張文芳　高郁芳

隨著時(shí)代的發(fā)展，人們健康意識(shí)的逐漸提高，環(huán)境與農(nóng)產(chǎn)品的安全性受到了廣泛重視，而且對(duì)農(nóng)藥殘留的限制也要求的很嚴(yán)格。近年來(lái)，化學(xué)農(nóng)藥被大量使用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，由于多數(shù)在自然環(huán)境中不易降解，蓄積能力強(qiáng)，導(dǎo)致污染了環(huán)境，使病蟲(chóng)害產(chǎn)生了抗藥性，破壞了生態(tài)平衡，農(nóng)作物及畜產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留量超標(biāo)，危害了人體健康。而最值得注意的是生產(chǎn)這些化學(xué)農(nóng)藥過(guò)程中三廢的排放問(wèn)題，按我國(guó)1998年生產(chǎn)化學(xué)農(nóng)藥約18萬(wàn)t計(jì)，年排放的三廢超過(guò)40萬(wàn)t[1]。因此，化學(xué)農(nóng)藥的使用量勢(shì)必會(huì)不斷下降，而植物源農(nóng)藥將替代化學(xué)農(nóng)藥廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中。

植物源農(nóng)藥的活性成分是自然存在的物質(zhì)，在自然界中的降解不污染環(huán)境，不會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生危害，且低毒、低殘留、病蟲(chóng)害不易產(chǎn)生抗藥性， 農(nóng)產(chǎn)品的高品質(zhì)能夠得到充分保留。植物源農(nóng)藥活性成分復(fù)雜，通常能作用于靶標(biāo)生物的多個(gè)位點(diǎn)，有利于延緩靶標(biāo)生物的抗藥性；有些植物源農(nóng)藥還能刺激植物生長(zhǎng)，起到生長(zhǎng)調(diào)節(jié)作用[2]。因此植物源農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有廣闊的應(yīng)用前景。

紀(jì)淑娟等對(duì)丁香抑菌成分超聲波提取工藝進(jìn)行研究，得到以95%乙醇為溶劑的提取物對(duì)灰葡萄孢菌的抑菌率為62.47%[3]；楊幫等對(duì)美洲商陸抑菌活性進(jìn)行研究，得出以極性強(qiáng)的甲醇為溶劑對(duì)柑橘綠霉病和小麥紋枯病2種病原菌的抑菌率均達(dá)100%[4]；崔永明等在甘草總黃酮的提取技術(shù)及其抑菌活性研究中指出甘草總黃酮對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑制作用均較為明顯[5]；楊國(guó)平等通過(guò)天南星提取物對(duì)小鼠S180肉瘤的抑制作用的研究，得出天南星醇提物對(duì)小鼠S180肉瘤表現(xiàn)出明顯的抑制生長(zhǎng)作用，并未造成明顯毒害作用[6]。根據(jù)上述文獻(xiàn)可知，丁香、商陸、甘草、天南星對(duì)不同致病菌有很強(qiáng)的抑制生長(zhǎng)作用，而為研究不同中藥提取物對(duì)不同致病菌的抑制作用，本試驗(yàn)選用8種中藥材的提取物對(duì)4種主要致病菌進(jìn)行抑菌活性研究，以篩選出對(duì)主要致病菌有抑制作用的中藥提取物，對(duì)于開(kāi)發(fā)和利用我國(guó)豐富的中藥植物資源，有著十分重要的意義。

1 試驗(yàn)材料

1.1 試驗(yàn)儀器與試劑

LRH—280型微電腦控制生化培養(yǎng)箱、LDEX—40SCⅠ型立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器、無(wú)菌操作臺(tái)、高壓蒸汽滅菌鍋、回流提取器、HH—S型恒溫水浴鍋、培養(yǎng)皿、試管、分析天平﹑托盤天平﹑玻璃棒﹑燒杯、量筒、錐形瓶、玻璃吸管﹑酒精燈﹑涂布棒、打孔器、接菌環(huán)、挑針、記號(hào)筆等。95%乙醇、75%乙醇、無(wú)菌水等。

