周厚君 魏凱莉 江 成 趙巖秋 宋學(xué)勤 盧孟柱

(林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所 北京100091)

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楊樹(shù)GRF1/2d負(fù)調(diào)控不定根的發(fā)生和發(fā)育*

周厚君 魏凱莉 江 成 趙巖秋 宋學(xué)勤 盧孟柱

(林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所 北京100091)

【目的】 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子(GRFs)是一類植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育的多個(gè)生物學(xué)過(guò)程。研究楊樹(shù)組織和器官發(fā)育中GRFs的作用，尤其是對(duì)不定根形成的調(diào)控，不僅可以豐富根發(fā)育的理論，而且對(duì)于楊樹(shù)的扦插繁殖具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值?！痉椒ā?從銀腺楊84K中分離了PtGRF1/2d基因和其啟動(dòng)子，通過(guò)對(duì)其miR396靶位點(diǎn)核苷酸進(jìn)行同義突變，獲得不受miR396調(diào)控的突變形式的mPtGRF1/2d，并將啟動(dòng)子和該突變形式分別構(gòu)建至含有GUS報(bào)告基因的植物表達(dá)載體和過(guò)量表達(dá)載體，通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化分別獲得PPtGRF1/2d∷GUS啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)和mPtGRF1/2d過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)。通過(guò)GUS染色分析PtGRF1/2d楊樹(shù)啟動(dòng)子的表達(dá)特性，并對(duì)過(guò)表達(dá)mPtGRF1/2d楊樹(shù)不定根的發(fā)生時(shí)間、數(shù)目和長(zhǎng)度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，利用qRT-PCR分析不定根發(fā)育早期相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)?！窘Y(jié)果】 PtGRF1/2d主要在根的中柱鞘和根尖位置表達(dá)，說(shuō)明其參與了根的形成； 過(guò)量表達(dá)mPtGRF1/2d基因影響了楊樹(shù)不定根的發(fā)生、發(fā)育，導(dǎo)致了不定根發(fā)生延遲、數(shù)目和長(zhǎng)度均減少，且差異均達(dá)到顯著水平或極顯著水平，表明PtGRF1/2d對(duì)不定根的發(fā)生和發(fā)育具有負(fù)調(diào)控作用。qRT-PCR分析顯示， 過(guò)表達(dá)mPtGRF1/2d楊樹(shù)的不定根發(fā)育相關(guān)基因PtSCR，PtAIL9，PtBBM2，PtPLT1.2和PtWOX11b的表達(dá)量均被下調(diào)，表明PtGRF1/2d的過(guò)量表達(dá)抑制了根原基發(fā)生和不定根發(fā)育相關(guān)的關(guān)鍵調(diào)控因子的表達(dá)，影響了根原基的發(fā)生和不定根的形成，導(dǎo)致不定根數(shù)目和長(zhǎng)度的變化，最終影響了楊樹(shù)的生長(zhǎng)。【結(jié)論】PtGRF1/2d作為不定根形成的負(fù)調(diào)控因子，位于不定根調(diào)控途徑的上游，通過(guò)下調(diào)促進(jìn)不定根形成的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)來(lái)抑制根原基形成和不定根發(fā)育，導(dǎo)致不定根發(fā)生延遲、數(shù)目和長(zhǎng)度減少。

