張臘臘，胡浩斌，王宗博，鄭旭東，韓明虎

（1.隴東學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，甘肅慶陽745000；2.慶陽市中凱農(nóng)產(chǎn)品有限責(zé)任公司，甘肅慶陽745000）

超聲-微波協(xié)同提取甘草渣中總黃酮工藝優(yōu)化

張臘臘1，胡浩斌1，王宗博2，鄭旭東1，韓明虎1

（1.隴東學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，甘肅慶陽745000；2.慶陽市中凱農(nóng)產(chǎn)品有限責(zé)任公司，甘肅慶陽745000）

為提高甘草的綜合利用，該研究以甘草渣為原料，采用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲-微波協(xié)同提取甘草渣中總黃酮的提取工藝條件。考察液料比、微波功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時(shí)間對甘草渣中總黃酮提取率的影響，根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果，建立總黃酮提取率的回歸方程，獲得甘草渣中總黃酮的最佳提取工藝條件為：液料比28.4∶1（mL∶g）、微波功率125 W、超聲功率300 W、乙醇體積分?jǐn)?shù)79%、提取時(shí)間32 min。在此條件下，甘草渣中總黃酮的提取率為2.59%。

甘草渣；總黃酮；超聲-微波協(xié)同提??；響應(yīng)面法

甘草在醫(yī)學(xué)藥典中被稱為美草、靈通等，以其根莖入藥可補(bǔ)脾益氣、緩急止疼等[1]，因此被譽(yù)為中藥之王[2]。甘草中主要有效成分是甘草酸和黃酮類化合物[3]。而甘草黃酮由于具有抗氧化、抗腫瘤等藥理功能廣泛應(yīng)用于食品、藥品等領(lǐng)域[4-5]。然而，工業(yè)化生產(chǎn)中只提取甘草中的甘草酸作為主要藥效成分，而富含大量黃酮類化合的甘草渣則作為廢料棄去，造成資源的極大浪費(fèi)。

甘草黃酮的提取方法主要有溶劑提取法、超聲輔助提取法、微波輔助提取法等[6-9]。溶劑提取法由于提取物中雜質(zhì)多、提取時(shí)間長等因素導(dǎo)致提取率很低[10-12]。超聲波提取由于供熱不足導(dǎo)致提取時(shí)間過長，而微波提取又有傳熱、傳質(zhì)不均勻等缺陷，利用超聲-微波協(xié)同提取則可以起到對兩種方法缺陷的互補(bǔ)，從而縮短提取時(shí)間、提高提取效率[13]。響應(yīng)面法由于操作簡便、預(yù)測準(zhǔn)確，在黃酮提取工藝優(yōu)化中應(yīng)用廣泛[14-16]。

本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法對超聲-微波協(xié)同提取甘草渣中總黃酮的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期獲得更為科學(xué)和合理的提取工藝，為甘草黃酮的深入研究及其在食品領(lǐng)域的工業(yè)化生產(chǎn)創(chuàng)造一定條件，同時(shí)還能做到資源的重復(fù)利用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甘草渣：慶陽市中凱農(nóng)產(chǎn)品有限責(zé)任公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度98%）：中國藥品生物制品研究所；氧化鋁、硅膠、乙酸乙酯、石油醚（均為分析純）：西安化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

NJL07-5型實(shí)驗(yàn)室超聲微波爐：南京杰全微波設(shè)備有限公司；7230G型可見分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；SPECORD-50型紫外分光光度儀：德國耶拿公司；RE-5203型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海亞榮生化儀器廠；FZ102型微型植物試樣粉碎機(jī)：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；SHZ-D型循環(huán)水式真空泵：河南省鞏義市英峪儀器一廠；BS110S型電子天平：北京賽多利斯天平有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取105℃干燥至質(zhì)量恒定的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.01 g，加體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇溶液定容至100 mL，配制成質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。精確吸取質(zhì)量濃度為0.1mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5 mL、3.0 mL，置于10 mL試管中，分別加入體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇溶液5.0 mL，再加0.5 mL10%KOH溶液，充分搖勻顯色5 min后，用體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇溶液定容，以不加樣品的溶液為參比液，在波長410 nm處測定其吸光度值。以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度（y）為橫坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=32.336x-0.012 9，R2=0.994 5。樣品中總黃酮質(zhì)量濃度按照蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程進(jìn)行計(jì)算。甘草渣中總黃酮提取率計(jì)算公式如下：

式中：w為總黃酮提取率，%；n為稀釋倍數(shù)；V為提取液體積，mL；X為提取液中總黃酮的質(zhì)量濃度，mg/mL；W為甘草渣質(zhì)量，g。

1.3.2 甘草渣中總黃酮的提取單因素試驗(yàn)

