梁紅敏，高德艷，胡文效*

（山東省葡萄研究院，山東濟南250100）

葡萄籽低聚原花青素體外抗氧化活性研究

梁紅敏，高德艷，胡文效*

（山東省葡萄研究院，山東濟南250100）

以實驗室分離純化得到的葡萄籽低聚原花青素為研究對象，水溶性維生素E和維生素C為對照，分別考察葡萄籽低聚原花青素對DPPH自由基、ABTS自由基、超氧陰離子自由基（O2-·）的清除能力以及鐵離子還原能力（FRAP）。結(jié)果表明，葡萄籽低聚原花青素對DPPH自由基、ABTS自由基以及超氧陰離子自由基具有較高的清除能力，IC50值分別為23.52 μg/mL、51.38 μg/mL和684.46 μg/mL，具有較高的還原能力，且均優(yōu)于對照水溶性維生素E。與維生素C相比，原花青素對ABTS自由基的清除能力以及還原能力均優(yōu)于維生素C，兩者DPPH自由基的清除能力相當，原花青素和水溶性維生素E在極低質(zhì)量濃度（0.05～1.00 μg/mL）范圍內(nèi)，對超氧自由基具有清除能力，清除率為30%～40%，隨著質(zhì)量濃度的增加，維生素C的超氧陰離子自由基清除能力優(yōu)于葡萄籽低聚原花青素。

葡萄籽低聚原花青素；還原力；自由基；抗氧化活性

近年來，國內(nèi)以葡萄籽原花青素為原料的保健食品和膳食營養(yǎng)補充劑越來越多，但是由于還沒有相應(yīng)的國家和行業(yè)標準，各原料生產(chǎn)企業(yè)按照各自的企業(yè)標準生產(chǎn)，導致了現(xiàn)在市場上原料和產(chǎn)品質(zhì)量的差異，而原花青素的生產(chǎn)應(yīng)該以較高活性的組分為主，以提高產(chǎn)品質(zhì)量，擴大其應(yīng)用范圍。

葡萄籽提取物中原花青素含量達95%[1]。原花青素具有較強的抗氧化作用和清除自由基的能力[2-3]，其活性受結(jié)構(gòu)特別是聚合度的影響，不同聚合度原花青素的抗氧化活性不同，大量研究證實，隨著原花青素聚合度的增加，其抗氧化活性和對羥自由基和超氧陰離子自由基清除能力逐漸降低[4-7]，低聚原花青素（oligomeric proanthocyanidins，OPC）具有更強的抗氧化活性[8-10]。

目前有關(guān)原花青素的抗氧化活性研究較多，抗氧化能力大小表示方法各異[11]。水溶性維生素E在國外常被用作測算抗氧化能力的標準物質(zhì)，維生素C（vitamine C，VC）具有較強的抗氧化活性，本研究通過建立體外抗氧化模型，采用不同抗氧化活性測定方法探討低聚原花青素的體外抗氧化活性，并與Trolox和VC進行對比，以期為葡萄籽低聚原花青素的開發(fā)應(yīng)用提高理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

葡萄籽（公釀一號）：山東日照。

1,1-二苯-1-苦基苯肼（1,1-dipheny1-2-picryhydrazyl，DPPH）自由基、2,2-氨基-二（3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸）（2,2-azino-bis-（3-ethylbmzothiazoline-sulfonic，ABTS）自由基、Fe3+-三吡啶三吖嗪（tripyridyltriazine，TPTZ）、6-羥基-2, 5,7,8-四甲基苯并二氫吡喃-2-羧酸（6-hydroxy-2,5,7,8-tetram-ethylchroman-2-carboxylicacid，Trolox），水溶性維生素E（均為分析純）：美國Sigma公司；維生素C、鄰菲啰啉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、三氯化鐵、無水乙醇、濃鹽酸、冰醋酸、焦性沒食子酸等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

EL204型電子天平：梅特勒-托利多儀器上海有限公司；UV5200紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；DGG-9140B型電熱恒溫鼓風干燥箱：上海森信儀器有限公司；HH-S4型電熱恒溫水浴鍋：廣東環(huán)凱儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄籽低聚原花青素的提取分離