PtGRF1/2d； 銀腺楊84K； 過(guò)量表達(dá)； 不定根； 負(fù)調(diào)控

生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子(growth-regulating factor, GRF)是一類植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要的調(diào)控作用(Kimetal., 2003; 2015； Zhangetal.， 2008; Bazinetal., 2013; Wangetal., 2014; Omidbakhshfardetal., 2015)。GRFs基因通常在幼嫩的組織中表達(dá)量較高，在成熟的組織中表達(dá)量較低(Kimetal., 2003)，提示GRFs基因可能參與植物的早期發(fā)育。大多數(shù)GRF是miR396的靶基因，與miR396一起參與多種植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，包括根的生長(zhǎng)(Kimetal., 2015; Omidbakhshfardetal., 2015)。擬南芥(Arabidopsisthaliana)中大多數(shù)AtGRF在根中顯示出較高的表達(dá)水平(Baoetal., 2014)，而且調(diào)控它們的miR396對(duì)根正常發(fā)育至關(guān)重要(Hewezietal., 2012)。干涉miR396a擬南芥根比野生型的長(zhǎng)，而miR396a和miR396b過(guò)表達(dá)植株以及過(guò)表達(dá)不受miR396調(diào)控形式的AtGRF1或AtGRF3(靶位點(diǎn)堿基誘變)植株的根均變短(Hewezietal., 2012; Baoetal., 2014)。同樣，研究人員發(fā)現(xiàn)苜蓿(Medicagotruncatula)中MtGRF2、MtGRF4和MtGRF6的RNAi植株表現(xiàn)出根的長(zhǎng)度比野生型短的表型(Bazinetal., 2013)，而在miR396過(guò)表達(dá)苜蓿中，分生組織細(xì)胞數(shù)目變少、細(xì)胞周期特征基因表達(dá)量降低和處于復(fù)制期的細(xì)胞比例降低，表明miR396-GRF通過(guò)影響細(xì)胞周期途徑實(shí)現(xiàn)對(duì)根發(fā)育的調(diào)控(Bazinetal., 2013)。與大多數(shù)擬南芥AtGRFs基因在根中顯現(xiàn)出較高的表達(dá)水平不同的是，水稻(Oryzasativa)OsGRFs基因在根中低表達(dá)(Baoetal., 2014)。與此相反，大白菜(Brassicapekinensis)BrGRF16基因在根中高表達(dá)，表明它可能參與根的發(fā)育(Omidbakhshfardetal., 2015)。這些結(jié)果表明在根發(fā)育方面 GRFs的功能存在多樣性和差異性。

GRFs對(duì)根發(fā)育影響的研究主要集中在草本植物，在木本植物生長(zhǎng)發(fā)育特別是不定根(adventitious roots)的發(fā)生和發(fā)育中的作用目前尚缺乏研究。不定根對(duì)木本植物的無(wú)性繁殖至關(guān)重要，也是決定繁殖成功與否的一個(gè)關(guān)鍵步驟。不定根的形成是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，通常有4個(gè)時(shí)期： 激活期、誘導(dǎo)期、根原基的激活及新組織的形成期和根原基伸長(zhǎng)及維管連接建立期。前期研究表明，不定根的這些過(guò)程都離不開(kāi)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控(Leguéetal., 2014)。轉(zhuǎn)錄因子SCARECROW(SCR)、APETALA2/ETHYLENE RESPONSE FACTOR(AP2/ERF)蛋白家族AINTEGUMENTA-like亞組[如PLETHORA(AtPLT),BABY BOOM(AtBBM),AINTEGUMENTA(AtANT)和 AINTEGUMENTA-like(AtAIL)]及WUSCHEL-related homeobox(WOX)(Krizeketal., 2000; Mizukamietal., 2000; Nole-Wilsonetal., 2005; Iminetal., 2007; Horstmanetal., 2014; Liuetal., 2014; Xuetal., 2015)均與不定根形成相關(guān)。楊樹(shù)不定根形成過(guò)程中會(huì)發(fā)生重要的轉(zhuǎn)錄組重塑，其中35個(gè)家族的轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)發(fā)生了顯著變化(Ramírez-Carvajaletal., 2009; Rigaletal., 2012; Leguéetal., 2014)，表明楊樹(shù)不定根的形成同樣與轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控密切相關(guān)。但對(duì)楊樹(shù)不定根發(fā)生和形成的調(diào)控機(jī)制還缺乏認(rèn)識(shí)。