精確稱取一定量的經(jīng)烘干并粉碎過篩（60目）的甘草渣粉，置于250 mL燒杯中，加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液混合后，采用超聲-微波協(xié)同提取2次：微波加熱到一定溫度并保持一定時(shí)間再進(jìn)行超聲波（300 W）輔助提?。ǔ曁崛r(shí)間為總提取時(shí)間的一半），提取一定時(shí)間后，過濾，合并收集濾液，分析其中總黃酮的質(zhì)量濃度，計(jì)算提取率。固定其他條件不變，分別考察液料比（15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1（mL∶g））、微波功率（90W、120W、150W、180W、210W）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（60%、70%、80%、90%、100%）和提取時(shí)間（10 min、20 min、30 min、40 min、50 min）等因素對甘草渣中總黃酮提取率的影響。

1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，固定超聲波功率為300 W，選取微波功率（X1）、提取時(shí)間（X2）、液料比（X3）和乙醇體積分?jǐn)?shù)（X4）為影響因素，總黃酮提取率（Y）為響應(yīng)值，進(jìn)行4因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)分析，試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1Box-Benhnken試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of the Box-Benhnken experiments

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 液料比對甘草渣中總黃酮提取率的影響

考察液料比對甘草渣中總黃酮提取率的影響，結(jié)果如圖1所示。

圖1 液料比對總黃酮提取率的影響Fig.1 Effect of liquid-solid ratio on extraction rate of total flavones

由圖1可知，當(dāng)液料比從15∶1（mL∶g）增加至30∶1（mL∶g）時(shí)，隨著液料比的增大甘草渣中總黃酮的提取率顯著增加，這是因?yàn)殡S著溶劑的增加，固液兩相的接觸面積增大，有利于總黃酮的溶出；當(dāng)液料比為30∶1（mL∶g）時(shí)提取率達(dá)到最大值，為2.45；當(dāng)液料比超過30∶1（mL∶g）時(shí)，黃酮類化合物溶出的速度減慢，總黃酮提取率有所下降。因此選擇最適液料比30∶1（mL∶g）為宜。

2.1.2 提取時(shí)間對甘草渣中總黃酮提取率的影響

考察提取時(shí)間對甘草渣中總黃酮提取率的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 提取時(shí)間對總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of extraction time on extraction rate of total flavones

由圖2可知，隨著提取時(shí)間的延長，總黃酮提取率呈先增加后下降的趨勢，當(dāng)提取時(shí)間＜30 min時(shí)，甘草渣中總黃酮的提取率隨著時(shí)間增大，當(dāng)提取時(shí)間＞30 min后甘草渣中總黃酮的提取率很快下降。這是因?yàn)辄S酮類化合物本身容易被氧化破壞，在超聲波中處理時(shí)間越長，提取率就會(huì)下降。因此選擇提取時(shí)間為30 min為宜。

2.1.3 微波功率對甘草渣中總黃酮提取率的影響

考察微波功率對甘草渣總黃酮提取率的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 微波功率對總黃酮提取率的影響Fig.3 Effect of microwave power on extraction rate of total flavones

由圖3可知，隨著微波功率的增大，總黃酮的提取率先上升后降低。因?yàn)樵谝欢〞r(shí)間內(nèi)，隨著微波功率的增加反應(yīng)溫度也隨之升高，分子的熱運(yùn)動(dòng)加速，有利于總黃酮的溶出，但提取功率進(jìn)一步增加，則會(huì)使溫度過高導(dǎo)致乙醇揮發(fā)，溶劑減少，黃酮溶出量減少。因此選擇提取功率為120 W為宜。

2.1.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對甘草渣中總黃酮提取率的影響

考察乙醇體積分?jǐn)?shù)對甘草渣總黃酮提取率的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮提取率的影響Fig.4 Effect of ethanol content on extraction rate of total flavones

由圖4可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，總黃酮提取率呈先上升后降低的趨勢。這是因?yàn)楦鶕?jù)相似相溶原理，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)，溶劑與溶質(zhì)極性相似，可達(dá)到最大溶出度，因此甘草渣中總黃酮提取率達(dá)到最大，但是隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，產(chǎn)生的滲透壓也越大，其他的醇溶性物質(zhì)、色素的溶出量也會(huì)增加從而導(dǎo)致總黃酮的提取率下降。因此選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)80%為宜。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以總黃酮提取率（Y）為響應(yīng)值，選取微波功率（X1）、提取時(shí)間（X2）、液料比（X3）和乙醇體積分?jǐn)?shù)（X4）為影響因素，進(jìn)行4因素3水平響應(yīng)面試驗(yàn)分析，響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2，回歸模型方差分析見表3。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of response surface experiments

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

采用Design Expert 8.0.6軟件對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合處理和分析，獲得甘草渣總黃酮提取率（Y）對微波功率（X1）、提取時(shí)間（X2）、液料比（X3）和乙醇體積分?jǐn)?shù)（X4）的二次多元回歸方程為：

由表3可知，一次項(xiàng)X1、X2、X3、X4和二次項(xiàng)X12、X22、X32、X42對響應(yīng)值均呈極顯著影響（P＜0.01），X1X4呈顯著影響（P＜0.05），回歸方程模型極顯著（P＜0.000 1），失擬項(xiàng)不顯著（P=0.591 6＞0.05），表明該回歸模型預(yù)測值與實(shí)際值能較好的擬合。回歸系數(shù)R2=0.980 0，表明模型相關(guān)性良好。校正決定系數(shù)Radj2=0.960 1，表明模型能解釋96.01%響應(yīng)值變化，試驗(yàn)誤差較小。因此，該回歸方程模型可以用于甘草渣中總黃酮提取的分析及預(yù)測。