1.2 供試菌種

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli），由吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供；帶有薏苡彎孢葉斑病菌的病葉和菜豆灰霉病菌的病果，均采自吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院九站校區(qū)藥植園。

1.3 供試藥材

辛夷（Magnolia biondii Pamp.）的干燥花蕾、艾蒿（Artemisia argyi Levl.et Van.）的干燥葉、北豆根（Menispermum dahuricmn DC.）的干燥根莖、天南星[Arisaema erubescens （Wall.） Schott]的干燥塊莖、丁香（Eugenia aromatica Baill）的干燥花蕾、商陸（Phytolacca acinosa Roxb.）的干燥根、甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）的干燥根和根莖、蘿藦[Metaplexis japonica （Thunb.） Mark.]的干燥全草，以上藥材均購(gòu)自國(guó)營(yíng)中藥材藥店。

1.4 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：土豆 200g，葡萄糖 20g，瓊脂 20g，水 1000ml；高溫濕熱滅菌：121℃ 30min。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，Nacl 5g，瓊脂 20g，水 1000ml；pH 7.0-7.2；高溫濕熱滅菌：121℃ 30min。

2 試驗(yàn)方法

2.1 病原菌的分離、純化與鑒定

2.1.1 薏苡彎孢葉斑病菌的分離、純化與鑒定

取帶有病斑的薏苡葉，于病健交界處剪成2mm×5mm的長(zhǎng)方形小塊，在無(wú)菌操作臺(tái)中對(duì)其進(jìn)行表面消毒，先置于75%乙醇中滅菌25s，取出，然后放入到0.1%升汞中滅菌3-5min，取出，再放入到無(wú)菌水中洗滌3次。

將上述經(jīng)滅菌的病組織采用五點(diǎn)法接種于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，倒置于28℃的恒溫箱中培養(yǎng)3-5d，觀察菌體生長(zhǎng)情況，挑取組織邊緣長(zhǎng)出的菌絲，接種到新培養(yǎng)基中，多次重復(fù)挑取、接種，進(jìn)行純化。

根據(jù)左淑珍等對(duì)玉米彎孢菌葉斑病及其抗源鑒定、抗性遺傳研究現(xiàn)狀鑒定此種病菌為薏苡彎孢葉斑病菌（Coix curvularia lunata）[7]。

2.1.2 菜豆灰霉病菌的分離、純化與鑒定

菜豆灰霉病菌的分離采用菌絲直接挑取培養(yǎng)法。將帶病的病果用無(wú)菌水擦洗干凈，在無(wú)菌操作臺(tái)上，用75%乙醇擦拭沒(méi)有菌絲的部分進(jìn)行表面消毒，用消毒過(guò)的鑷子撥開(kāi)表層菌絲，挑取內(nèi)層的菌絲，將其接種于PDA平板培養(yǎng)基上，倒置于28℃恒溫箱中培養(yǎng)，3天后觀察、挑取邊緣菌絲，將其移至新培養(yǎng)基上培養(yǎng)，進(jìn)行純化。

根據(jù)楊素梅等對(duì)菜豆灰霉病的發(fā)生與防治措施的研究鑒定該病菌的病原菌為灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）[8]。

2.2 中藥提取液的制備

將上述中藥材料粉碎，取粉碎的各類藥粉30g，以95%乙醇為溶劑（藥粉：95%乙醇=1：15[3]），采用回流提取法提取4h（提取溫度為85℃），然后將提取液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中進(jìn)行濃縮，再用95%乙醇定容，使溶液的濃度為1g/ml，然后移置廣口瓶中，密封， 保存于4℃冰箱中，備用。

2.3 供試菌種的活化擴(kuò)繁與菌懸液的制備

薏苡彎孢葉斑病菌、菜豆灰霉病菌的活化擴(kuò)繁：將冰箱中純化的病原菌取出，在無(wú)菌操作臺(tái)中分別用滅菌后的接種環(huán)接種于新PDA培養(yǎng)基上，在28℃恒溫箱中培養(yǎng)3-5d，備用。