楊樹(shù)作為研究樹(shù)木生長(zhǎng)發(fā)育的模式樹(shù)種，研究其不定根的形成和形成過(guò)程中的分子調(diào)控機(jī)制，對(duì)研究樹(shù)木不定根的分子遺傳具有非常重要的理論指導(dǎo)意義。本研究從銀腺楊84K(Populusalba×P.glandulosa‘84K’)中分離了擬南芥AtGRF1和AtGRF2同源基因PtGRF1/2d，并對(duì)miR396靶位點(diǎn)的核苷酸進(jìn)行同義突變，獲得了不受miR396調(diào)控的突變形式mPtGRF1/2d，通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化獲得過(guò)量表達(dá)mPtGRF1/2d的轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)，并對(duì)其不定根的發(fā)生、發(fā)育進(jìn)行分析，為了解GRF調(diào)控楊樹(shù)不定根的形成奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

銀腺楊84K組培苗為中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林木遺傳育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存并擴(kuò)繁； pDNOR222.1、pCAMBIA1300和pMDC164載體、大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α及農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)GV3101菌種均由本實(shí)驗(yàn)室保存； PCR引物合成和測(cè)序由英濰捷基生物公司完成； KOD PLUS酶購(gòu)自TOYOBO公司； 重組酶購(gòu)自 Invitrogen公司；TaqDNA聚合酶購(gòu)自TaKaRa公司； 限制性內(nèi)切酶購(gòu)自NEB公司； DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自AxyGen公司； RNA提取試劑盒、DNA酶購(gòu)自QIAGEN公司； 反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Invitrogen公司； 定量試劑購(gòu)自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒和載體構(gòu)建 利用擬南芥AtGRF1和AtGRF2基因序列在毛果楊(Populustrichocarpa)基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)進(jìn)行比對(duì)，獲取擬南芥AtGRF1和AtGRF2同源基因PtGRF1/2d序列和其啟動(dòng)子序列，據(jù)序列設(shè)計(jì)基因特異PCR引物(表1)。通過(guò)RT-PCR方法從銀腺楊84K cDNA中分離得到PtGRF1/2d基因，并在不改變其編碼氨基酸的基礎(chǔ)上，將PtGRF1/2d中miR396靶位點(diǎn)處6個(gè)核苷酸進(jìn)行突變，使得mPtGRF1/2d與miR396成熟序列不能嚴(yán)格配對(duì)，從而避免在轉(zhuǎn)錄水平被miR396降解，獲取不受miR396調(diào)控的突變形式mPtGRF1/2d，將其克隆至pDNOR222.1載體，測(cè)序驗(yàn)證后，重組至pCAMBIA1300過(guò)表達(dá)載體。從銀腺楊84K基因組DNA中分離PtGRF1/2d基因的啟動(dòng)子，克隆至pDNOR222.1載體并重組至帶有GUS報(bào)告基因的pMDC164植物表達(dá)載體。將構(gòu)建好的載體電擊轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法轉(zhuǎn)化銀腺楊84K。

表1 PtGRF1/2d基因克隆和qRT-PCR所用引物序列

1.2.2 植物材料培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化 植物材料培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化具體方法見(jiàn)文獻(xiàn)(Liuetal., 2014)。選取表達(dá)量較高的3個(gè)過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系，以野生型銀腺楊84K為對(duì)照，每個(gè)株系至少擴(kuò)繁15株，定植溫室。過(guò)量表達(dá)mPtGRF1/2d對(duì)楊樹(shù)株高影響的測(cè)定至少重復(fù)3次。

1.2.3 RNA提取和RT-PCR分析 組培30天過(guò)表達(dá)mPtGRF1/2d楊樹(shù)的葉用于PtGRF1/2d表達(dá)量鑒定； 組培扦插4天時(shí)處于不定根發(fā)育愈傷組織形成階段(Liuetal., 2014)的不定根發(fā)生部位，具體為培養(yǎng)基插入部分約1 cm的下端莖段，用于不定根發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)量鑒定。以上表達(dá)鑒定均采用實(shí)時(shí)定量的方法且至少重復(fù)3次。RNA提取和反轉(zhuǎn)錄具體方法見(jiàn)Liu等(2014)，定量PCR的引物使用Primer 3軟件(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/input.htm)設(shè)計(jì)(序列見(jiàn)表1)。實(shí)時(shí)定量PCR用SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ試劑盒(TaKaRa，Dalian，China)在Roche 480定量PCR儀(Roche Applied Science)上完成，每個(gè)樣品4次重復(fù)，ACTIN基因作內(nèi)參。

