達(dá)譜進(jìn)行了GO功能分析和信號(hào)通路分析。從研究結(jié)果看出21 d慢性應(yīng)激復(fù)制出的肝郁脾虛證大鼠具有下丘腦差異表達(dá)基因組學(xué)背景，模型組大鼠下丘腦差異基因表達(dá)譜涉及2 856個(gè)差異表達(dá)基因，差異表達(dá)基因參與了909條生物過(guò)程和60條信號(hào)通路的功能顯著改變，涉及細(xì)胞組分、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和垂體、甲狀腺、胰腺等內(nèi)分泌系統(tǒng)以及MAPK信號(hào)通路、鈣信號(hào)通路、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子信號(hào)通路等等多方面的變化。對(duì)于模型組大鼠出現(xiàn)的這些變化逍遙散大、中、小劑量均有一定的干預(yù)效果，顯示出整體雙向調(diào)節(jié)作用。逍遙散組大鼠與模型組大鼠的差異基因、生物過(guò)程、信號(hào)通路交集結(jié)果顯示，模型組大鼠2 856個(gè)差異表達(dá)基因、909條功能顯著改變的生物過(guò)程、60條功能顯著改變的信號(hào)通路經(jīng)過(guò)逍遙散大、中、小劑量干預(yù)后，分別只有45、64、224個(gè)差異基因表達(dá)水平?jīng)]有接近正常組大鼠仍出現(xiàn)上調(diào)或下調(diào)表達(dá)，84、63、320條(除外雙向調(diào)節(jié)的生物過(guò)程)顯著生物過(guò)程的功能仍為上調(diào)或下調(diào)狀態(tài)，3、6、31條(除外雙向調(diào)節(jié)的信號(hào)通路)通路的功能仍處于激活或抑制狀態(tài)，差異基因逆轉(zhuǎn)效果分別為98.4%、97.7%、92.1%，生物過(guò)程逆轉(zhuǎn)效果分別為90.7%、93%、64.7%，信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)效果分別為95%、90%、48.3%，結(jié)果顯示逍遙散大、中、小劑量對(duì)單個(gè)差異基因的干預(yù)效果均達(dá)到了90%以上，但整體干預(yù)效果大、中劑量還是優(yōu)于小劑量。另外，研究結(jié)果也顯示逍遙散大、中、小劑量除了逆轉(zhuǎn)了模型組大鼠體內(nèi)出現(xiàn)的上述變化外，逍遙散組大鼠差異表達(dá)基因還參與了眾多不同于模型組大鼠的顯著生物過(guò)程和顯著信號(hào)通路的功能改變，并且大、中、小劑量最顯著的干預(yù)效果表現(xiàn)在不同方面。

本次研究同時(shí)應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法對(duì)芯片結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證，所驗(yàn)證的差異基因和芯片結(jié)果表達(dá)趨勢(shì)基本一致(驗(yàn)證結(jié)果放于另外文章發(fā)表)，提示本次研究結(jié)果還是具有一定的客觀可靠性，可為后續(xù)研究提供參考及思路，但由于本研究每個(gè)實(shí)驗(yàn)組只做了3只大鼠的基因表達(dá)譜芯片，樣本例數(shù)較少，不具有足夠的說(shuō)服力，在今后研究工作中需擴(kuò)大樣本應(yīng)用多種實(shí)驗(yàn)方法從組織、細(xì)胞及分子水平對(duì)基因表達(dá)譜進(jìn)行驗(yàn)證和深入研究，以期闡明肝郁脾虛證的生物學(xué)基礎(chǔ)及逍遙散防治肝郁脾虛證及抗慢性應(yīng)激的作用機(jī)制。

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(2017-02-20收稿 責(zé)任編輯：洪志強(qiáng))

Effects of Xiaoyao Powder on hypothalamus gene expression profile of rats with liver-stagnation and spleen-deficiency syndrome

Li Xiaohong1, Chen Jiaxu2, Kong Pengyun1, Xiao Yanfen1, Yang Liqiang1

(1GuangxiUniversityofChineseMedicine,Nanning, 530200; 2BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China)

Objective:To systematically investigate the effect of Xiaoyao powder on hypothalamus gene expression profile of rats with syndrome of liver-depression and spleen-deficiency induced by chronic immobilization stress and its anti-stress regulatory mechanism at the whole genome. Methods:The rat whole genome expression chips(Agilent) were used to detect gene expression differences in the hypothalamus of the rat model with liver-stagnation and spleen-deficiency syndrome induced by chronic immobilization stress(daily immobilization stress for 3 h for 21 days) in normal group, model group and Xiaoyao powder group(large, medium and small doses) and any different gene expression profiles between groups were recognized and selected.The hypothalamus gene expression profile was studied through gene ontology and signal pathway analyses using bioinformatics. Results:The differential gene expression profiles of model group and Xiaoyao Powder groups (large, medium and small dose) were different. The functions of multiple biological processes and signaling pathways were significantly up-regulated or down-regulated. The significantly-changed biological processes participated by differential gene of the model group and the Xiaoyao Powder groups(Large, medium and small dose) had909,712,516,1322 respectively, and signal pathways had 60,57,41,90 respectively. Conclusion:The liver-stagnation and spleen-deficiency syndrome has the background of differentially expressed genomics in hypothalamus. The large, medium and small doses of Xiaoyao powder all have a certain intervention effect on multiple hypothalamus differentially expressed genes, signal pathway and biological process whose functions are both changed. The result shows the large and medium doses are better than the small dose.

Xiaoyao Powder；The Live-stagnation and Spleen Deficiency Syndrome；Hypothalamus；Gene Expression Profile

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：81360526；81560750)；廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：2013GXNSFAA019129)；廣西特色實(shí)驗(yàn)動(dòng)物病證模型重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)項(xiàng)目(編號(hào)：桂教科研[2014]14)

李曉紅，醫(yī)學(xué)博士，副教授，從事中醫(yī)證候生物學(xué)基礎(chǔ)研究，Tel：(0771)4733794，E-mail:lsyuan2008@126.com

楊力強(qiáng)，教授，醫(yī)學(xué)博士，從事方證研究，Tel：(0771)4733794，E-mail:ylq6606@163.com

R289.3；R277.7

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.03.006