金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的活化：分別將菌種用接種環(huán)接種于含牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基試管中，37℃恒溫培養(yǎng)24h，備用。

菌懸液的制備：將20ml無(wú)菌水倒入含已活化好的細(xì)菌的試管中，用滅菌的接種環(huán)將菌種挑起，稍加振搖，既得金黃色葡萄球菌、大腸桿菌的菌懸液。

2.4 幾種中藥提取物的抑菌活性測(cè)定

2.4.1 幾種中藥提取物對(duì)病原真菌的抑制作用

采用生長(zhǎng)速率法[9]，測(cè)定各類藥材1g/ml的乙醇提取物對(duì)供試菌種的抑制效果。

在無(wú)菌條件下，取各類藥材提取物1ml分別加入無(wú)菌的直徑9cm培養(yǎng)皿中，對(duì)照組加入等量95%乙醇，再加入10mlPDA培養(yǎng)基，混勻，待其凝固后，得到含藥平板。用直徑0.6cm的打孔器分別制得薏苡彎孢葉斑病菌和菜豆灰霉病菌的菌餅，用挑針將菌餅接種于含藥平板中央，28℃條件下進(jìn)行恒溫培養(yǎng)，每次處理重復(fù)3次。3d后開(kāi)始觀察菌落大小，并采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，連續(xù)測(cè)量4d，并記錄數(shù)據(jù)，計(jì)算抑菌率[9]。

菌落生長(zhǎng)抑制率=（對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對(duì)照菌落直徑-打孔器直徑）×100%

所得結(jié)果通過(guò)spss軟件進(jìn)行方差分析，進(jìn)而采用SNK-q檢驗(yàn)法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2.4.2 幾種中藥提取物對(duì)細(xì)菌的抑制作用

采用濾紙片法[10]，測(cè)定各類藥材1g/ml的乙醇提取物對(duì)供試菌種的抑制效果。

用打孔器將濾紙打成直徑0.8cm的圓片，經(jīng)高壓蒸汽滅菌后，放入盛有各提取物的容器中浸泡1h，對(duì)照組濾紙片用95%乙醇浸泡。向平板中的培養(yǎng)基表面加入0.5ml已配制的金黃色葡萄球菌及大腸桿菌的菌懸液，用三角涂布棒將其均勻涂布，采用五點(diǎn)法將浸泡好的濾紙片放入到平板中，每次處理重復(fù)3次，于37℃條件下恒溫培養(yǎng)24h，然后用十字交叉法測(cè)量抑菌圈直徑。用表示抑菌圈的直徑。

2.5 幾種中藥提取物的最小抑菌濃度測(cè)定

通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)，篩選出丁香和辛夷對(duì)兩種病原真菌、商陸對(duì)菜豆灰霉病菌分別作最小抑菌濃度試驗(yàn)。在無(wú)菌條件下，用95%乙醇將各提取物稀釋成稀釋度為1/2、1/4、1/8、1/16、1/32的溶液，分別精取各濃度溶液1ml與適量PDA培養(yǎng)基混合均勻，制成含藥培養(yǎng)基，冷卻，備用。將打好的病原菌菌餅接種到含藥培養(yǎng)基上，倒置于28℃恒溫箱中培養(yǎng)，每次處理重復(fù)3次，從第3d開(kāi)始觀察，每間隔1d觀察一次，連續(xù)觀察至第7d。得到最小抑菌濃度[9]。