1.2.4 GUS染色 組培30天的PPtGRF1/2d∷GUS轉(zhuǎn)基因楊樹(shù)用于GUS染色。GUS的組織化學(xué)染色具體方法見(jiàn)文獻(xiàn)(Liuet al., 2014)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

用MicrosoftExcel和SPSS17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，并用t檢驗(yàn)法檢驗(yàn)差異顯著性水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 GRF1/2d在不定根中的表達(dá)情況

不定根的形成包括R1預(yù)誘導(dǎo)階段、R2愈傷組織形成階段、R3不定根出現(xiàn)階段和R4不定根延長(zhǎng)階段(圖1A)(Liuet al., 2014)。銀腺楊84K不定根發(fā)育過(guò)程中，R1-R2時(shí)期PtGRF1/2d的轉(zhuǎn)錄活性先急劇下降后逐漸上升，R2時(shí)期PtGRF1/2d轉(zhuǎn)錄表達(dá)活性達(dá)到最強(qiáng)； 而R3-R4時(shí)期PtGRF1/2d轉(zhuǎn)錄表達(dá)急劇下降到起始時(shí)期水平(圖1B)。PtGRF1/2d的表達(dá)量在R2愈傷組織出現(xiàn)時(shí)期顯著上調(diào)(圖1B)，提示它可能是根分生組織(根原基發(fā)生)的關(guān)鍵調(diào)控因子。

為進(jìn)一步考察PtGRF1/2d的組織表達(dá)情況，創(chuàng)制了啟動(dòng)子融合GUS報(bào)告基因的PPtGRF1/2d∷GUS轉(zhuǎn)基因材料。結(jié)果顯示GUS信號(hào)在葉、莖和根組織中都存在(圖1C)。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，PtGRF1/2d在根部的信號(hào)集中在中柱鞘和根尖位置(圖1C:b,c)，這與其調(diào)控根分生組織活性的假設(shè)相一致。

圖1 不定根中PtGRF1/2d的表達(dá)情況Fig.1 Expression of PtGRF1/2d during the successive stages of adventitious root (AR) formationA: 不定根形成過(guò)程(R1: 預(yù)誘導(dǎo)階段; R2: 愈傷組織形成階段; R3: 不定根出現(xiàn)階段; R4: 不定根延長(zhǎng)階段); B: PtGRF1/2d動(dòng)態(tài)表達(dá)變化; C: PPtGRF1/2d∷GUS楊樹(shù)GUS染色(a-c: 局部放大圖)。A: The successive stages of adventitious root formation(R1: Preinduction stage; R2: Callus regeneration stage; R3: Adventitious root emergence stage; R4: Adventitious root elongation stage); B: Dynamic expression of PtGRF1/2d during the successive stages of adventitious root formation; C: Total PPtGRF1/2d∷GUS poplar plant GUS staining(a, b and c represent partial enlarged drawing of picture C).

2.2 過(guò)表達(dá)mPtGRF1/2d對(duì)楊樹(shù)不定根發(fā)生、數(shù)目和長(zhǎng)度的影響

為進(jìn)一步研究PtGRF1/2d對(duì)楊樹(shù)不定根發(fā)育的影響，對(duì)miR396靶位點(diǎn)核苷酸進(jìn)行同義突變，創(chuàng)制了不受miR396調(diào)控的過(guò)表達(dá)mPtGRF1/2d楊樹(shù)。從獲得的25個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)基因株系中選取表達(dá)量不同的3個(gè)獨(dú)立轉(zhuǎn)基因株系(#8、#9和#10)作為進(jìn)一步研究對(duì)象。