由Design Expert 8.0.6軟件處理得到的各因素互交作用的響應(yīng)面分析結(jié)果見圖5。

由圖5可知，X1（微波功率）與X4（乙醇體積分?jǐn)?shù)）交互作用等高線呈橢圓形，橢圓的軸線與X1和X4坐標(biāo)軸存在一個(gè)角度。當(dāng)X1比較小時(shí)，X4即提取溶劑的極性對甘草渣中總黃酮提取率的影響非常顯著，表現(xiàn)為曲線比較陡，說明在微波功率比較低時(shí)，提高乙醇體積分?jǐn)?shù)能明顯提高甘草渣中總黃酮提取率；而在X4（乙醇體積分?jǐn)?shù)）比較大時(shí)，微波功率對黃酮提取率影響不是很明顯，表現(xiàn)為曲線比較平緩，即乙醇體積分?jǐn)?shù)比較大時(shí)，即使提高微波功率，甘草渣中總黃酮提取率也得不到明顯提高，這兩個(gè)因素之間互相抑制，這與回歸方程中X1X4項(xiàng)系數(shù)為負(fù)相符。這與方差分析交互項(xiàng)X1X4對甘草渣總黃酮提取率影響顯著結(jié)果一致。

圖5 微波功率、提取時(shí)間、液料比和乙醇體積分?jǐn)?shù)交互作用對甘草渣中總黃酮提取率影響的響應(yīng)面及等高線Fig.5 Response surface plots and contour line of interaction impact from microwave power,extraction time,liquid-solid ratio and ethanol content on extraction rate of total flavones in glycyrrhiza residue

經(jīng)響應(yīng)面分析得甘草渣中總黃酮的超聲-微波協(xié)同提取最佳工藝為：液料比28.35∶1（mL∶g）、提取時(shí)間32.32 min、微波功率124.83 W、乙醇體積分?jǐn)?shù)79.24%，在此條件下甘草渣中總黃酮的提取率理論值為2.60%。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

為了檢驗(yàn)試驗(yàn)結(jié)果與真實(shí)情況的一致性，根據(jù)響應(yīng)面設(shè)計(jì)法優(yōu)化的結(jié)果，將最佳提取條件預(yù)測值修正為液料比28.4∶1（mL∶g）、提取時(shí)間32 min、微波功率125 W、乙醇體積分?jǐn)?shù)79%。在修正后的最佳提取條件下，進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，實(shí)際測定的甘草渣中總黃酮的平均提取率為2.59%，與理論值（2.60%）相差不大。說明響應(yīng)面優(yōu)化的甘草渣中總黃酮提取工藝條件是準(zhǔn)確可靠的。

3 結(jié)論

本研究采用超聲-微波協(xié)同提取甘草渣中總黃酮，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，經(jīng)回歸分析并結(jié)合實(shí)際操作確定最佳提取工藝為：液料比28.4∶1（mL∶g）、提取時(shí)間32min、超聲功率300W、微波功率125W、乙醇體積分?jǐn)?shù)79%。在此工藝條件下，甘草渣中總黃酮的提取率為2.59%。通過超聲波振蕩和微波熱效應(yīng)的結(jié)合，縮短了提取時(shí)間，提高了甘草渣中總黃酮提取率，對甘草的綜合利用和資源的循環(huán)利用都具有一定的理論指導(dǎo)意義。

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Optimization of extraction technology of total flavones from glycyrrhiza residue by microwave-ultrasound assisted method

ZHANG Lala1,HU Haobin1,WANG Zongbo2,ZHENG Xudong1,HAN Minghu1
(1.College of Chemistry and Chemical Engineering,Longdong University,Qingyang 745000,China; 2.Qingyang Zhongkai Agricultural Products Limited Liability Company,Qingyang 745000,China)

In order to improve the comprehensive utilization of glycyrrhiza,using glycyrrhiza residue as raw material,the microwave-ultrasound assisted extraction process conditions of total flavones from glycyrrhiza residue were optimized by response surface method.The effects of liquidsolid ratio,microwave power,ethanol content and extraction time on total flavones extraction rate in glycyrrhiza residue were investigated.According to the response surface experiments results,the regression equation of total flavones extraction rate was established.The optimum extraction conditions of total flavones in glycyrrhiza residue were liquid-solid ratio 28.4∶1(ml∶g),microwave power 125 W,ultrasonic power 300 W,ethanol content 79%and extraction time 32 min.Under the conditions,the extraction rate of total flavones in glycyrrhiza residue was 2.59%.

glycyrrhiza residue;total flavones;microwave-ultrasound assisted extraction method;response surface methodology

TS209

0254-5071（2017）04-0163-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.04.034

2016-12-28

甘肅省科技支撐項(xiàng)目（1604NKCM082）；甘肅省應(yīng)用化學(xué)省級重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目（GSACK20130113）

張臘臘（1986-），女，講師，碩士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物提取加工。