3 結(jié)果與分析

3.1 幾種中藥提取物對(duì)真菌的抑制作用

3.1.1 幾種中藥提取物對(duì)菜豆灰霉病菌的抑制作用

由表3-1可知各類中藥提取物除天南星外都對(duì)病原菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生了抑制作用，其中辛夷、商陸和丁香的提取物對(duì)菜豆灰霉病菌的抑菌率均達(dá)100%，與其他中藥提取物有極顯著性差異；其次是北豆根和蘿藦的提取物，抑菌率達(dá)到76.3%；甘草提取物的抑菌率為69.7%；艾蒿提取物的抑菌率相對(duì)較低，為33.8%；天南星提取物對(duì)菜豆灰霉病菌無(wú)抑制作用。從結(jié)果來(lái)看，辛夷、商陸和丁香的提取物表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌活性，可見(jiàn)，辛夷、商陸和丁香提取物中含有的抑菌活性成分較多。

3.1.2 幾種中藥提取物對(duì)薏苡彎孢葉斑病菌的抑制作用

由表3-2可知各類中藥提取物都對(duì)病原菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生了抑制作用，其中辛夷和丁香的提取物對(duì)薏苡彎孢葉斑病菌的抑制效果最好，抑菌率達(dá)到100%；其次是甘草和商陸的提取物，抑菌率也達(dá)到83%左右；而北豆根、蘿藦和艾蒿提取物的抑菌率也分別達(dá)到了70.8%、65.4%、59.1%；天南星提取物對(duì)薏苡彎孢葉斑病菌的抑制作用不是很明顯，抑菌率為2.5%。從結(jié)果看，辛夷和丁香的提取物中抑菌成分的活性較強(qiáng)，可見(jiàn)，辛夷和丁香中的抑菌活性成分為醇溶性成分。

3.2 幾種中藥提取物對(duì)細(xì)菌的抑制作用

由表3-3可知，幾種中藥提取物對(duì)大腸桿菌的抑制效果整體比對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果好，其中丁香提取物的活性最強(qiáng)，甘草、商陸和蘿藦的提取物的活性較弱；而這些提取物對(duì)金黃色葡萄球菌也有不同程度的抑制效果，甘草和丁香提取物的活性最強(qiáng)，而辛夷和艾蒿提取物對(duì)金黃色葡萄球菌均表現(xiàn)為無(wú)活性。從結(jié)果看，丁香提取物對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均有很強(qiáng)的抑制作用；而甘草提取物只對(duì)金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出很強(qiáng)的活性。

3.3 幾種中藥提取物的最小抑菌濃度

由表3-4可以看出，不同稀釋度的辛夷提取物對(duì)真菌的抑制效果不同，濃度越大，抑制效果越好。實(shí)驗(yàn)得出，辛夷提取物對(duì)菜豆灰霉病菌和薏苡彎孢葉斑病菌的最小抑菌濃度分別為0.125g/ml、1g/ml。

由表3-5可以看出，不同稀釋度的丁香提取物對(duì)菜豆灰霉病菌和薏苡彎孢葉斑病菌的抑制效果基本相同，最小抑菌濃度均為0.0625g/ml。

由表3-6可以看出，不同稀釋度的商陸提取物對(duì)菜豆灰霉病菌的抑制效果也是隨著濃度的降低而減弱。實(shí)驗(yàn)得出，商陸提取物對(duì)菜豆灰霉病菌的最小抑菌濃度為0.5g/ml。

綜上所述，8種中藥提取物除天南星提取物外對(duì)兩種病原菌均有很好的抑制效果。辛夷、商陸和丁香的提取物對(duì)菜豆灰霉病菌抑菌效果最好，達(dá)到了完全抑制的效果；辛夷和丁香提取物對(duì)薏苡彎孢葉斑病菌抑菌效果也是最好，達(dá)到完全抑制的效果。對(duì)于細(xì)菌來(lái)說(shuō)，這幾種中藥提取物除辛夷和艾蒿提取物對(duì)金黃色葡萄球菌沒(méi)有抑菌活性外，其他提取物對(duì)兩種細(xì)菌均有不同程度的抑菌活性?？傮w上來(lái)說(shuō)，這些提取物對(duì)大腸桿菌的抑菌活性要好于對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性，甘草和丁香的提取物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性最強(qiáng)，丁香提取物對(duì)大腸桿菌的抑菌活性也最強(qiáng)，其他提取物對(duì)大腸桿菌也均有不同程度的抑菌活性。

綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，丁香提取物對(duì)4種病原菌均有很強(qiáng)的抑制作用。丁香提取物的主要成分為揮發(fā)油，揮發(fā)油中含量最高的組分是丁香酚，而揮發(fā)油對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌均有明顯的抑菌作用，丁香酚對(duì)不同病原真菌均有較強(qiáng)的抑制和殺滅作用，因此，丁香提取物中主要的抑菌成分應(yīng)為揮發(fā)油中的丁香酚；丁香提取物中抑菌成分并非單一的丁香酚，丁香提取物中所含的脂溶性成分、水溶性成分均對(duì)金黃色葡萄球菌有很強(qiáng)的抑菌作用[11]。這與前人研究的丁香提取物對(duì)不同致病菌均有很強(qiáng)的抑菌作用相吻合。李巧如等[12]通過(guò)研究丁香提取物與各類抗菌素間的相互作用探討其抗菌機(jī)理，推測(cè)丁香提取物的抗菌機(jī)理可能是由于氨基糖苷類競(jìng)爭(zhēng)性地抑制蛋白質(zhì)的合成而產(chǎn)生的。

辛夷提取物對(duì)兩種病原真菌均有很強(qiáng)的抑菌作用。辛夷提取物中生物堿類成分對(duì)致病性的真菌有明顯的抑制作用；高濃度的辛夷提取物對(duì)細(xì)菌有不同程度的抑制作用[13，14]。商陸提取物對(duì)菜豆灰霉病菌有很好的抑制作用。商陸提取物中的總皂甙成分對(duì)真菌菌體的生長(zhǎng)有很好的抑制作用[4]。甘草提取物中主要含有甘草酸、甘草苷、異甘草素等活性成分，對(duì)金黃色葡萄球菌有較強(qiáng)的抑菌活性[15]；甘草中的總黃酮成分對(duì)細(xì)菌的抑菌效果也較為明顯[5]。

本試驗(yàn)分別用8種不同中藥的乙醇提取物對(duì)4種常見(jiàn)致病菌作了抑菌活性研究，從結(jié)果來(lái)看，總體上這些提取物的抑菌效果有明顯差異，但個(gè)別提取物之間的差異不明顯，產(chǎn)生這樣的原因可能是由于提取過(guò)程中的差異造成，或是其他成分同時(shí)也被提取出來(lái)，也有可能是藥材地域性、季節(jié)性的變化而影響其有效成分含量，亦或是致病菌本身的差異，而影響了對(duì)各個(gè)菌種的抑菌效果。本試驗(yàn)只采用了95%乙醇作為提取溶劑提取得到8種中藥的粗提物，沒(méi)有對(duì)其他溶劑進(jìn)行研究，也沒(méi)有對(duì)粗提物進(jìn)一步提取確定其抑菌活性成分為單體成分或幾種成分聯(lián)合作用進(jìn)行研究；真菌在恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)條件下不能產(chǎn)生分生孢子，因而只對(duì)菌絲作了抑菌活性研究，沒(méi)能作對(duì)致病菌分生孢子形成和萌發(fā)的影響試驗(yàn)[9]，導(dǎo)致了本試驗(yàn)的局限性。另外，試驗(yàn)中只針對(duì)室內(nèi)的抑菌活性進(jìn)行了研究，其在田間試驗(yàn)的防治效果如何，對(duì)篩選出抑菌活性強(qiáng)的提取物制成何種劑型能被植物有效吸收，使用后是否能完全降解，還需作進(jìn)一步深入研究。本研究初步篩選出丁香提取物對(duì)不同致病菌均有明顯的抑制作用，為后續(xù)開(kāi)發(fā)植物源農(nóng)藥應(yīng)用于生物防治中提供了理論依據(jù)。