表型觀察發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)mPtGRF1/2d楊樹(shù)根系發(fā)育明顯變?nèi)?圖2A)，具體表現(xiàn)為： 3個(gè)株系不定根的發(fā)育明顯延遲(圖2C)； 且不定根數(shù)目減少，分別為3.1，3.6，2.8，對(duì)照楊樹(shù)為3.9(圖2D)，不定根數(shù)目減少了10%～30%，其中2個(gè)株系與對(duì)照植株的差異達(dá)到顯著水平(*,P<0.05)； 此外，3個(gè)株系不定根的長(zhǎng)度變短，分別為4.241，4.174，4.236 cm，對(duì)照楊樹(shù)則為5.24 cm，不定根長(zhǎng)度減少了20%左右，差異均達(dá)到極顯著水平(**,P<0.01)(圖2E)。以上結(jié)果表明，PtGRF1/2d可能是不定根發(fā)育的負(fù)調(diào)控因子。

不定根發(fā)育受多種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控(Leguéetal., 2014)。為了進(jìn)一步明確PtGRF1/2d與這些不定根發(fā)育相關(guān)調(diào)控因子SCR，AIL，BBM2，PLT1以及WOX11的關(guān)系，利用qRT-PCR技術(shù)對(duì)這些基因的表達(dá)量進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示，在不定根形成的起始階段，楊樹(shù)相應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子PtSCR，PtAIL9，PtBBM2，PtPLT1.2以及PtWOX11b基因的表達(dá)量在過(guò)表達(dá)mPtGRF1/2d楊樹(shù)中被顯著下調(diào)(圖2F)，表明PtGRF1/2d在不定根發(fā)育的起始階段發(fā)揮作用，可能是通過(guò)影響與根原基形成及不定根發(fā)育的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，負(fù)調(diào)控楊樹(shù)不定根的形成和伸展。

生長(zhǎng)90天的過(guò)表達(dá)mPtGRF1/2d楊樹(shù)株高生長(zhǎng)明顯低于對(duì)照(圖3A)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示： 過(guò)表達(dá)mPtGRF1/2d楊樹(shù)3個(gè)株系株高分別為22.17，23.83，26.00 cm，而對(duì)照為36.5 cm(圖3B)，3個(gè)株系的株高均低于對(duì)照，達(dá)到顯著水平(P<0.05)或極顯著水平(P<0.01)，表明PtGRF1/2d對(duì)楊樹(shù)不定根發(fā)生和發(fā)育的負(fù)調(diào)控所導(dǎo)致的不定根數(shù)目及長(zhǎng)度的減少，嚴(yán)重影響了楊樹(shù)的生長(zhǎng)。

圖2 過(guò)表達(dá)mPtGRF1/2d楊樹(shù)的不定根相關(guān)性狀分析Fig.2 Analysis of adventitious root (AR) traits of mPtGRF1/2d overexpression transgenic poplarsWT: 對(duì)照植株； #8, #9, #10: 過(guò)表達(dá)mPtGRF1/2d楊樹(shù)。WT: Wide type; #8, #9, #10: mPtGRF1/2d overexpression transgenic poplars. t-test: *, P < 0.05; **, P < 0.01.下同。The same below.

圖3 溫室定植90天的對(duì)照植株(WT)和過(guò)表達(dá)mPtGRF1/2d楊樹(shù)(#8, #9, #10)Fig.3 Ninety-day-old wide type(WT) and mPtGRF1/2d overexpression transgenic poplars (#8, #9, #10) in greenhouse

3 討論

根作為重要的植物器官，解析生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子(GRFs)對(duì)根的發(fā)育影響非常重要。但目前這類研究工作主要集中在擬南芥、苜蓿、水稻等草本植物中，在木本植物生長(zhǎng)發(fā)育中的作用研究很少。決定木本植物扦插繁殖一個(gè)重要方面就是不定根的發(fā)生和發(fā)育，因此本研究在木本植物楊樹(shù)中分析GRFs的作用，對(duì)于揭示楊樹(shù)不定根發(fā)生、發(fā)育的調(diào)控機(jī)制及其在扦插繁殖技術(shù)上的應(yīng)用具有重要的意義。