稱取一定量干燥的葡萄籽，粉碎至60目過篩，采用乙醇進行提取，提取條件為料液比1∶8（g∶mL），乙醇體積分數(shù)70%，提取溫度70℃，提取時間為2 h，提取3次。采用HPD100大孔樹脂作為原花青素的純化樹脂，原花青素含量為8.0 mg/mL的提取液進行吸附，吸附流速為3 BV/h，蒸餾水以2 BV/h流速逆向沖洗樹脂柱，以去除樹脂間隙中未吸附的原花青素及雜質(zhì)組分，沖洗至流出液檢測不到原花青素為止，吸附完畢后分別采用體積分數(shù)10%、20%、30%、40%、45%的乙醇溶液進行洗脫，隨著乙醇體積分數(shù)的增加，洗脫液中原花青素的聚合度不斷增加，低聚合度組分優(yōu)先洗脫，當乙醇體積分數(shù)增加至45%左右時，洗脫液中原花青素聚合度＞5。將聚合度＜5的組分進行合并，低溫濃縮、干燥得高純度低聚體原花青素。

1.3.2 清除DPPH自由基法測定抗氧化能力

參考ESPíN J C等[12]的方法，用無水乙醇溶解DPPH自由基，配制成濃度為1×10-4mmol/L的DPPH溶液。取不同質(zhì)量濃度（10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/mL、50μg/mL、60 μg/mL、70 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL）的葡萄籽低聚原花青素0.5mL分別加入3.5mLDPPH乙醇溶液中，避光反應(yīng)2 h，以乙醇溶劑作空白對照，測量其在波長517 nm處的吸光度值（Ai）。取0.5 mL無水乙醇與3.5 mL DPPH反應(yīng)，避光反應(yīng)2 h，波長517 nm處測吸光度值（A0），按照下列公式計算自由基清除率。以Trolox和VC為對照，分別用無水乙醇和純水配制成上述不同濃度的溶液進行測定。

1.3.3 清除ABTS自由基法測定抗氧化能力

ABTS反應(yīng)儲備液的配制參考MARFIL R等[13]的方法。使用時用無水乙醇將其稀釋至吸光度值為0.7±0.02，取不同質(zhì)量濃度（10 μg/mL、20 μg/mL、30 μg/mL、40 μg/mL、50 μg/mL、60 μg/mL、70 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL）的葡萄籽低聚原花青素200 μL分別加入6.0 mL ABTS工作液中，避光反應(yīng)30 min，以乙醇溶劑作空白對照，測量其在波長734 nm處的吸光度值（Ai）。取200 μL無水乙醇與6.0 mL ABTS反應(yīng)，避光反應(yīng)30 min，波長734 nm處測吸光度值（A0），按照下列公式計算自由基清除率。以Trolox和VC為對照，分別用無水乙醇和純水配制成上述不同濃度的溶液進行測定。

1.3.4 鐵離子還原能力法測定抗氧化能力

參考SZYD?OWSKA-CZERNIAK A等[14]的方法，取不同質(zhì)量濃度（10 μg/mL、20 μg/mL、30 μg/mL、40 μg/mL、50 μg/mL、60 μg/mL、70 μg/mL、80 μg/mL、100 μg/mL）的葡萄籽低聚原花青素200μL，分別加入4.0 mLTPTZ工作液（由0.1 mol/L醋酸鹽緩沖液25 mL，10 mmol/L TPTZ溶液2.5 mL，20 mmol/L FeCl3溶液2.5 mL組成）?；靹蚝?7℃反應(yīng)10 min，波長593 nm處測定吸光度值。分別用無水乙醇和純水配制成上述不同濃度的溶液進行測定。