本研究克隆了楊樹(shù)PtGRF1/2d基因，表達(dá)分析顯示其在不定根發(fā)育的起始階段即根原基形成時(shí)期表達(dá)變化顯著(圖1B)； 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS染色分析表明PtGRF1/2d在不定根的中柱鞘和根尖高表達(dá)(圖1C: b, c)，表明該基因在根的形成和發(fā)育中的重要作用。通過(guò)對(duì)miR396靶位點(diǎn)的核苷酸進(jìn)行同義突變，獲取不受miR396調(diào)控的突變形式mPtGRF1/2d，用于獲得該基因的高表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株。過(guò)表達(dá)mPtGRF1/2d楊樹(shù)生長(zhǎng)受到抑制，主要是其不定根發(fā)育延遲，并且數(shù)目和長(zhǎng)度均減少(圖2)。上述結(jié)果說(shuō)明，GRF對(duì)楊樹(shù)不定根的影響與對(duì)其他植物如擬南芥根發(fā)育的影響一致，都具有負(fù)調(diào)控作用。

為了揭示其負(fù)調(diào)控作用的機(jī)制，利用qRT-PCR分析了過(guò)表達(dá)mPtGRF1/2d楊樹(shù)不定根發(fā)育早期與不定根形成有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子PtSCR，PtAIL9，PtBBM2，PtPLT1.2及PtWOX11b基因的表達(dá)。研究表明，SCR對(duì)不定根根原基形成過(guò)程中分生組織決定和維持有重要功能，而根原基的建立伴隨PtAIL1，PtAIL9，PtBBM2，PtPLT1.1和PtPLT1.2基因表達(dá)量的上調(diào)，根原基的分化則與PtAIL1，PtAIL5，PtAIL9，PtBBM2，PtPLT1.1和PtPLT1.2的表達(dá)調(diào)控相關(guān)(Leguéetal., 2014)。另外，WOX11a和WOX11b同樣參與不定根的發(fā)育(Liuetal., 2014; Xuetal., 2015)。過(guò)表達(dá)PtoWOX11/12a楊樹(shù)不定根數(shù)目增多(Liuetal., 2014)，而過(guò)表達(dá)PeWOX11a和PeWOX11b的楊樹(shù)不僅不定根的數(shù)目增加，莖上還會(huì)誘導(dǎo)出不定根，此外過(guò)表達(dá)PeWOX11b楊樹(shù)還會(huì)在葉腋誘導(dǎo)出不定根和不定根上誘導(dǎo)出芽(Xuetal., 2015)。本研究發(fā)現(xiàn)，在過(guò)表達(dá)mPtGRF1/2d楊樹(shù)中其中5個(gè)基因的表達(dá)量被下調(diào)(圖2F)，表明PtGRF1/2d的過(guò)量表達(dá)抑制了根原基發(fā)生和不定根發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)控因子的表達(dá)。其中在過(guò)表達(dá)mPtGRF1/2d楊樹(shù)中，WOX11b的表達(dá)下調(diào)2倍，表明PtGRF1/2d可通過(guò)抑制WOX11b表達(dá)影響根原基的分化，起到負(fù)調(diào)控作用。值得注意的是，PtGRF1/2d能夠抑制多個(gè)根原基發(fā)生與不定根形成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄，來(lái)抑制根原基的發(fā)生，延緩不定根的形成，最終導(dǎo)致不定根數(shù)目與長(zhǎng)度的變化。這說(shuō)明PtGRF1/2d位于不定根調(diào)控途徑的上游，具有重要的調(diào)控作用。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)，分析了PtGRF1/2d在不定根發(fā)生和發(fā)育中的作用。結(jié)果表明PtGRF1/2d是楊樹(shù)不定根形成的負(fù)調(diào)控因子，主要通過(guò)下調(diào)能夠促進(jìn)不定根形成的相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，來(lái)抑制根分生組織和根原基的形成，最終導(dǎo)致不定根發(fā)生延遲、數(shù)目和長(zhǎng)度減少。PtGRF1/2d如何抑制不定根轉(zhuǎn)錄因子，從而負(fù)調(diào)控不定根形成的具體機(jī)制有待進(jìn)一步深入解析。

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(責(zé)任編輯 徐 紅)

NegativeRegulationofGRF1/2dontheFormationandDevelopmentofAdventitiousRootsinPopulus alba × P. glandulosa ‘84K’

ZhouHoujunWeiKailiJiangChengZhaoYanqiuSongXueqinLuMengzhu

(State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding Research Institute of Forestry, Chinese Academy of Forestry Beijing 100091)

【objective】 Growth-regulating factors (GRFs) are plant-specific transcription factors that are involved in various developmental events, especially in root development. It is interesting to investigate the roles of GRFs in growth and development of tissues and organs, rooting in particular, in woody plants, which would not only increase our knowledge on the mechanisms of the regulation of adventitious root formation and also be useful for cutting propagation in woody plants. 【Method】PtGRF1/2dgene and its promotor were isolated fromPopulusalba×P.glandulosa‘84K’. The overexpression vector of miR396-resistant construct 35S：mPtGRF1/2d-GFPand the promoter-testing vector ofPPtGRF1/2d∷GUSwasgenerated.ThemiR396-resistantversionofmPtGRF1/2dcontainedsixsilentmutationswithinthemiR396-complementarydomainofthePtGRF1/2dgenomicclone,therebyincreasingthenumberofmismatchesbetweenmiR396andmPtGRF1/2dwithoutalteringtheaminoacidsequenceoftheencodedPtGRF1/2dprotein. mPtGRF1/2doverexpressiontransgenicpoplarsandPPtGRF1/2d∷GUStransgenicpoplarswereobtainedrespectively.ExpressioncharactersinPPtGRF1/2d∷GUStransgenicpoplarsandtimeofadventitiousrootappearance,thenumberandlengthofadventitiousrootsinoverexpressiontransgenicpoplarswereanalyzed.TheexpressionofrelatedtranscriptfactorsatearlystageofadventitiousrootformationinoverexpressiontransgenicpoplarswereanalyzedbyqRT-PCR. 【Result】TheresultsshowedthattheexpressionofPtGRF1/2dwasmainlyinthepericycleandtipofroot,suggestinggeneralinvolvementofPtGRF1/2dintherootdevelopment.ThedevelopmentofadventitiousrootsinmPtGRF1/2doverexpressiontransgenicpoplarswassignificantlyaffectedincomparisontothenon-transgenicpoplarsusedascontrols.OverexpressionofPtGRF1/2dcausednotonlythedelayedinitiationofadventitiousrootsbutalsothereducednumberandlengthofadventitiousroots,whichindicatesthatPtGRF1/2dexhibitsanegativeregulationoninitiationanddevelopmentofadventitiousroot.qRT-PCRanalysisindicatedthattheexpressionof5transcriptfactorspreviouslyshowninvolvementinadventitiousrootformation,includingPtSCR, PtAIL9, PtBBM2, PtPLT1.2andPtWOX11b,wasdown-regulatedatearlystageofadventitiousrootformationinoverexpressiontransgenicpoplars,whichdemonstratedthatoverexpressionofPtGRF1/2dsuppressedtheexpressionofkeyfactorsforadventitiousrootformationthusresultedinthedelayedformationofadventitiousrootsandthereducednumberandlengthofadventitiousroots,andfinallyinfluencedthegrowthofpoplar.【Conclusion】PtGRF1/2disanegativeregulatorofpoplaradventitiousrootformation,functioningintheupstreamofadventitiousrootformationregulationpathway,down-regulatestheexpressionofadventitiousrootrelatedfactorsforadventitiousrootformationthussuppressestheinductionoftherootprimordiumandadventitiousrootformation,andfinallyleadstothedelayedadventitiousrootsappearanceandthereducednumberandlength.

PtGRF1/2d; Populus alba × P. glandulosa ‘84K’;overexpression;adventitiousroot;negativeregulation

10.11707/j.1001-7488.20170304

2016-04-25；

2016-06-17。

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目“生長(zhǎng)調(diào)節(jié)因子PtGRF10參與楊樹(shù)次生生長(zhǎng)調(diào)控的機(jī)理研究”(31570676)。

S

A

1001-7488(2017)03-0033-07

*盧孟柱為通訊作者。