1.3.5 清除超氧陰離子自由基法測定抗氧化能力

參考郭雪峰等[15]的方法，采用鄰苯三酚自氧化法測定。Tris-HCl緩沖液（50 mmol/L，pH值8.2，（4.5 mL）與純水（3.3 mL）混合，25℃孵育20 min，快速加入不同質(zhì)量濃度的葡萄籽低聚原花青素0.9 mL，0.3 mL鄰苯三酚溶液（3 mmol/L，用10 mmol/L鹽酸配制，經(jīng)25℃預熱），混勻后記錄5 min內(nèi)反應(yīng)溶液在波長320 nm處的吸光度變化，繪制時間（t）-吸光度值（A）曲線，在線性范圍內(nèi)計算反應(yīng)物單位時間內(nèi)吸光度值的改變，得出受試物作用下鄰苯三酚的自氧化速率。以Trolox和VC為對照，分別用無水乙醇和純水配制成上述不同濃度的溶液進行測定。

式中：V0為鄰苯三酚的自氧化速率，ΔA320nm/min；V1為受試物作用下鄰苯三酚的自氧化速率，ΔA320nm/min。

2 結(jié)果與分析

2.1 清除DPPH自由基的能力

圖1 不同質(zhì)量濃度葡萄籽低聚原花青素對DPPH自由基清除率的影響Fig.1 Effect of different concentration of oligomeric procyanidins on DPPH free radical scavenging capacity

由圖1可知，在不同質(zhì)量濃度（10～100 μg/mL）范圍內(nèi)，低聚原花青素對DPPH自由由基具有清除作用，隨著原花青素質(zhì)量濃度的增加，DPPH自由基的清除能力逐漸增強，在質(zhì)量濃度（10～50 μg/mL）的范圍內(nèi)，原花青素不同質(zhì)量濃度與清除率呈線性關(guān)系，線性方程為y= 1.5932x+12.529，R2=0.992，線性關(guān)系較好，計算低聚原花青素對DPPH自由基的半數(shù)清除率IC50值為（23.52 μg/mL）。當質(zhì)量濃度為50 μg/mL時，對DPPH自由基的清除率達到90%以上，具有很好的清除DPPH自由基的活性。與Trolox和VC相比，三者對DPPH自由基的清除作用相近，在低濃度范圍內(nèi)（10～30 μg/mL），葡萄籽低聚原花青素比Trolox和VC的DPPH清除作用強。

2.2 清除ABTS自由基的能力

圖2 不同質(zhì)量濃度低聚原花青素對ABTS自由基清除率的影響Fig.2 Effect of different concentration of oligomeric procyanidins on ABTS free radical scavenging capacity

由圖2可知，在不同質(zhì)量濃度（10～100 μg/mL）范圍內(nèi)，低聚原花青素對ABTS自由由基具有清除作用，隨著原花青素質(zhì)量濃度的增加，清除能力逐漸增強，在質(zhì)量濃度（10～80 μg/mL）的范圍內(nèi)，原花青素不同濃度與清除率呈線性關(guān)系，線性方程為y=0.811 9x+8.284 1，R2=0.993 5，計算原花青素對ABTS自由基的半數(shù)清除率IC50值為（51.38 μg/mL），當質(zhì)量濃度為100 μg/mL時，清除率達到75%以上，具有很好的清除ABTS自由基的活性。與Trolox和VC相比，低聚原花青素對ABTS自由基的清除作用最強，其次是Trolox，VC的清除作用最弱。

2.3 鐵離子還原能力測定

圖3 不同質(zhì)量濃度低聚原花青素的還原力Fig.3 Reduction capacity of different concentration of oligomeric procyanidins

由圖3可知，在不同質(zhì)量濃度（10～100 μg/mL）范圍內(nèi)，低聚原花青素具有還原力，隨著原花青素質(zhì)量濃度的增加，還原能力逐漸增強，原花青素不同濃度與吸光度值呈線性關(guān)系，線性方程為y=0.010 3x+0.070 2，R2=0.998 3，線性關(guān)系較好。與Trolox和VC相比，低聚原花青素的還原能力最強，其次是VC，Trolox的還原能力最弱。

2.4 清除超氧陰離子自由基的能力

圖4 不同質(zhì)量濃度低聚原花青素對超氧陰離子自由基清除率的影響Fig.4 Effect of different concentration of oligomeric procyanidins on superoxide anion free radical scavenging capacity

由圖4可知，在低質(zhì)量濃度（0.05～1.00 μg/mL）范圍內(nèi)，低聚原花青素與Trolox對超氧陰離子自由基具有清除作用，隨著質(zhì)量濃度的增加，清除能力也逐漸增強但是變化不大，清除率為30%～40%，且原花青素的清除能力強于Trolox，在此濃度范圍內(nèi)VC的清除能力很弱，幾乎沒有清除能力；在質(zhì)量濃度5～100 μg/mL范圍內(nèi)，低聚原花青素與Trolox對超氧陰離子自由基的清除能力隨質(zhì)量濃度的增加逐漸增強但是變化不大，而VC的清除能力隨質(zhì)量濃度的增加逐漸增強，在質(zhì)量濃度為50 μg/mL時，清除率達到87%；在質(zhì)量濃度（500～7 000 μg/mL）范圍內(nèi)，低聚原花青素與Trolox對超氧陰離子自由基的清除能力隨質(zhì)量濃度的增加逐漸增強且變化較大，而VC的清除能力為100%；低聚原花青素在質(zhì)量濃度＞4 000 μg/mL時，使用乙醇溶解時，不能完全溶解，因此對于低聚原花青素，其質(zhì)量濃度最高選擇4 000 μg/mL，在500～4 000 μg/mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，原花青素不同質(zhì)量濃度與清除率呈線性關(guān)系，線性方程為y=0.0065x+45.551，R2=0.9843，線性關(guān)系較好，計算原花青素對超氧陰離子自由基的半數(shù)清除率IC50值為684.46 μg/mL。

3 結(jié)論

本實驗采用多種體外抗氧化能力測定方法，以Trolox、VC為陽性對照評價葡萄籽低聚原花青素的抗氧化活性。結(jié)果表明，葡萄籽低聚原花青素對DPPH自由基、ABTS自由基以及超氧陰離子自由基具有較高的清除能力，IC50值分別為23.52 μg/mL、51.38 μg/mL和684.46 μg/mL，具有較高的還原能力，且均優(yōu)于對照Trolox。與VC相比，原花青素對ABTS自由基清除能力以及還原能力優(yōu)于VC，兩者DPPH自由基的清除能力相當，原花青素和Trolox在低濃度（0.05～1.00 μg/mL）范圍內(nèi)，對超氧陰離子自由基具有清除能力，清除率為30%～40%，隨著質(zhì)量濃度的增加，VC的超氧自由基清除能力優(yōu)于葡萄籽低聚原花青素。

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In vitroantioxidant capacity of grape seed oligomeric procyanidins

LIANG Hongmin,GAO Deyan,HU Wenxiao*
(Shandong Academy of Grape,Jinan 250100,China)

Using grape seed oligomeric procyanidins isolated and purified from laboratory as research object,vitamin E and vitamin C as control,the effect of grape seed oligomeric proanthocyanidins on the scavenging capacity of DPPH free radical,ABTS free radical,superoxide anion free radical and ferric ion reducing antioxidant power(FRAP)was investigated.The results showed that grape seed oligomeric procyanidins had higher scavenging capacity against DPPH free radical,ABTS free radical and superoxide anion radical,with IC50value of 23.52 μg/ml,51.38 μg/ml and 684.46 μg/ml, respectively,and they were all higher than vitamin E.Comparing with vitamin C,the scavenging capacity of ABTS free radical and reducing power of procyanidins was better than that of vitamin C,and the scavenging capacity of DPPH free radical were equivalent.At very low concentration (0.05-1.00 μg/ml),procyanidins and vitamin E had scavenging ability against superoxide anion radicals,and the scavenging rate was 30%-40%. With the increase of concentration,the scavenging capacity of vitamin C against superoxide anion free radical was better than that of grape seed oligomeric procyanidins.

grape seed oligomeric procyanidins;reducing power;free radical;antioxidant capacity

R285.3

0254-5071（2017）04-0149-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.04.031

2017-01-18

山東省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程（CXGC2016D01）

梁紅敏（1987-），女，助理工程師，碩士，研究方向為生物活性成分活性評價、分離與應(yīng)用開發(fā)。

*通訊作者：胡文效（1964-），男，研究員，本科，研究方向為生物化工專業(yè)生物分離。